Artigo de método

Avaliação de Esferoides 3D para Estudos de Transdução por AAV

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DOI:

10.3791/70517

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14 de agosto de 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

Neste artigo

Resumo

Sistemas de cultivo tridimensionais em esferoides aprimoram os modelos convencionais em 2D para o desenvolvimento de terapias gênicas com AAV. Esta metodologia permite a detecção sensível da transdução por AAV em doses baixas, relevância fisiológica aumentada e monitoramento robusto a longo prazo. A plataforma possibilita a avaliação de potência, triagem de alto rendimento e otimização de vetores em diferentes linhagens celulares e sorotipos de AAV.

Resumo

Vírus adeno-associados (AAVs) são vetores potentes utilizados para entrega gênica em produtos de terapia gênica. Seu desenvolvimento exige sistemas in vitro capazes de detectar com confiança diferenças no design do vetor, desempenho de sorotipos, força de elementos regulatórios e cinética de expressão. Esses sistemas também devem suportar aplicações como avaliação de potência e otimização de vetores. Aqui, descrevemos uma plataforma simplificada de esferoides tridimensionais otimizada para avaliar a potência de AAVs, a cinética de expressão de transgenes e a eficácia de transdução específica por sorotipo em diversas linhagens celulares. Esferoides uniformes são gerados utilizando placas com aderência ultrabaixa e mantidos em condições que suportam arquitetura estável e imagens de longo prazo. Após a transdução com AAV, leituras fluorescentes ou luminiscentes são monitoradas em tempo real por meio de sistemas de imagem em células vivas. Isso permite a avaliação quantitativa do sinal do repórter, resposta à dose, atividade de elementos regulatórios e tempo de início por meio de imagens cinéticas contínuas. A plataforma discrimina efetivamente entre designs potentes e fracos do genoma do vetor, bem como entre múltiplos sorotipos de AAV. Este método demonstra desempenho robusto em linhagens celulares com divisão lenta e rápida. Esses resultados estabelecem sua utilidade como um sistema escalável e fisiologicamente relevante para avaliação e desenvolvimento pré-clínicos de terapias genéticas.

Introdução

Os vetores AAV tornaram-se um dos sistemas preferidos de entrega gênica para aplicações in vivo devido ao seu perfil de segurança e à capacidade de alcançar expressão gênica persistente1. A terapia gênica com AAV está demonstrando sucesso no tratamento de múltiplas doenças raras, com centenas de produtos na fase de desenvolvimento2. Além disso, aplicações emergentes incluem a entrega in vivo de componentes de edição genômica, como a Cas9, com grande potencial para auxiliar no tratamento de doenças de difícil tratamento3. Os principais desafios no desenvolvimento incluem os altos custos de produção e a capacidade preditiva limitada dos ensaios in vitro atuais para determinar a qualidade do produto e a eficácia clínica4.

O avanço das terapias com AAV é fundamentalmente limitado pela ausência de ensaios de atividade padronizados e preditivos que possam prever com precisão o desempenho clínico4,5. Esses ensaios são um componente crítico do processo de desenvolvimento, sendo utilizados para diversas finalidades, incluindo a triagem de bibliotecas de vetores projetados, a otimização de modificações do capsídeo para aprimorar o direcionamento e a avaliação da tropismo tecidual específico. Também servem para caracterizar a influência de sequências reguladoras na expressão do transgene6. Além da seleção de candidatos, os ensaios de transdução com AAV também apoiam o controle crítico de qualidade na fabricação, por meio de ensaios de potência utilizados na liberação de lotes, estudos de comparabilidade entre lotes e avaliações de estabilidade6,7.

O desafio científico reside no desenvolvimento de ensaios que capturem a complexidade das interações vetor-hospedeiro, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade prática para uso rotineiro7,8. As abordagens atuais incluem o uso de linhagens celulares imortalizadas que representam o órgão-alvo em culturas tradicionais em monocamada bidimensional. Essas condições de cultivo possuem baixa relevância fisiológica e exigem altas doses de fármacos. Isso cria uma lacuna significativa entre as previsões laboratoriais e a translação clínica. Linhagens celulares projetadas recentemente, como sistemas com superexpressão de AAVR ou ativados por CRISPR, representam avanços importantes, mas não conseguem recapitular a arquitetura tridimensional e as interações com a matriz extracelular características dos tecidos nativos9,10,11. Modelos de nova geração que simulem melhor os microambientes in vivo poderiam superar essa divisão translacional12,13,14.

Desenvolvemos recentemente um sistema de esferoides tridimensionais otimizado para a transdução por AAV, a fim de melhorar a transposibilidade dos ensaios de transdução por AAV. Este sistema aumenta significativamente a eficiência de transdução por AAV em múltiplas linhagens celulares e sorotipos de AAV em comparação com os ensaios padrão-ouro em 2D. Além da sensibilidade aprimorada e da conservação do produto utilizado no ensaio, esses modelos superam as monocamadas em 2D ao proporcionar interações realistas entre células que variam conforme a localização celular dentro do esferoide. Eles também permitem investigações significativas da penetração de fármacos que simulam condições reais de órgãos11,15,16. Além disso, essa abordagem com esferoides oferece vantagens práticas em relação a sistemas mais complexos, como organoides ou culturas mistas, pois utiliza equipamentos laboratoriais padrão e dispensa meios especializados ou requisitos de suporte. Essa simplicidade garante reprodutibilidade e escalabilidade, tornando-o adequado para testes rotineiros de terapia gênica e fluxos de trabalho de desenvolvimento de vetores17.

Esta plataforma de esferoides tridimensionais é particularmente adequada para aplicações que exigem detecção sensível da transdução por AAV em doses baixas e avaliação comparativa de projetos de genoma vetorial. Também permite a avaliação do tropismo dependente de sorotipo. É especialmente vantajosa para linhagens celulares com eficiência de transdução relativamente baixa, que requerem altas doses de AAV em culturas convencionais em 2D. Nessas situações, a sensibilidade aumentada e a maior relevância fisiológica da plataforma tridimensional são fundamentais. No entanto, este sistema pode ser menos apropriado para estudos que exigem componentes imunológicos, entrega vascular ou complexidade tecidual completa. Isso ocorre porque os esferoides não recapitulam totalmente o ambiente in vivo .

Assim, apresentamos um protocolo direto de esferoides tridimensionais otimizado para ensaios de transdução por AAV, com duas leituras críticas e complementares: eficiência de transdução (definida aqui como o sinal total do marcador por esferoide) e cinética de transdução. Este método fornece uma plataforma economicamente viável, fisiologicamente relevante e informativa para avaliação da potência de AAV, design de vetores e ensaios de neutralização.

