Artigo de método

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

1.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/70512

⸱

13 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research: Hubrecht Institute, 2Oncode Institute, 3Royal Netherlands Academy of Arts and Science (KNAW), 4University Medical Center Utrecht

Neste artigo

Resumo

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Resumo

A tecnologia organoide oferece uma plataforma experimental in vitro para estudar a fisiologia humana na saúde e na doença. Comparados a outros sistemas in vitro , como linhagens celulares derivadas de câncer ou explantas, organoides derivados de células-tronco teciduais (TSC) oferecem vantagens importantes: podem ser expandidos indefinidamente mantendo a estabilidade genômica e são suscetíveis à modificação CRISPR. Como esses organoides são gerados a partir de TSCs normais, eles contêm os tipos celulares de seu tecido de origem. Isso torna os organoides particularmente valiosos para investigar as interações entre bactérias e células humanas diferenciadas e não tumorais. Organoides intestinais são cultivados como monocamadas polarizadas bidimensionais em inserções de cultura celular revestidas com Extrato de Membrana Basal (BME) ou invasina, uma alternativa livre de animais e econômica, podendo ser diferenciados em principais tipos celulares epiteliais intestinais para infecção por E. coli patogênico-invasivo aderente. As principais leituras de infecção incluem monitoramento da expressão gênica epitelial por PCR quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR), visualização das interações bactéria-epitélio por microscopia confocal e quantificação da ruptura da barreira epitelial. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar outros órgãos e espécies bacterianas, fornecendo uma plataforma versátil para investigar as interações hospedeiro-microrganismo em organoides.

Introdução

O epitélio intestinal forma a primeira linha de defesa contra bactérias patogênicas presentes no lúmen intestinal. Modelos in vitro do epitélio intestinal têm sido amplamente utilizados para estudar como as bactérias interagem com as células epiteliais, como essas células respondem à infecção e como as bactérias rompem a barreiraepitelial 1. Esses modelos são particularmente valiosos para investigar patógenos específicos de humanos em um ambiente controlado e reducionista. Historicamente, a biologia da infecção in vitro baseou-se em linhagens celulares derivadas de tumores, por exemplo, células Caco-2, ou em explantas derivadas do paciente mantidas ex vivo 2,3. Mais recentemente, organoides intestinais gerados a partir de células-tronco de tecidos humanos emergiram como uma ferramenta poderosa que combina as vantagens de ambas as abordagens: assim como as linhagens celulares, organoides podem ser travessados, expandidos, criopreservados, descongelados e geneticamente manipulados; e, assim como os explants, eles derivam de células-tronco não tumorais capazes de se diferenciar em todos os principais tipos celularesepiteliais 4,5.

Quando incorporados em uma matriz como Matrigel ou Extrato de Membrana Basal (BME), os organoides intestinais humanos normalmente se autoorganizam em estruturas esféricas e polarizadas, com a superfície apical voltada para dentro e a superfície basal voltada para fora. Como a maioria dos patógenos intestinais acessa células epiteliais pelo lado apical, várias estratégias foram desenvolvidas para expor essa superfície às bactérias nosorganoides 4. Uma abordagem é microinjetar bactérias diretamente no lúmenorganoide 6. Outro envolve reverter a polaridade dos organoides liberando-os da matriz extracelular, produzindo organoides "apical-out" emsuspensão 7. Uma terceira estratégia é dissociar organoides em células individuais e semeá-las em inserções de cultura celular para formar monocamadas polarizadas bidimensionais (folhas organoides 2D) com o lado apical voltado para o compartimentosuperior 8. Os dois primeiros métodos têm limitações importantes: a microinjeção é demorada e trabalhosa, limitando o fluxo, e organoides apical-out sobrevivem apenas alguns dias sem suporte de matriz e não podem serdiferenciados 1. Em contraste, as folhas organoides 2D suportam experimentação de alta capacidade (as bactérias podem simplesmente ser adicionadas ao compartimento superior) e podem ser mantidas por várias semanas enquanto se diferenciam em principais tipos de células epiteliaisintestinais 9.

Ao contrário das linhagens celulares imortalizadas que se fixam facilmente a superfícies plásticas, as células derivadas de organoides requerem revestimento de placas para aderência eficiente. O revestimento pode ser realizado usando BME10 diluído, ou alternativamente usando invasina, uma proteína bacteriana que se liga às integrinas nas célulasorganoides 11. A invasina é fácil de produzir em laboratório, é substancialmente mais econômica do que a BME ou a Matrigel, e totalmente livre de animais.

