Isolamento e caracterização de pequenas vesículas extracelulares de almofadas de gordura infrapatelares em pacientes com osteoartrite

Summary

RESUMO Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho padronizado para isolar e caracterizar pequenas vesículas extracelulares (sEVs) de tecidos da almofada adiposa infrapatelar de pacientes com osteoartrite.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs), particularmente pequenas vesículas extracelulares (sEVs) definidas como vesículas menores que 200 nm, servem como mediadoras essenciais da comunicação intercelular e são liberadas por quase todos os tipos celulares em diversos fluidos biológicos. A almofada de gordura infrapatelar (IPFP) está intimamente associada ao desenvolvimento e progressão da osteoartrite (OA) do joelho. No entanto, métodos padronizados para isolar sEVs diretamente dos explantios IPFP continuam limitados. Apresentamos um protocolo reprodutível para o isolamento e caracterização de sEVs derivados de tecidos IPFP obtidos de pacientes com OA. O meio condicionado coletado de culturas de tecido IPFP é sequencialmente removido de células e detritos por centrifugação em baixa velocidade, seguida por ultracentrifugação para enriquecer vesículas dentro da faixa de tamanho do sEV. As vesículas resultantes são caracterizadas de acordo com informações mínimas para estudos de recomendações de vesículas extracelulares (MISEV2023), utilizando um conjunto de marcadores proteicos representativos em distintas categorias funcionais: CD63 como tetraspanina associada à membrana, ALIX e TSG101 como proteínas citosólicas envolvidas na biogênese mediada pela maquinaria do Complexo de Seleção Endossomal Necessária para Transporte (ESCRT), e Calnexina como proteína residente no retículo endoplasmático para monitorar potencial contaminação não vesicular. Esse fluxo de trabalho gera preparações de sEV bem definidas, adequadas para aplicações posteriores, como ensaios funcionais ou perfilamento proteômico em pesquisas com osteoartrite.

Introduction

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são um subtipo heterogêneo de vesículas extracelulares que, de acordo com a classificação operacional proposta pela Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) nas diretrizes de informações mínimas para estudos de vesículas extracelulares (MISEV2023), são definidas como vesículas tipicamente menores que 200 nm de diâmetro¹. As sEVs são liberadas por praticamente todos os tipos celulares em fluidos biológicos e têm atraído cada vez mais atenção devido ao seu papel essencial como mediadores da comunicação intercelular em contextos fisiológicos e patológicos ^2,3.

A membrana dos sEVs é enriquecida com múltiplas proteínas funcionais. Entre elas, tetraspaninas como CD63 estão associadas à organização da membrana vesícula e à^{fusão 4}. Além disso, proteínas citosólicas associadas ao complexo endossômico de separação necessário para o transporte (ESCRT), como ALIX e TSG101, são integrantes para a biogênese e secreção do sEV. Consequentemente, elas servem como marcadores confiáveis para confirmar a origem endossômica das vesículas^{isoladas 5,6}.

A almofada de gordura infrapatelar (IPFP) foi reconhecida como um tecido ativo associado às articulações, intimamente ligado ao início e progressão da osteoartrite (OA^)7,8. Em condições inflamatórias e degenerativas, hipotetiza que os sEVs derivados da IPFP carregam mediadores inflamatórios e sinais patogênicos, contribuindo assim para a inflamação sinovial e a degradação^{da cartilagem 9}. Caracterizar os sEVs liberados por tecidos IPFP de pacientes com AO pode, portanto, fornecer insights críticos sobre as redes de comunicação intercelular associadas à doença.

Dado o crescente interesse nos sEVs como mediadores moleculares e potenciais agentes terapêuticos, o estabelecimento de uma abordagem de isolamento de alto rendimento, alta pureza e reprodutível é essencial. Embora a ultracentrifugação diferencial continue sendo uma das estratégias de purificação mais amplamente^{utilizadas 10}, protocolos otimizados para supernadantes ou biofluidos em cultura celular podem não ser diretamente aplicáveis a tecidos sólidos derivados do adipo, como o IPFP. O alto teor lipídico, a matriz extracelular densa e as condições enzimáticas variáveis de digestão podem influenciar a recuperação e pureza das vesículas.