Protocolo

Este estudo utilizou linhagens celulares humanas estabelecidas (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 e A375) obtidas de fontes comerciais ou previamente publicadas. Nenhuma amostra primária humana ou animal foi utilizada, e, portanto, nenhuma aprovação ética foi necessária.

1. Configuração estéril do experimento e preparação inicial da cabine

  1. Ative a cabine de segurança biológica.
  2. Ligue a cabine de segurança microbiológica de fluxo laminar Classe II 15 minutos antes do início do trabalho, para permitir tempo suficiente para a estabilização do fluxo de ar.
  3. Pulverize todas as superfícies internas da cabine com etanol a 70% (v/v).
  4. Prepare uma solução desinfetante de hipoclorito a 5% (v/v) em um béquer de vidro de 500 mL para a eliminação do sobrenadante celular e detritos celulares.
  5. Limpe o equipamento desinfetando completamente todas as micropipetas e caixas de ponteiras com etanol a 70% (v/v).

2. Preparação do meio de cultura celular

  1. Prepare 500 mL de meio-base de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) com alta concentração de glicose.
  2. Suplemente o meio-base com 10 mL de soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS), 1 mL de solução de penicilina/estreptomicina (100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina) e 5 mL de L-glutamina 2 mM.
    NOTA: Técnicas assépticas devem ser mantidas durante todos os procedimentos. A preparação de meio fresco é necessária para cada experimento. Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações específicas dos equipamentos.

3. Preparação de esferoides

  1. Prepare o meio DMEM completo conforme descrito acima.
  2. Aqueça o meio de cultura em banho-maria a 37 °C por 10–15 min.
  3. Remova as linhagens celulares de interesse do tanque de nitrogênio líquido.
  4. Descongele rapidamente as células criopreservadas HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa colocando-as em banho-maria a 37 °C.
  5. Remova imediatamente do banho-maria assim que o último cristal de gelo for descongelado.
  6. Dilua 1 mL de células descongeladas em 9 mL de meio DMEM completo.
    NOTA: Todas as linhagens celulares utilizadas neste protocolo são mantidas no mesmo meio DMEM e nas mesmas condições de cultivo.
  7. Centrifugue as células a 350 × g. por 5 min à temperatura ambiente.
  8. Descarte o sobrenadante.
  9. Re-suspenda o pellet em 5 mL de meio DMEM completo.
  10. Sembre as células em um frasco de cultura celular T75.
  11. Coloque os frascos semeados em uma incubadora de cultura celular mantida a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade.

4. Monitoramento do crescimento celular

  1. Adicione 15 mL de meio de cultura a cada 3 dias.
  2. Subcultive as células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa quando atingirem 70% de confluência; aspire o meio DMEM completo dos frascos T75. 
  3. Lave as células adicionando 5 mL de PBS aos frascos T75 contendo as células. 
  4. Aspire os 5 mL de PBS 30 s após a adição aos frascos T75. 
  5. Repita este passo de lavagem mais uma vez.  
  6. Realize a tripsinização das células com 5 mL de tripsina-EDTA 0,05% durante 5 min. 
  7. Incube os frascos em uma estufa a 37 °C por 5 min para permitir a completa dessanexação das células. 
  8. Adicione 5 mL de meio DMEM completo para neutralizar a tripsina. 
  9. Centrifugue as células a 350 × g. por 5 min para remover a tripsina. 
  10. Resuspenda o pellet celular em 5 mL de DMEM. 
  11. Divida as células em uma diluição 1:10 para subcultivo de rotina. 
    NOTA: Recomenda-se subcultivar as células 2 vezes antes de realizar experimentos, para permitir que as células atinjam a fase logarítmica e se tornem metabolicamente ativas. 
  12. Continue a incubação sob essas condições controladas até que as células atinjam 70% de confluência, então prossiga com os procedimentos experimentais subsequentes.
    NOTA: A morfologia celular e os padrões de crescimento devem ser monitorados regularmente. Assegure o posicionamento adequado dos frascos para uma troca gasosa ideal. Condições estéreis são essenciais durante todo o período de incubação.

5. Colheita celular e preparação inicial das células

  1. Remova o meio de cultura aspirando o meio existente dos frascos T75.
  2. Lave as células HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 e HeLa três vezes com PBS para remover resíduos de meio e detritos.
  3. Adicione 5 mL de solução de tripsina 1× pré-aquecida a essas células para destacar as células aderentes da superfície do frasco.
    NOTA: Certifique-se de que a tripsina esteja pré-aquecida para manter a atividade enzimática ideal. Coloque os frascos em um incubador a 37 °C por 5 min para permitir a completa dessociação celular. Monitore cuidadosamente o tempo de tripsinização para evitar superdigestão.
  4. Adicione 5 mL de meio de cultura completo para inativar a enzima tripsina.
  5. Pipete a mistura para cima e para baixo para homogeneizar a solução.
  6. Recolha cada suspensão celular transferindo toda a suspensão para tubos de centrífuga individualmente rotulados.
    NOTA: As células devem ser manipuladas com cuidado durante a ressuspensão para manter a viabilidade.
  7. Centrifugue as células a 350 × g por 5 min à temperatura ambiente para obter o pellet celular.
  8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em 5 mL de meio de cultura fresco.

6. Contagem celular e avaliação da viabilidade utilizando um contador de células

  1. Homogeneíze a suspensão pipetando suavemente para cima e para baixo para garantir distribuição uniforme das células por todo o tubo de centrífuga.
  2. Prepare tubos para contagem de células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa.
  3. Prepare uma diluição 1:10 da amostra em meio de cultura DMEM completo. Por exemplo, 40 µL de suspensão celular em 360 µL de meio DMEM completo.
  4. Pipete suavemente a mistura para cima e para baixo quatro vezes para garantir uma diluição homogênea.
  5. Identifique a amostra no login e registre o tipo celular utilizado, a diluição e o nome da amostra.
  6. Carregue a amostra no contador de células e posicione o tubo contendo a suspensão celular diluída no número designado.
    NOTA: O contador de células é um dispositivo automático que aspira as amostras celulares e as mistura com azul de tripano, reduzindo a variabilidade entre operadores.
  7. Deixe a suspensão celular repousar por 1 minuto antes de contar a amostra.
  8. Resuspenda as células uniformemente antes da contagem para obter resultados precisos.
  9. Calcule o número total de células.
  10. Utilize a concentração total de células viáveis para determinar o plaqueamento celular em experimentos.
  11. Utilize células viáveis com > 90% de viabilidade.
  12. Diferencie entre células viáveis (não coradas) e não viáveis (coradas em azul).
    NOTA: Os critérios de contagem devem ser mantidos consistentes em todas as amostras.