Este protocolo descreve o estabelecimento e diferenciação de organoides intestinais como monocamadas polarizadas bidimensionais em inserções de cultura celular revestidas com invasina ou Extrato de Membrana Basal (BME). As folhas organoides diferenciadas são subsequentemente infectadas com Escherichia coli (AIEC), uma cepa patogênica associada à doença inflamatória intestinal12. Múltiplos indicadores de infecção a jusante são delineados para avaliar as respostas epiteliais e a translocação bacteriana. Considerando que a AIEC invade células epiteliais e rompe o epitélio intestinal — um mecanismo que se acredita contribuir para sua patogenicidade — a ruptura epitelial é quantificada medindo bactérias que alcançam a câmara basolateral do inserto de cultura celular após confirmação da integridade da barreira por medição de resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TEER) 13. Também são oferecidos procedimentos para fixação e imagem de monocamadas infectadas para visualizar AIEC intracelular e extracelular, bem como para extração de RNA e avaliar respostas transcricionais epiteliais à infecção. O protocolo completo pode ser realizado em menos de duas semanas e requer apenas equipamentos laboratoriais comumente disponíveis, incluindo um gabinete BSL-2, um microscópio confocal e um instrumento de PCR quantitativa.

No geral, esse protocolo oferece um método econômico, versátil e acessível para estudar infecção bacteriana do epitélio intestinal humano diferenciado in vitro. Ele pode ser facilmente adaptado a outros sistemas organoides e outras espécies microbianas, tornando-se um modelo útil para estudos de biologia de infecção in vitro .

Protocolo

Os organoides intestinais humanos foram gerados a partir do material residual de pacientes submetidos a cirurgia de câncer colorretal no Centro Médico Universitário de Utrecht (UMCU). Os pacientes forneceram consentimento informado para a geração de seus organoides, de acordo com o protocolo UPORT Cancer Biobank 21-042, aprovado pelo comitê local de ética para biobanca. A Figura 1A ilustra as 8 seções do protocolo . Os detalhes do reagente e dos equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Revestimento do inserto de cultura celular

  1. Revestimento com invasina
    1. Realize todos os procedimentos dentro de um capuz de cultura de tecidos em condições estéreis.
    2. Prepare uma solução de 5 μg/mL de invasina em soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS).
    3. Adicione 100 μL dessa solução ao compartimento superior de cada inserto de cultura celular de poliéster de 3 μm colocado em uma placa de 24 poços.
    4. Certifique-se de que a membrana esteja completamente coberta.
    5. Incube durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Evite gerar bolhas durante a dispensação, pois elas impedem o revestimento uniforme.
  2. Revestimento com Extrato de Membrana do Embasamento (Alternativa)
    1. Descongelar Extrato de membrana do Porão no gelo.
    2. Prepare uma solução de 10% em DMEM gelado.
      NOTA: Mantenha a solução fria para evitar polimerização prematura.
    3. Adicione 100 μL da solução diluída ao compartimento superior de cada inserto de cultura celular de poro de 3 μm.
    4. Garanta cobertura completa da superfície da membrana.
    5. Incube por 1 h em temperatura ambiente.

2. Semeadura de células organoides

  1. Preparação de organoides
    1. Remover o meio de cultura das placas organoides mantidas em condições de expansão (3-5 dias após a divisão).
    2. Resuspenda organoides em 1 mL de DMEM14 gelado.
    3. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL contendo 4 mL de DMEM gelado.
      NOTA: Use aproximadamente 1 poço cheio de uma placa de 12 poços para semear 4 inserções de cultura celular.
  2. Organoides de pelletagem
    1. Centrifuge por 5 minutos a 500 × g a 4 °C.
    2. Remova completamente o sobrenadante.
  3. Organoides dissociantes
    1. Resuspenda o pellet em 3 mL de substituto recombinante da tripsina.
    2. Pipete para cima e para baixo usando uma pipeta P1000 para perturbar mecanicamente os organoides.
    3. Incube a 37 °C por 15-20 minutos até obter células individuais ou pequenos aglomerados (3-4 células).
      NOTA: Não exceda 20 minutos de incubação. Pipete a cada 5 minutos para facilitar a dissociação. Insira uma ponta P10 dentro de uma ponta P1000 se for necessária mais força mecânica.
  4. Lavagem das células
    1. Adicione 5 mL de DMEM gelado.
    2. Centrifuge por 5 minutos a 500 × g a 4 °C.
    3. Remova o sobrenadante.
  5. Preparar a Suspensão da Célula
    1. Ressuspender células em meio de expansão (100 μL por inserto de cultura celular; veja a Tabela 1 para a composição do meio de expansão).
      NOTA: Não inclua antibióticos. Inclua inibidor de Rho quinase para prevenir anoikis.
    2. Conte células usando um contador celular ou hemocitômetro.
    3. Ajuste para aproximadamente 2 × 106 células/mL.
  6. Semeadura dos insertos de cultura celular
    1. Remova a solução de revestimento das inserções.
    2. Adicione 100 μL de suspensão de células (2 × 105 células) ao compartimento superior.
    3. Adicione 500 μL de meio de expansão ao compartimento inferior.