7. Semeadura de esferoides e otimização de tamanho

  1. Pipete a suspensão celular para cima e para baixo para homogeneizar a solução.
  2. Plante diferentes densidades celulares de células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 ou HeLa.
  3. Comece plantando 1 x 104 células em 200 µL em uma placa de fundo redondo de 96 poços com aderência ultra-baixa (ULA).
  4. Dilua seriamente as 1 x 104 células/poço em diluições de 2 vezes até atingir a densidade celular desejada para os experimentos.
  5. Adicione 1 volume de meio completo a todas as linhas (1B-1H), exceto à linha superior.
  6. Adicione 2 volumes de 1 x 104 células/poço na linha 1A (linha superior).
  7. Dilua seriamente a linha 1A adicionando 1 volume da linha 1A à linha 1B e assim por diante. Veja o exemplo do delineamento experimental abaixo na Figura Suplementar 1.
    OBSERVAÇÃO: Garanta a ressuspensão uniforme batendo suavemente nas laterais da placa.
  8. Centrifugue a placa ULA a 350 × g por 5 min para reunir as células no centro e promover o contato célula-célula.
    OBSERVAÇÃO: Se estiver usando linhagens celulares diferentes das relatadas aqui, pode ser necessário otimizar os parâmetros, pois diferentes linhagens celulares apresentam taxas variáveis de crescimento e formação de esferoides.
  9. Evite perturbar as placas nas primeiras 24–48 h para permitir a formação inicial dos esferoides. Deixe os esferoides amadurecerem por 3 dias até atingirem um diâmetro de ~400 µm.
  10. Verifique a uniformidade do tamanho dos esferoides. Certifique-se de que as células estejam ressuspensas uniformemente e de que as placas não estejam empenadas.
    Observação: Não utilize placas com esferoides de tamanhos inconsistentes. Certifique-se de que os esferoides tenham diâmetros relativamente uniformes dentro de cada poço.
  11. Monitore a morfologia dos esferoides.
    Observação: Esferoides bem formados apresentam-se redondos, com bordas definidas.
  12. Forme esferoides maduros que exibam forte adesão célula-célula, não agregados celulares soltos.
  13. Aumente a densidade de semeadura ou prolongue o tempo de formação. Se os esferoides não estiverem compactos, aumente a densidade de semeadura ou prolongue o tempo de formação.
  14. Minimize múltiplos agregados pequenos reduzindo a densidade de semeadura ou prolongando o passo de centrifugação.

8. Monitoramento em tempo real de esferoides em células vivas

  1. Após a centrifugação das suspensões celulares, transfira a placa para um incubador a 37 °C (5% CO2, 95% umidade), que contenha um instrumento de imagem celular viva para aquisição automatizada de imagens de células vivas.
  2. Defina os parâmetros para a imagem celular viva de esferoides conforme necessário para o experimento:
    NOTA: Os seguintes parâmetros foram utilizados para todas as linhagens celulares testadas.
  3. Faça login no software de aquisição.
  4. Selecione os seguintes comandos:|Agendar Aquisição | Iniciar Adicionar Vaso | Escaneamento Agendado | Criar Vaso: Novo.
  5. |Selecionar Tipo de Varredura|: Esferoide. |Selecionar os canais de interesse|: Fase + Campo Claro (para acompanhar o crescimento do esferoide), Verde/Vermelho (para acompanhar a transdução por AAV, tempo de aquisição de 300 ms ou 400 ms, respectivamente).
  6. Selecione a magnificação desejada: 10x.
  7. Escolha o modelo da placa e sua posição na gaveta.
  8. Selecione as posições dos poços a serem imageados e quantas imagens são desejadas por poço.
  9. Insira a descrição do experimento: nome, tipo de células, número de células.
  10. Para a configuração da análise, selecione Adiar Análise para Depois.
  11. Clique com o botão direito na linha do tempo e selecione a opção Definir Intervalo do Grupo de Varredura Selecionado.
  12. Defina a adição de varreduras a cada 6 h e varredura indefinidamente. Defina o horário de início desejado (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho de imagem automatizado).
  13. Verifique diariamente o crescimento dos esferoides fazendo login no software de imagem.
  14. Selecione a opção Visualizar Varreduras Recentes e clique duas vezes no experimento desejado. |Selecione Campo Claro no painel de canais de imagem| e então utilize a ferramenta |Medir imagem|  para medir o diâmetro dos esferoides.
    NOTA: Pode ser necessário ajustar o tempo ideal de maturação para produzir esferoides compactos a partir das células de interesse.
  15. Remova a placa no dia da formação ideal dos esferoides e utilize-a para a transdução por AAV.

9. Transdução por AAV

  1. Adquira ou produza sorotipos de AAV3 e transgenes de interesse.
  2. Prepare o meio DMEM suplementado com 2% de FBS para transduções com AAV adicionando 10 mL de FBS a 490 mL de meio DMEM.
    NOTA: Para triagem de cápsides ou elementos reguladores genômicos, um transgene GFP é altamente eficaz, conforme demonstrado na seção de resultados representativos. Dilua o AAV de interesse no meio DMEM suplementado com 2% de FBS, sem antibióticos.
  3. Dilua em uma placa redonda designada de 96 poços para diluições seriadas.
  4. Prepare diluições 1:10 a partir da MOI inicial para titulação dos AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9.
  5. Veja o exemplo de layout experimental abaixo na Figura Suplementar 2. Calcule a MOI necessária para a transdução com AAV, conforme mostrado na seção de Discussão.
  6. Adicione 33 µL do estoque de AAV a 297 µL de meio para obter um volume total de 330 µL com MOI de 1 × 106.
  7. Realize diluições seriadas de dez em dez, começando com uma MOI de 1 × 106, adicionando 33 µL a 297 µL de meio DMEM suplementado com 2% de FBS.
    NOTA: Recomenda-se evitar MOIs elevadas para prevenir redução na viabilidade celular. Pode ser necessário otimizar as condições experimentais para cada tipo celular e sorotipo de AAV, pois eles podem influenciar significativamente a MOI ideal. Nem todos os genomas virais são infecciosos; os títulos funcionais podem diferir do valor em vg/mL.

10. Dosagem de AAV

  1. Aspire todo o meio da placa de esferoides já preparada utilizando uma pipeta multicanal.
  2. Adicione 100 µL do MOI desejado transferindo esse volume da placa de diluição para a placa de tratamento, usando uma pipeta multicanal.
  3. Coloque as placas de volta no instrumento de imagem e inicie o monitoramento da transdução acompanhando a intensidade fluorescente verde durante 72 h.
  4. Adicione 100 µL de meio DMEM completo por poço a cada 3 dias para repor os nutrientes, caso o monitoramento ultrapasse 3 dias.

11. Imagem em tempo real de células vivas, monitoramento da transdução e análise de dados

  1. Coloque a placa de volta no instrumento após adicionar o AAV e a MOI desejados ao grupo de tratamento.
  2. Inicie o registro da eficiência de transdução a cada 6 h.
    NOTA: Geralmente leva entre 3 e 5 dias para atingir a expressão ideal de GFP. Isso depende do promotor e da configuração do genoma utilizada.
  3. Analise os dados criando uma definição de análise específica para as células e genes repórter de interesse.
    NOTA: Alternativamente, mantenha a placa em um incubador padrão a 37 °C e avalie a eficiência de transdução por qPCR, western blot ou ELISA.
  4. Defina os Parâmetros de Análise realizando Análise em Campo Claros para detecção primária de esferoides.
  5. Optimize os Parâmetros de Segmentação conforme a seguir:
    1. Tipo de Análise: "Spheroid Brightfield."
    2. Método de Segmentação: "Limiar Adaptativo."
    3. Intervalo de Limiar: 0,3–0,8 (recomenda-se ajuste automático inicialmente)
    4. Filtro Top-hat: 200–500 µm (remove iluminação irregular)
  6. Optimize os parâmetros de campo claro conforme a seguir:
    1. Carregue imagens representativas de diferentes pontos temporais.
    2. Teste o intervalo de limiar (0,2–0,9) para encontrar a detecção ideal.
    3. Ajuste os filtros de tamanho com base na faixa esperada de tamanho dos esferoides.
    4. Valide a segmentação por inspeção visual da sobreposição.
  7. Optimize o Canal Verde para avaliação da transdução por AAV conforme a seguir:
    1. Determine os níveis de fundo dos poços não tratados (MOI=0).
    2. Defina o limiar 2–3× acima do ruído de fundo.
    3. Teste com a amostra tratada com a maior MOI.
  8. Optimize o tempo de exposição para evitar saturação mantendo o sinal
    NOTA: Para transduções por AAV, informe o sinal de fluorescência total por esferoide como medida da eficiência de transdução.

12. Análise de Dados

  1. Selecione os parâmetros corretos, ajustando os filtros e máscaras, de modo a selecionar as células na imagem e não o ruído de fundo.
  2. Selecione uma imagem representativa para treinar o software.
  3. Aplicar os parâmetros otimizados a todas as imagens do estudo.
  4. Extraia os dados com valores individuais ou agrupados e transfira-os para um sistema de análise estatística para apresentação adicional dos dados.

13. Cálculo do tempo de início

  1. Calcule o tempo necessário para detectar o primeiro sinal de GFP por MOI.
  2. Realize a interpolação nos valores médios dos poços não tratados (MOI = 0) + 3 Desvios Padrão (DP).
  3. Copie a intensidade fluorescente verde de cada esferoide em cada ponto temporal do software de imagem em tempo real para um software estatístico.
  4. Média das réplicas.
  5. Calcule os sinais médio e DP de todos os poços com esferoides não tratados (MOI = 0).
  6. Utilize o ajuste de curva Sigmoide Assimétrica de 5 parâmetros (5PL) para interpolar o tempo de início para cada MOI.
  7. Por exemplo, os seguintes valores de interpolação foram utilizados na Tabela 1:
    1. Para scGFP: 254.955 (média) + 3 × 288.055 (DP) = 1.412.120 (sinal de interpolação)
    2. Para ssGFP: 2.417.941 (média) + 3 × 26.093  (DP) =  3.200.746 (sinal de interpolação)

14. Meça a fluorescência com um leitor de placas com capacidades de fluorescência.

  1. Inicie o software do leitor de placas com fluorescência no computador conectado ao leitor de placas.
  2. Navegar para Arquivo > Abrir Protocolo e escolha o tipo de placa (por exemplo, 96 poços, 384 poços) e certifique-se de que o layout correto dos poços está selecionado. 
  3. Defina o tempo de integração para a detecção de fluorescência, que determina por quanto tempo o leitor coleta a fluorescência de cada poço.
  4. Ajustar qualquer ganho ou sensibilidade configurações
    se o ensaio requer maior ou inferior sinal detecção
  5. Defina os parâmetros fluorescentes para GFP da seguinte forma: excitação: 485 nm e emissão: 528 nm.
  6. Clique em Executar no software para iniciar a medição.
  7. Medir fluorescência de cada bem.
    OBSERVAÇÃO – Após a execução, o software exibe os valores brutos de fluorescência, que podem ser utilizados para gerar gráficos mediante o cálculo das médias e a subtração do fundo.
  8. Exportar resultados em o preferido formato para além disso análise ou relatando.
    OBSERVAÇÃO: Se o protocolo de amostra foi modificado, use Arquivo > Salvar como para criar uma versão única, preservando a original para uso futuro.

15. Transdução de transgene luminiscente

  1. Siga o mesmo protocolo de semeadura e dosagem de AAV descrito acima.
  2. Adicione 100 µL de AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9 carregando um transgene de nano-luciferase com diferentes MOIs variando de 0–106 a 100 µL de esferoides de HeLa já cultivados em placas ULA.
  3. Incube as placas em uma estufa regular a 37 °C e avalie a eficiência de transdução após 3 dias de transdução.

16. Preparar o inibidor de luminescência extracelular e o substrato de luminescência para detecção em ensaio com células vivas

  1. Retire as placas do ensaio do incubador no dia 3 (ponto final).
  2. Adicione o inibidor extracelular de luminiscência e o substrato diretamente às células.
    OBSERVAÇÃO: Não é necessário remover o meio.
  3. Retire o inibidor extracelular do armazenamento a −20 °C e deixe descongelar à temperatura ambiente.
  4. Centrifugue brevemente para recolher o líquido da tampa e das paredes do tubo.
  5. Prepare a quantidade desejada do inibidor extracelular de luminiscência reconstituído a 15X combinando 1 volume do inibidor extracelular com 14 volumes de meio DMEM completo.
    1. Por exemplo, se o experimento exigir 1,0 mL de reagente, adicione 67 µL de inibidor a 933 µL de DMEM. Para 1 placa, prepare 1 mL de DMEM e adicione 67 µL de inibidor.
  6. Transfira o inibidor preparado da Etapa 16.5 para um reservatório estéril de reagentes.
  7. Utilize uma pipeta multicanal para dispensar 10 µL de inibidor nos poços transduzidos com AAV.
  8. Retire o Substrato para Células Vivas do armazenamento a −20 °C e misture.
  9. Centrifugue brevemente para recolher o líquido da tampa e das paredes do tubo.
  10. Prepare a quantidade desejada do Reagente para Células Vivas reconstituído a 3,6X.
  11. Prepare 4 mL de DMEM e adicione 144 µL de substrato para 1 placa.
  12. Transfira o substrato preparado da Etapa 16.11 para um reservatório estéril de reagentes.
  13. Utilize uma pipeta multicanal para dispensar 50 µL de substrato nos mesmos poços transduzidos com AAV.
    OBSERVAÇÃO: O volume dos reagentes pode precisar ser ajustado se várias placas de ensaio forem utilizadas simultaneamente.
  14. Agite a placa a 300 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
  15. Leia a placa com um instrumento de sistema de imagem in vivo dentro de 2 h após a adição dos reagentes de detecção de luminiscência.
    OBSERVAÇÃO: A intensidade da luminiscência decairá gradualmente ao longo de 2 h.