3. Cultura celular inserida e diferenciação

  1. Incubar a 37 °C com 5% deCO2 até atingir a confluência (aproximadamente 3 dias).
    NOTA: Atualize o meio em ambos os compartimentos a cada 4-5 dias, se necessário.
  2. Uma vez em confluente, lave ambos os compartimentos com DMEM pré-aquecido.
  3. Adicione meio de diferenciação de 500 μL (Tabela 2) ao compartimento inferior.
  4. Adicione 100 μL de DMEM/F12 Avançado complementado com HEPES e Glutamax (AdvDMEM++) (Tabela 3) ao compartimento superior.
  5. Incube por 5 dias a 37 °C com 5% de CO2.
  6. Troque a mídia em ambos os compartimentos a cada 2 dias.

4. Medição da resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TEER)

  1. Esterilize os eletrodos TEER em etanol a 70% por 15 minutos.
  2. Enxágue os eletrodos em PBS estéril.
  3. Insira o eletrodo curto no compartimento superior e o eletrodo longo no compartimento inferior.
    NOTA: Não toque na monocamada com a ponta do eletrodo.
  4. Registrar valores de resistência.
  5. Meça a resistência de blank usando um inserto sem célula contendo PBS (100 μL superior, 500 μL inferior).
  6. Calcule TEER: TEER = (R_cell inserto de cultura − R_blank) × área de superfície (cm²)
    NOTA: Para inserções de 24 poços, área de superfície = 0,33 cm².

5. Infecção por AIEC

  1. Prepare a Cultura Bacteriana
    1. Inocular AIEC fluorescenteem meio 15 de 3 mL LB.
    2. Incube durante a noite a 37 °C com tremores.
      ATENÇÃO: Realize todos os procedimentos bacterianos em um capuz BSL-2.
  2. Prepare Inoculum
    1. Centrifuge a cultura de 500 μL por 5 min a 1500 × g.
    2. Resuspenda em 1 mL AdvDMEM++.
    3. Meça a densidade óptica (OD).
    4. Diluir para aproximadamente 1 × 10⁸ CFU/mL em AdvDMEM++.
      NOTA: OD = 1 corresponde aproximadamente a 1 × 10⁹ CFU/mL.
  3. Infectando as monocamadas
    1. Substitua a mídia em ambos os compartimentos.
    2. Adicione um meio de diferenciação de 500 μL ao compartimento inferior.
    3. Adicione 100 μL de suspensão bacteriana no compartimento superior para a condição infectada.
    4. Adicione 100 μL de AdvDMEM++ ao compartimento superior para a condição não infectada.
    5. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂.

6. Avaliação da ruptura do epitélio

  1. Às 2,5 h após a infecção, colete 100 μL do compartimento inferior.
  2. Dilua em PBS e prepare em LB agar.
  3. Adicione 100 μL de meio de diferenciação novo ao compartimento inferior.
  4. Incube as placas durante a noite a 37 °C.
  5. Amostragem repetida às 5 horas após a infecção.
  6. Contar a Unidade de Formação de Colônias (CFU) no dia seguinte.
  7. Calcule CFUs por inserção de cultura celular: CFUs/inserto de cultura celular = colônias × fator de diluição × 5