17. Imagem de bioluminescência

  1. Ligue o sistema de imagem de bioluminescência pelo menos 30 minutos antes da aquisição para permitir que a câmera CCD esfrie (−90 °C).
  2. Verifique se as placas estão prontas para a imagem (por exemplo, adição do substrato para imagem de células vivas para leitura de bioluminescência).
  3. Remova a tampa da placa para evitar reflexão e dispersão da luz.
  4. Limpe a parte inferior da placa se a imagem for adquirida por baixo.
  5. Coloque a placa na câmara de imagem sobre a platina.
  6. Posicione a placa centralizada sob a câmera.
  7. Defina os parâmetros de imagem para Luminescência: Tempo de exposição automático ou defina o tempo de exposição (geralmente 1–60 s), binning (recomendado médio), abertura (1 para máxima sensibilidade).
  8. Tire uma fotografia para referência anatômica.
  9. Adquira a imagem luminiscente.

18. Análise de Dados de Imagem de Bioluminescência

  1. Utilize ferramentas de ROI para delimitar poços ou áreas de interesse.
  2. Garanta tamanho consistente de ROI entre as amostras para comparação.
  3. Meça o fluxo total (fótons/segundo) para bioluminescência.
  4. Meça a eficiência radiante.
  5. Exporte os dados para uma planilha para análise estatística.
  6. Salve arquivos de imagem e resultados da análise.
  7. Exporte as imagens como TIFF ou JPEG para apresentações.

Resultados

Aqui, demonstramos que esferoides tridimensionais podem ser utilizados como uma ferramenta para avaliar a transdução por AAV, distinguir projetos de genoma vetorial, como os auto-complementares (sc) e de fita simples (ss), e avaliar a cinética de transdução. Uma visão geral do processo é mostrada na Figura 1. Resumidamente, as células são primeiramente expandidas em culturas bidimensionais e semeadas em placas de aderência ultrabaixa (ULA) para formar esferoides compactos (Figura 1A). Em seguida, as placas são centrifugadas para promover a agregação (Figura 1B) e transferidas para um sistema de imagem de células vivas para monitoramento em tempo real da formação dos esferoides (Figura 1C). No terceiro dia, os esferoides são transduzidos com AAV em diferentes MOIs (Figura 1D). A cinética de transdução é acompanhada longitudinalmente por meio de imagem de células vivas (Figura 1E), e a análise final é realizada utilizando leituras de fluorescência ou luminiscência baseadas em placa (Figura 1F).

Figura 2 mostra a morfologia de esferoides de 6 linhagens celulares diferentes, demonstrando uma variedade de densidades, graus de arredondamento e formas. Todas as linhagens celulares foram cultivadas em meio DMEM completo por algumas passagens antes de serem utilizadas em qualquer experimento. Após as células atingirem a fase logarítmica, as células HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 e Huh7 foram colhidas e diluídas seriamente em placas de fundo redondo com superfície não aderente (ULA), iniciando com uma densidade de 10.000 células por poço, com diluições seriadas de duas vezes (diluição 1:2) (layout da placa incluído em Suplementar Figura 1 e os resultados representativos são mostrados em Figura Suplementar 2). O tamanho do esferoide pode ser tão pequeno quanto 50 µm enquanto ainda mantinham a estrutura de esferoide e excelente suscetibilidade à transdução. Após o plaqueamento celular, a placa redonda de fundo redondo não aderente foi centrifugada a 350 × g. por 5 min, o que permitiu que as células se concentrassem no centro do poço e se autoagregassem em esferoides. Este passo é particularmente benéfico para células que não agregam naturalmente. A centrifugação pode ser prolongada de 5 a 15 min para células altamente resistentes, como linfócitos. Esferoides bem formados exibem um fenótipo arredondado e compacto, como observado nas células HEK293T e Huh7, enquanto esferoides mal formados apresentam agregação solta e são propensos à desintegração durante as trocas de meio.

Em seguida, a placa é transferida para uma incubadora a 37 °C equipada com um instrumento para monitoramento em tempo real das células. As placas são monitoradas diariamente em intervalos de 6 h para avaliar a formação de esferoides em cada uma das linhagens celulares relatadas aqui. A maioria das linhagens celulares necessita de 3 dias para se autoagrupar em um esferoide. Conforme mostrado na Figura 2, cada linhagem celular exibiu características morfológicas distintas e diferentes níveis de compactação após 3 dias de semeadura. Linhagens celulares hepáticas (Huh7, HEPG2 e HEP3B) formaram esferoides mais compactos e densos do que as demais linhagens celulares. HEK293T formou uma aparência esférica muito arredondada com um núcleo necrótico distinto, enquanto A375 formou um agregado celular de formato irregular (anteriormente descrito como um esferoide deformado)18,19. Acredita-se que essas diferenças morfológicas sejam indicadores de estados fisiopatológicos da doença, o que reforça ainda mais a utilidade dos modelos tridimensionais em comparação com os sistemas de cultura bidimensionais18,19. O protocolo de montagem de esferoides é altamente reprodutível entre as seis linhagens celulares testadas e foi aplicado a todas as transduções mostradas aqui.

Após otimizar a concentração celular, o tempo de formação de esferoides e o estado da autofluorescência verde/vermelha (mostrado na Figura Suplementar 3), prosseguimos para testar a transdução por AAV em esferoides utilizando um sistema de imagem em tempo real em células vivas e um leitor de placas (um exemplo do layout da placa para titulação de AAV é mostrado na Figura Suplementar 4). A Figura 3 mostra o protocolo otimizado de esferoides aplicado em quatro linhagens celulares diferentes (HEK293T, Huh7, HEP3B e HEPG2). No terceiro dia de formação dos esferoides, estes foram transduzidos com dois vetores AAV2 que carregam designs distintos de genoma vetorial, marcados com GFP, em diferentes múltiplos de infecção (MOIs). Esses dois designs de transgene AAV representam variantes de GFP de alta potência (scGFP) e baixa potência (ssGFP). Após a transdução celular, as placas foram colocadas em um sistema de imagem em tempo real em células vivas para monitoramento contínuo da transdução por AAV. No ponto temporal de 72 horas, a intensidade da fluorescência verde foi detectada utilizando um software de imagem em células vivas. Na Figura 3, as linhas azuis representam genomas sc-GFP, enquanto as linhas vermelhas representam genomas ss-GFP. Os esferoides mostraram alta suscetibilidade à transdução por AAV, com forte transdução detectada em títulos muito baixos de AAV e em diferentes linhagens celulares para scGFP. Vídeos representativos da transdução por AAV em várias linhagens celulares e MOIs, capturados em tempo real, são mostrados em Filme Suplementar 1, Filme Suplementar 2, Filme Suplementar 3, Filme Suplementar 4, Filme Suplementar 5 e Filme Suplementar 6. Por outro lado, a transdução de esferoides pelo AAV ssGFP foi observada em níveis mais baixos, o que reflete a transdução mais fraca e lenta esperada para esse tipo de elemento regulador20,21. Isso demonstra a utilidade dos esferoides tridimensionais para avaliar transduções fortes e fracas por AAV, bem como para discriminar entre genes altamente transduzidos, como sc-GFP, e genes menos potentes, como ss-GFP. Observamos uma diferença de 100 vezes na fluorescência relativa entre os transgenes sc e ss em um MOI de 106 em células HEK293T, e uma diferença de 3 vezes em linhagens celulares mais difíceis de transduzir, como HEP3B.

Em seguida, procedemos a testar a transdução de diferentes sorotipos de AAV de maneira dependente da dose em esferoides de HEK293T e em esferoides de Huh7. Conforme mostrado na Figura 4, os esferoides tridimensionais foram suscetíveis à transdução com AAV-scGFP de quatro sorotipos diferentes. Após 72 h de transdução, o scGFP foi medido utilizando um leitor de placas com fluorescência (Figura 4A,B) e um software de imagem em tempo real de células vivas (Figura 4C,D). Todos os quatro sorotipos foram detectados com sucesso por meio desses dois instrumentos. O sistema de imagem em tempo real apresentou uma faixa maior entre sinal e ruído em comparação ao leitor de placas com fluorescência, embora o sinal normalizado não tenha mostrado diferenças significativas. Verificamos que o AAV2 apresentou a maior eficácia de transdução em ambas as linhagens celulares, seguido pelo AAV1, enquanto o AAV5 e o AAV9 exibiram transdução significativamente menor.

Em seguida, avaliamos a transdução por luminescência utilizando o protocolo de esferoides. Para testar isso, células HeLa foram cultivadas em esferoides tridimensionais seguindo o protocolo otimizado descrito aqui. No terceiro dia, os esferoides de células HeLa foram transduzidos com cinco diferentes sorotipos de AAV que codificam um gene repórter de nano luciferase. Após 72 horas de transdução com AAV, as células foram tratadas com o substrato Live Cell e incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a luminescência foi medida e imageada utilizando um sistema de imageamento de bioluminescência (Figura 5A). Observou-se transdução eficiente para todos os sorotipos de AAV utilizando este sistema. Foi possível discriminar com sensibilidade a eficácia da transdução entre os diferentes sorotipos de AAV, indicando que o protocolo não se limita a leituras de fluorescência. Em concordância com as tendências observadas na Figura 5, a transdução por AAV-nano luciferase em células HeLa mostrou que o AAV2 é o sorotipo mais potente, como observado com os vetores AAV-GFP. Da mesma forma, a menor eficácia de transdução foi observada para o sorotipo AAV9, conforme demonstrado tanto pelos vetores de fluorescência quanto pelos de luminescência (Figura 4 e 5). Uma imagem representativa da transdução por AAV-nano luciferase é mostrada na Figura 5B.

Além da intensidade da transdução, os protocolos de esferoides tridimensionais permitem o monitoramento cinético da transdução. Figura 6 mostra resultados representativos da cinética de transdução de esferoides tridimensionais de HEK293T com AAV2-scGFP e AAV2-ssGFP, quando transduzidos em diferentes MOIs (0-106) (Figura 6A-G). Descobrimos que a transdução por AAV2-scGFP é detectável em MOIs tão baixos quanto 101, com um aumento no sinal GFP detectável após cerca de 34 h em comparação com células não tratadas, utilizando um sistema de imagem em tempo real de células vivas. O sinal de AAV2-ssGFP é muito mais fraco e lento do que o sinal de AAV2-scGFP. Para comparar ainda mais a velocidade de transdução, calculamos o tempo de início em que o sinal GFP se torna detectável. Observamos que o scGFP é, em média, 4 vezes mais rápido que o ssGFP na transdução de células. Os tempos individuais de início são relatados na Tabela 1. Essas medidas cinéticas revelam um aspecto adicional da eficácia da transdução útil para a otimização de ensaios.

Diagrama do fluxo de trabalho de cultura celular; formação de esferoides, transdução e análise usando o IncuCyte.
Figura 1: Visão geral das transduções com AAV utilizando culturas 3D. (A) As células são expandidas em cultura 2D e semeadas em placas com aderência ultra-baixa (ULA) para formar esferoides. (B) As placas são centrifugadas para promover a agregação e transferidas para um (C) sistema IncuCyte S3 para monitoramento em tempo real da formação de esferoides. (D) No dia 3, os esferoides são transduzidos com AAV em diferentes MOIs. (E) A cinética de transdução é acompanhada longitudinalmente por meio de imagem celular vital, e (F) análises finais podem ser realizadas utilizando leituras de fluorescência ou luminiscência baseadas em placa. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura. 

Comparação de esferoides de cultura celular; imagem de microscopia de seis linhagens celulares diferentes no arranjo experimental.
Figura 2: Caracterização morfológica de esferoides em múltiplas linhagens celulares. Imagens representativas de esferoides gerados a partir das linhagens celulares HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 e Huh7 demonstram variabilidade em tamanho, morfologia e compactação, ao mesmo tempo que apresentam alta reprodutibilidade entre réplicas (barra de escala, 50 µm). Todas as linhagens celulares foram semeadas com 1 x 104 células/bem por 3 dias. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Análise de expressão gênica em células marcadas com GFP; MOI versus fluorescência, múltiplas linhagens celulares, gráfico, imagens.
Figura 3: Comparação da eficiência de transdução de AAV entre vetores auto-complementares (scGFP) e de fita simples (ssGFP) em diferentes linhagens celulares. Esferoides tridimensionais de (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B e (D) HEPG2 foram autoagregados e transduzidos com diferentes MOIs de AAV2-scGFP (azul) e AAV2-ssGFP (vermelho). A intensidade total de fluorescência verde foi quantificada 72 h após a transdução. Imagens representativas de esferoides tratados com o MOI mais alto para cada AAV, obtidas após 72 h utilizando um sistema de imagem em tempo real de células vivas. As barras de escala representam 200 µm. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura. 