7. Infecção por Imagem

  1. Às 5 horas após a infecção, remova o substrato e fixe com paraformaldeído a 4%.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e volátil. Controle a alça dentro de uma exaustão enquanto usa luvas.
  2. Corrige por 30 minutos.
  3. Lave três vezes com PBS.
  4. Retire o inserto de membrana e coloque as células voltadas para cima em uma placa de poço.
  5. Tinga com faloidina fluorescente por 1-2 horas.
  6. Lave três vezes com PBS.
  7. Tinga núcleos com DAPI por 10 minutos.
  8. Lave três vezes com PBS.
  9. Monte em um ferrolho de vidro com meio de montagem e aplique um coverslip.
  10. Vede com esmalte.
  11. Adquira imagens confocais de DAPI, actina e canais bacterianos.
  12. Adquira um empilhamento z que abrange superfícies basais a apicais com intervalos de 1 μm.
  13. Imagens abertas em Fiji.
  14. Selecione a imagem → Z projeto → intensidade média.
  15. Selecione pilhas → imagens → vistas ortogonais para visualizar seções transversais.

8. Análise da resposta epitelial

  1. Às 5 horas após a infecção, remova a mídia.
  2. Adicione um buffer de lise de 350 μL ao compartimento superior.
  3. Pipete para lisar células e transferir para um tubo sem RNase sobre gelo.
  4. Realize a extração de RNA conforme as instruções do kit.
  5. Meça a concentração de RNA e normalize as amostras.
  6. Realize a transcrição reversa.
  7. Realize PCR quantitativa seguindo as instruções do fabricante (as sequências de primer para TNFα e o gene de referência β-actina são fornecidas na Tabela 4).

Resultados

Após alcançar a confluência, as células intestinais no inserto de cultura celular apresentaram um padrão semelhante a um mosaico (Figura 1B), sem lacunas visíveis na monocamada. Após a diferenciação, a tensão epitelial foi avaliada medindo a resistência elétrica transepitelial (TEER) (Figura 1C). Valores TEER acima de 500 Ω·cm² foram consistentes com a formação de uma monocamada epitelial compacta¹⁶.

A quantidade de AIEC detectada no compartimento basolateral aumentou ao longo do tempo, refletindo a ruptura bacteriana da barreira epitelial (Figura 2A,B). A ausência de AIEC no compartimento inferior indicaria falha na translocação bacteriana.

O fluxo de trabalho para visualizar a infecção é resumido na Figura 3A. A imagem confocal demonstrou a formação de uma monocamada polarizada, com núcleos localizados basalmente e um enriquecimento apical da rede de actina (Figura 3B). Uma ampliação maior revelou tanto a AIEC intracelular quanto bactérias extracelulares ligadas à membrana apical (Figura 3C).

A análise RT-qPCR mostrou regulação positiva da expressão de TNFα em resposta à infecção por AIEC (Figuras 4A,B), confirmando a ativação de uma resposta inflamatória epitelial.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral do protocolo. (A) Esquemas do protocolo. (B) Imagem de campo claro de células organoides intestinais cultivadas e diferenciadas em um inserto de cultura celular revestida por invasina. Barra de escama: 50 μm. (C) Resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TEER) de organoides intestinais cultivados e diferenciados em inserções de cultura celular revestidas por invasina. Cada ponto mostra um experimento independente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Avaliação da ruptura do epitélio (A) Esquemas do protocolo. (B) Quantificação das Unidades Formadoras de Colônias (CFUs) do AIEC ao longo do tempo no compartimento inferior do inserto de cultura celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Imagem da infecção. (A) Esquemas do protocolo. (B) Imagem confocal de organoides intestinais infectados com AIEC fluorescente por 5 horas. Cinza: DAPI. Magenta: faloidina. Cyan: AIEC. Barra de escala: 50 μm. Vistas ortogonais da imagem fundida são exibidas no topo e à direita. (C) Alta ampliação do quadrado branco em B. Cinza: DAPI. Magenta: faloidina. Cyan: AIEC. Barra de escala: 10 μm. Vistas ortogonais são exibidas à direita. O AIEC intracelular (*) e o AIEC extracelular ligados à membrana apical das células epiteliais ($) são destacados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Análise da resposta epitelial. (A) Esquemas do protocolo. (B) Expressão de TNFα por organoides intestinais após 5 horas de infecção com AIEC (verde) versus controle não infectado (cinza). A expressão de TNFα foi normalizada para a expressão de B-actina usando a fórmula 2-(Cq(TNFα)-Cq(β-actina)). n=4 replica. A análise estatística foi realizada usando um teste t de Student não pareado. P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