Gráficos de intensidade de fluorescência para sorotipos de AAV em células HEK293T e Huh7; MOI, variável de tempo.
Figura 4: A transdução por AAV em esferoides tridimensionais distingue a atividade de diferentes sorotipos de AAV. Esferoides tridimensionais derivados de (A,C) HEK293T e (B,D) Huh7 foram transduzidos com AAV1, AAV2, AAV5 e AAV9, contendo o transgene scGFP, em uma faixa de MOIs. As unidades de intensidade fluorescente foram medidas após 72 h utilizando um leitor de placas baseado em fluorescência (A,B) e um sistema de imagem de células vivas (C,D). As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Gráfico de eficiência de transdução por AAV e mapa de calor; MOI versus fluxo total; análise de vetor viral.
Figura 5: Transdução por AAV em esferoides tridimensionais com repórteres luminiscentes. Esferoides de HeLa foram transduzidos com AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9 codificando um transgene repórter de nanoluciferase em MOIs crescentes. A luminiscência foi visualizada e medida utilizando uma leitura final com o sistema de imagem de luminiscência 72 h após a transdução. (A) Valores de Fluxo Total. (B) Leitura representativa no ponto final com imagens de luminiscência das placas de esferoides demonstra a distribuição do sinal entre MOIs e sorotipos. Cada vetor AAV foi analisado em duas réplicas horizontais. As barras de erro representam o desvio padrão (DP). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Análise de expressão gênica; gráficos MOI versus tempo; intensidade de fluorescência de sgGFP; resultados experimentais.
Figura 6: Avaliação da cinética de transdução em esferoides tridimensionais. Esferoides de HEK293T foram transduzidos com AAV2-scGFP (azul) e AAV2-ssGFP (vermelho) em uma faixa de 7 MOIs (A–G). A intensidade verde total foi medida ao longo de um período de 72 h, com intervalos de 6 h, utilizando o sistema Monitor de formação/crescimento de esferoides. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

MOIscGFP (horas)ssGFP (horas)
1>72hrs>72
1034,2>72
10016,554,2
10005,623,1
100003,313
1000001,98

Tabela 1: Tempo de início da detecção de GFP.

Figura Suplementar 1: Disposição das placas para titulação de esferoides. (A) Disposição representativa da placa mostrando o esquema de diluição para esferoides de HEK293T, Huh7, HEP3B e HEPG2, gerados a partir de densidades iniciais de semeadura variando de 10.000 a 78 células. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Formação de esferoides em uma faixa de densidades de semeadura. Imagens microscópicas representativas de esferoides de HEK293T e Huh7 gerados a partir de densidades iniciais de semeadura variando de 10.000 a 78 células no dia 3. A barra de escala representa 50 µm.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Informações sobre linhagens celulares para a formação de esferoides tridimensionais.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Disposição das placas para diluições seriadas de AAV. (A) Disposição representativa da placa mostrando o esquema de diluição seriada de AAV utilizado para AAV1, AAV2, AAV5 e AAV9, iniciando com MOI de 106. O controle negativo é mostrado na linha H, representando esferoides não tratados.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 1: Imagem em tempo real de células vivas mostrando a transdução de AAV2-scGFP em esferoides de HEK293T em MOI 106.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 2: Imagem em tempo real de células vivas da transdução de AAV2-scGFP em esferoides de Huh7 em MOI 106.Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 3: Imagem em tempo real de células vivas mostrando a transdução por AAV2-scGFP em esferoides de HEP3B com MOI 106.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 4: Imagem em tempo real de células vivas mostrando a transdução de AAV2-scGFP em esferoides de HEK293T com MOI 106, como parte de um estudo de dependência da dose.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 5: Imagem em tempo real de células vivas mostrando a transdução de AAV2-scGFP em esferoides de HEK293T em MOI 104.Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 6: Imagem em tempo real de células vivas da transdução de AAV2-scGFP em esferoides de HEK293T em MOI 101.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Cálculo da MOI necessária para transdução com AAV.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Apresentamos aqui uma plataforma tridimensional in vitro otimizada para o desenvolvimento e teste de potência de AAV. Esta plataforma aproveita uma transdução aprimorada, alta sensibilidade e melhor previsibilidade translacional utilizando cultivo celular tridimensional que se assemelha mais à arquitetura do tecido humano. Este sistema diferencia com sucesso a eficácia da transdução entre sorotipos de AAV e elementos regulatórios, incluindo vetores de fita simples e auto-complementares, em múltiplas linhagens celulares. Observamos que, em contraste com os ensaios convencionais em 2D, nos quais a eficiência de transdução é frequentemente definida como a porcentagem de células positivas para o transgene, o sistema de esferoides 3D não permite facilmente a quantificação com resolução em nível de célula única. Portanto, a eficiência de transdução neste estudo é definida como a intensidade do sinal global do marcador (fluorescente ou luminiscente), que reflete as contribuições combinadas da proporção de células transduzidas e do nível de expressão do transgene por célula. A alta sensibilidade dos esferoides reduz substancialmente a necessidade de grandes quantidades de produto, tornando-o economicamente viável, versátil e fisiologicamente relevante para pesquisa e desenvolvimento de AAV.

Essa abordagem resolve desafios importantes dos ensaios tradicionais de cultura celular em 2D, que dependem da adesão a superfícies artificiais e carecem de organização celular, possivelmente levando a previsões inadequadas do desempenho do vetor em ambientes clínicos. O sistema de esferoides em 3D imita melhor a estrutura do tecido e os padrões de distribuição de fármacos, fornecendo dados sobre o comportamento do vetor que se aproximam mais das condições biológicas reais22,23. O protocolo utiliza placas simples de aderência ultrabaixa, tornando-o facilmente reprodutível em condições laboratoriais padrão.

Este sistema adaptável poderia ser usado para ensaios de neutralização de AAV, para estudar a penetração de AAV e para desenvolver experimentos de co-cultura mais complexos com o objetivo de investigar os efeitos de diferentes ambientes celulares na transdução por AAV. Além disso, plataformas de triagem de fármacos e vetores de alto rendimento podem ser facilmente integradas à plataforma de esferoides, permitindo automação e redução de custos nos fluxos de trabalho de descoberta de vetores para o desenvolvimento de produtos mais direcionados.

Uma grande vantagem prática dos esferoides é a capacidade de crescerem continuamente por semanas sem passagem celular, permitindo estudos prolongados da atividade do AAV. Esse sistema de cultura estável mantém interações importantes entre células e componentes da matriz, evitando as interrupções causadas por colheitas celulares repetidas, necessárias nas culturas em 2D24. O ambiente celular preservado sustenta a organização natural de proteínas e estruturas de membrana essenciais para avaliar a ligação e entrada do AAV nas células25.