ComponenteConcentração 
DMEM avançado1X final
HEPES1% v/v
Glutamax1% v/v
Substituto Wnt0,5 nM
R-spo1 UPE2% v/v
Noggin UPE1% v/v
B27 sem vitamina A2% v/v
N-acetil cisteína1,25 mM
Nicotinamida10 μM
hEGF50 ng/mL
A83-01 (inibidor de TGF-β)0,5 μM
SB202190 (inibidor de p38)3 μM
Prostaglandina E21 μM
Inibidor de rho quinase10 μM

Tabela 1: Meio de expansão para organoides intestinais humanos. Composição do meio de expansão usado para manutenção e proliferação de organoides intestinais humanos.

ComponenteConcentração
DMEM avançado1X final
HEPES1% v/v
Glutamax1% v/v
R-spo1 UPE2% v/v
Noggin UPE1% v/v
B27 sem vitamina A2% v/v
NAC1,25 mM
hEGF50 ng/mL

Tabela 2: Meio de diferenciação para organoides intestinais humanos. Composição do meio de diferenciação usado para promover a maturação epitelial das monocamadas organoides intestinais humanas.

ComponenteConcentração
DMEM avançado1X final
HEPES1% v/v
Glutamax1% v/v

Tabela 3: ADV DMEM++ para infecção. Composição do meio avançado DMEM/F12 suplementado com HEPES e Glutamax (Adv DMEM++) utilizado durante ensaios de infecção bacteriana.

NomeSequência
TNFα FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG
TNFα RATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
β-actina FTGACGTTGACATCCGTAAAG
β-actina RGAGGAGCAATGATCTCTCT

Tabela 4: Primers para qPCR de TNFα. Mostra as sequências de primer usadas para análise quantitativa por PCR de TNFα usando β-actina como gene de referência.

Discussão

Este estudo estabeleceu um protocolo para investigar a infecção bacteriana de células epiteliais intestinais humanas usando organoides derivados de TSC cultivados em insertos de cultura celular. Insertos com poros de 3 μm permitiram fixação celular eficiente e translocação bacteriana, enquanto poros de 0,4 μm não permitem a passagem da AIEC, consistente com o tamanho aproximado de 1 μm da E. coli. Não foi observada translocação de células organoides através de poros de 3 μm, provavelmente devido ao seu fenótipo epitelial e não invasivo.

Várias variáveis experimentais foram críticas para a reprodutibilidade, incluindo fixação celular eficiente, densidade adequada de semeadura e confluência completa antes da infecção. Células epiteliais derivadas de organoides não aderem ao plástico não revestido, tornando o revestimento essencial. A BME proporcionava consistentemente alta eficiência de fixação. O revestimento invasin produziu resultados comparáveis e representa uma alternativa econômica11, embora deva ser produzido internamente. O revestimento de colágeno também foi proposto como uma alternativa17.

Condições de crescimento bacteriano influenciam fortemente a eficiência da infecção. Cepas de E. coli crescem bem em DMEM; no entanto, antibióticos residuais podem inibir a proliferação. Em condições ideais, culturas infectadas geralmente apresentam turbidez aumentada em comparação aos controles, e o crescimento bacteriano pode ser confirmado pelo revestimento do conteúdo do compartimento apical.

A estratégia de imagem permitiu a visualização tanto de bactérias intracelulares quanto extracelulares, direcionando a AIEC expressando um fluoróforo sob um promotor constitutivo (por exemplo, usando o plasmídeo pMB1-spect-PthrC-eGFP). Métodos alternativos permitem a detecção seletiva de bactérias intracelulares, incluindo a coloração diferencial de imunofluorescência18 ou repórteres expressos em estágios definidos de invasão19. Os ensaios de proteção contra gentamicina oferecem uma abordagem quantitativa adicional20.

Esse modelo é intencionalmente reducionista e foca nas interações diretas entre bactérias e o epitélio intestinal. Ele permite a investigação da infecção em uma monocamada epitelial diferenciada sem mais tipos celulares in vivo. O meio de diferenciação induziu predominantemente a diferenciação de enterócitos e células decáliz 21, mas pode ser modificado para alterar a composição epitelial22,23. A complexidade do sistema pode ser aumentada ao co-cultivar células imunes ou estromais no compartimentobasal 24.