Embora os esferoides tridimensionais apresentem grande potencial para avaliações de transdução por AAV, também exibem algumas limitações translacionais em comparação com modelos in vivo , principalmente devido à sua estrutura simplificada em relação aos tecidos nativos. Os esferoides carecem de componentes fisiológicos críticos, incluindo vasculatura para entrega do vetor, células imunes para avaliação da imunogenicidade e barreiras específicas de tecido, como a barreira hematoencefálica, que poderiam impactar significativamente o desempenho do AAV26. Essas limitações indicam que os esferoides, apesar de oferecerem um nível intermediário de complexidade entre culturas convencionais bidimensionais e modelos animais in vivo, permanecem insuficientes para recapitular completamente o microambiente fisiológico necessário para uma avaliação abrangente do AAV.

O protocolo de esferoides apresentado aqui descreve um único tipo celular por vez. Esse protocolo pode ser desenvolvido para incluir de 2 a 3 tipos celulares adicionais que se agregam em uma estrutura tridimensional básica. Modelos 3D mais complexos, como organoides ou microfluídica, são sistemas multicelulares que recapitulam a diversidade celular e a organização de órgãos específicos, contendo 10 ou mais tipos celulares distintos dispostos em padrões semelhantes aos de tecidos. Tais organoides 3D avançados podem incluir múltiplas células27, culturas embebidas em hidrogel, técnicas de gota suspensa e plataformas microfluídicas11,27,28. Embora esses métodos forneçam arquiteturas teciduais mais complexas, que poderiam ajudar a aprofundar o entendimento da biologia do AAV, geralmente exigem reagentes e equipamentos mais especializados, além de considerável expertise técnica. Por outro lado, os esferoides 3D formados em placas de aderência ultra baixa são consideravelmente mais simples e adequados para muitos laboratórios, devido à sua eficiência de custo e reprodutibilidade.

Etapas críticas para a implementação bem-sucedida deste protocolo incluem manter alta viabilidade celular, pois células comprometidas podem prejudicar a formação de esferoides e a eficiência de transdução. O uso de placas com aderência ultra-baixa e a otimização da centrifugação também são fundamentais para alcançar a compactação dos esferoides. A otimização da MOI para cada tipo celular e sorotipo de AAV é essencial para evitar sinais fracos ou saturação. A seleção do método de detecção apropriado também é crítica, especialmente para análises cinéticas, nas quais é necessária compatibilidade com sistemas contínuos de imagem em tempo real de células vivas. Várias considerações técnicas são importantes para a interpretação precisa da transdução por AAV em esferoides tridimensionais.

Um sinal de transdução fraco ou ausente pode resultar de título viral baixo, MOI subótimo ou tempo de incubação insuficiente; isso pode ser resolvido mediante verificação dos títulos virais, otimização do MOI e prolongamento do tempo de incubação (geralmente 3–5 dias). Sinais fracos de fluorescência ou luminiscência podem refletir baixa expressão do transgene ou penetração limitada do reagente na estrutura tridimensional, o que pode ser melhorado mediante otimização das configurações de exposição ou mediante concessão de tempo adicional para a difusão do substrato. Um desafio importante em certas linhagens celulares, como as células HeLa, é a autofluorescência, que pode levar a um sinal de fundo elevado e sensibilidade reduzida em ensaios baseados em fluorescência. Para superar essa limitação, implementamos um sistema de repórter baseado em nanoluciferase com detecção por luminiscência, que proporciona uma relação sinal-ruído aprimorada e permite detecção mais precisa da transdução em fundos autofluorescentes. Além disso, o sinal de fundo pode surgir de limiarização inadequada ou fluorescência relacionada ao meio e deve ser controlado utilizando poços não tratados (MOI = 0) para definir os níveis de base. Por fim, a saturação do sinal em MOIs elevados pode ocorrer devido à entrada excessiva de vírus ou limitações do detector; isso pode ser mitigado pela redução da faixa de MOI e pela otimização das configurações de exposição do detector, mantendo as medições dentro da faixa dinâmica linear.

No geral, esta metodologia de esferoides tridimensionais fornece um sistema simplificado e reprodutível para avaliar a transdução, potência e cinética de AAV. Ao preencher a lacuna entre ensaios convencionais em 2D e estudos in vivo, ela permite um desenvolvimento mais fundamentado de vetores e apoia o avanço de estratégias de terapia gênica clinicamente relevantes.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Morten Seirup e Trish Hoang pelo fornecimento do plasmídeo para a produção de nanoluciferase AAV e dos reagentes do substrato vivo. Este projeto foi apoiado por uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa ORISE no CBER, Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos, administrado pelo Instituto Oak Ridge para Ciência e Educação sob um acordo interinstitucional entre o Departamento de Energia dos Estados Unidos e a FDA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora a 37 °CThermoFisher Scientific#51025983Condições padrão de cultivo
Células A375ATCCCRL-1619Linhagem celular
Plasmídeo AAV1Addgene112862Plasmídeo AAV
Plasmídeo AAV2Addgene104963Plasmídeo AAV
Plasmídeo AAV5Addgene104964Plasmídeo AAV
Plasmídeo AAV8Addgene112864Plasmídeo AAV
Plasmídeo AAV9Addgene112865Plasmídeo AAV
Leitor de placas BioTek GEN5Agilent TechnologiesNALeitura final para fluorescência ou luminiscência
CentrífugaThermoFisher Scientific#TSO-MX1RManter a suspensão de esferoides
Corning™ Salina Tamponada com Fosfato para Cultura Celular (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS para lavar as células
DMEM com alta concentração de glicose, suplemento GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific#10569010Meio de crescimento completo
Inibidor Extracelular NanoLuc PromegaN235BQuencha qualquer sinal de Nanoluc® proveniente do ambiente extracelular  
Soro bovino fetal (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLFornecer fatores de crescimento
Células HEK293TATCCCRL-3216Linhagem celular
Células HeLaATCCCRM-CCL-2Linhagem celular
Células HEP3BATCCHB-8064Linhagem celular
Células HEPG2ATCCHB-8065Linhagem celular
Células Huh7ABMT8973Linhagem celular
Microscópio invertido IncuCyte S3SartoriusNAMonitorar a formação e o crescimento de esferoides
Imager IVIS SpectrumSpectralinvivoNALeitura final para luminiscência
Ensaio Nano-Glo® para Células Vivas PromegaN2013Reagente substrato luminiscente para detecção em células vivas
Penicilina-Estrepomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Prevenir contaminação bacteriana
Frascos de cultivo de tecidos T75 com ventilaçãoFisher Scientific#NC0509296 Frascos para cultivar células
Tripsina-EDTA (0,05%)ThermoFisher Scientific#25300120Desprendimento enzimático de células
Placas com baixa adesãoCorning#7007Evitar a adesão celular para promover a formação de esferoides

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