O sistema não recapitula a arquitetura tridimensional da mucosa intestinal. Plataformas organ-on-chip superam algumas limitaçõesestruturais 25 , mas exigem maior complexidade técnica e recursos. Além disso, o modelo é mais adequado para infecções agudas, já que o crescimento bacteriano limita os experimentos a aproximadamente 8 horas. Sistemas mais complexos, como plataformas microfluídicas que permitem troca contínua de meio, são necessários para estudar infecções crônicas in vitro26.

Sistemas similares de infecção por organoides baseados em cultura celular por inserção foram aplicados em múltiplos tecidos e patógenos, incluindo organoides estomacais infectados com Helicobacter pylori 27,28, organoides intestinais infectados com Shigella29, organoides das vias aéreas infectados com Pseudomonas aeruginosa10 e organoides uroteliais infectados com Enterococcus faecalis30. Esse protocolo, portanto, oferece uma estrutura versátil para investigar as interações epiteliais-bacterianas entre sistemas de órgãos, desde que sejam considerados os requisitos específicos de crescimento do patógeno.

A tecnologia organoide fornece modelos humanos fisiologicamente relevantes para investigar as interações hospedeiro-patógeno em células epiteliais nãotransformadas 4,5. Dada a crescente carga de infecções resistentes a antibióticos e sua associação com doenças inflamatórias crônicas e câncer, esses sistemas in vitro representam ferramentas valiosas para pesquisas mecanicistas e translacionalistas.

Divulgações

H.C. é inventor de várias patentes relacionadas à tecnologia organoide. A divulgação completa de H.C. é dada no https://www.uu.nl/staff/JCClevers/.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Portal de Utrecht pela Tecnologia Organoide (UPORT), em particular Anneta Brousali, Jorieke Salij e Arnold Binda, assim como aos pacientes e cirurgiões do Centro Médico Universitário de Utrecht por fornecerem tecidos do cólon. Os autores também agradecem a Nicolas Barnich por compartilhar a cepa AIEC LF82. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa CRUK OPTIMISTIC (C10674/A27140). O TG foi financiado pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia, sob o acordo de bolsas Marie Sklodowska-Curie 101107988. Os esquemas foram criados usando o BioRender (https://www.biorender.com/).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A83-01 (inibidor de TGF e beta)Tocris2939
Escherichia coli LF82 invasiva aderentegeneroso presente de Nicolas Barnich
DMEM/F12 AvançadoInvitrogen12634-010
B27 sem vitamina AInvitrogen12587010
Kit de cDNABiossistemas Aplicados4387406O manual está disponível aqui: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN
0017977_highcap_cDNA_RT_UG.pdf
Contador de célulasDeNovixH2796
Contador de célulasLeicaStellaris
Coberturas 24 mm x 50 mmMenzel-Glä zerBB024050S1
Extrato de Membrana Basal de Cultrex (BME)R& D Systems, Bio-Techne3533-001-02
DAPISigma-Aldrich10236276001
Bisturi Descartável Estéril N° 10Swann Morton3033838
DMEMGibco11965092
FijiFijiFiji é de acesso aberto e pode ser baixado aqui: https://imagej.net/software/fiji/downloads
GlutamaxGibco35050-061
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESGibco15630-080
Invasinfeito sob medida segundo Wijnakker et al. PNAS 2024
LBThermofisherCM0996
LB AgarThermofisherCM1116
Câmara MalassezKOVA87144E
Lâminas de microscópioSkycraft18901
Voltohmmômetro de célula de Milli (medição TEER)MerckMERS00002
Meio de montagemLaboratórios VetoresVectashield H-1000-10
N-Acetil CisteínaSigma-AldrichA9165
NicotinamidaSigma-AldrichN0636
Noggin UPEIPA TherapeuticsN002
Solução de ParaFormaldeído 4%Sigma-Aldrich1.00496
Faloidina 647Sigma-Aldrich65906-10NMOL
plasmídeo pMB1-spect-PthrC-eGFPAddgene107408
Prostaglandina E2Tocris2296
Máquina qPCRBioradC1000-Touch
Inibidor de rho quinaseAbMoleM1817
Kit de extração de RNAQiagen74534O manual está disponível aqui: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=bf60203
F-291D-48AE-8206-86B0696B28C0&
lang=en
R-spo3 UPEIPA TherapeuticsR001
SB202190 (inibidor de p38)Sigma-AldrichS7076
EspectinomicinaSigma-AldrichS9007
Placa de suspensão para cultura de organoidesGreiner665102
SYBR verdeBiorad170-8887O manual está disponível aqui: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106212.pdf
TermocicladorBioradT100
Inserto de cultura celularTranswells 24w 3 & micro; m pores, Greiner662631
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TripleGibco, Thermo Fisher Scientific12605-010
Substituto WntU-Protein ExpressOrdem personalizada  https://www.life-sciences-europe.com/organisation/protein-express-immunoprecise-group-utrecht-netherlands-west-europe-2001-30404.html

Referências

  1. McCoy, R., et al. In vitro Models for Investigating Intestinal Host-Pathogen Interactions. Adv Sci. 11 (8), 2306727(2023).
  2. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  3. Gustafsson, J. K., Ermund, A., Johansson, M. E. V., Schütte, A., Hansson, G. C., Sjövall, H. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  4. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  5. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Kim, M., Fèvre, C., Lavina, M., Disson, O., Lecuit, M. Protocol for live imaging of bacteria-cell interactions in genetically modified mouse small intestinal organoids. STAR Protoc. 5 (1), 102773(2024).
  7. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nat Protoc. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  8. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunol. 7 (4), 818-828 (2014).
  9. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Dual RNA sequencing of a co-culture model of Pseudomonas aeruginosa and human 2D upper airway organoids. Sci Rep. 15 (1), 2222(2025).
  11. Wijnakker, J. J. A. P. M., et al. Integrin-activating Yersinia protein Invasin sustains long-term expansion of primary epithelial cells as 2D organoid sheets. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2420595121(2025).
  12. Darfeuille-Michaud, A., et al. Presence of adherent Escherichia coli strains in ileal mucosa of patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 115 (6), 1405-1413 (1998).
  13. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  14. Pleguezuelos-Manzano, C., Puschhof, J., van den Brink, S., Geurts, V., Beumer, J., Clevers, H. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  15. Anilionyte, O., Liang, H., Ma, X., Yang, L., Zhou, K. Short, auto-inducible promoters for well-controlled protein expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (16), 7007-7015 (2018).
  16. Chen, S., Einspanier, R., Schoen, J. Transepithelial electrical resistance (TEER): a functional parameter to monitor the quality of oviduct epithelial cells cultured on filter supports. Histochem Cell Biol. 144 (5), 509-515 (2015).
  17. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), e59357(2019).
  18. Quereda, J. J., et al. A dual microscopy-based assay to assess Listeria monocytogenes cellular entry and vacuolar escape. Appl Environ Microbiol. 82 (1), 211-217 (2016).
  19. Schulte, M., Grotheer, L., Hensel, M. Bright individuals: Applications of fluorescent protein-based reporter systems in single-cell cellular microbiology. Mol Microbiol. 121 (3), 605-617 (2024).
  20. Sharma, A., Puhar, A. Gentamicin protection assay to determine the number of intracellular bacteria during infection of human TC7 intestinal epithelial cells by Shigella flexneri. Bio-protocol. 9 (13), e3292(2019).
  21. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  22. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture conditions. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  23. He, G. -W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345 (2022).
  24. Ding, L., et al. Toll-like receptor 9 pathway mediates Schlafen⁺-MDSC polarization during Helicobacter-induced gastric metaplasias. Gastroenterology. 163 (2), 411-425 (2022).
  25. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nature Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Vllahu, M., et al. Inflammation promotes stomach epithelial defense by stimulating the secretion of antimicrobial peptides in the mucus. Gut Microbes. 16 (1), 2390680(2024).
  28. Aguilar, C., et al. et al.Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nature Commun. 13 (1), 1-14 (2022).
  29. Llanos-Chea, A., et al. Bacteriophage therapy testing against Shigella flexneri in a novel human intestinal organoid-derived infection model. J Ped Gastroenterol Nutr. 68 (4), 509-516 (2019).
  30. Horsley, H., Dharmasena, D., Malone-Lee, J., Rohn, J. L. A urine-dependent human urothelial organoid offers a potential alternative to rodent models of infection. Sci Rep. 8 (1), 1238(2018).

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Organoides IntestinaisRevestimento com InvasinaMonocamada PolarizadaBarreira EpitelialMicroscopia ConfocalRT-qPCRResistência Elétrica Transepithelial
Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.