A cultura explantada de tecidos oferece uma abordagem fisiologicamente relevante que preserva a arquitetura celular nativa e as interações célula-célula, minimizando a perturbação enzimática excessiva, permitindo assim a coleta de sEVs liberados sob condições próximas às nativas. No entanto, atualmente falta um fluxo de trabalho padronizado, especificamente adaptado para isolar sEVs de culturas de explant IPFP.

Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para isolar e caracterizar pequenas vesículas extracelulares de culturas de explantação de almofada de gordura infrapatelar, de pacientes com osteoartrite usando ultracentrifugação diferencial, fornecendo uma estrutura metodológica reprodutível para estudos funcionais e translacionales posteriores.

Protocol

O uso de tecidos IPFP de pacientes com osteoartrite neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital da Universidade Médica de Hebei (Aprovação nº [2024] 018). A coleta da amostra foi realizada dentro do período aprovado, e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da aquisição de tecido.

1. Preparação do meio e das soluções

1. Prepare 500 mL de meio completo DMEM/F12 com exossomos e detestado, misturando 445 mL de meio basal DMEM/F12, 50 mL de soro fetal bovino livre de exossomos (10%) e 5 mL de Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B (100 U/mL, 100 μg/mL e 0,25 μg/mL, respectivamente). Esterilize com filtro através de um filtro de 0,22 μm.
2. Prepare o buffer de corrida western blot misturando 950 mL de água destilada (_{dH 2}O) com 50 mL de buffer de corrida 20x (Tris/MOPS/SDS).
3. Prepare o buffer de transferência western blot misturando 800 mL de_{dH 2O}com 100 mL de buffer de transferência 10x e 100 mL de etanol absoluto.
   NOTA: Este buffer de transferência rápida foi especificamente otimizado para transferência úmida de alta corrente (400 mA) em temperatura ambiente. Devido à sua baixa geração de calor, um banho de gelo não é necessário para durações de transferência inferiores a 45 min, o que demonstrou manter alta eficiência de transferência para proteínas na faixa de 10–250 kDa.
   ATENÇÃO: Etanol absoluto é inflamável. Manuse-a em um local bem ventilado e mantenha-se longe de fontes de calor.
4. Prepare o tampão de lavagem misturando 50 mL de 20 x colheres de sopa (200 mM Tris e 3 M NaCl a pH 7,5–7,6) e 2 mL Tween-20 com 950 mL de_dH2O.
5. Prepare a solução de trabalho quimioluminescente misturando volumes iguais de solução de luminol/realçador e tampão de peróxido (aproximadamente 0,1 mL de solução de trabalho são necessários por centímetro quadrado de membrana).
   ATENÇÃO: Substratos quimioluminescentes podem ser irritantes. Use luvas e proteção para os olhos. Descarte resíduos químicos conforme as regulamentações institucionais locais.

2. Preparação do tecido IPFP e coleta do meio condicionado

1. Lave o tecido IPFP recém-obtido (aprox. 10 g) três vezes com 50 mL de PBS pré-resfriado por lavagem, agitando manualmente suavemente no tubo da centrífuga para remover completamente o sangue residual.
2. Pique o tecido IPFP em pedaços de cerca de 2mm x 2mm x 2mm usando tesoura estéril ou um bisturi.
3. Transfira pedaços de tecido IPFP para frascos T175. Adicione 50 mL de meio completo DMEM/F12 com exossomos reduzidos. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas com agitação suave.
4. Colete o meio completo DMEM/F12 (ou seja, meio condicionado) em tubos de 50 mL sobre gelo. Filtre por um filtro de 70 μm para remover detritos de tecido.

3. Isolamento de sEVs usando ultracentrifugação diferencial

NOTA: Execute todos os passos a seguir a 4 °C ou no gelo.

1. Centrifugação inicial em baixa velocidade para remover detritos de tecido
   1. Centrifuge o meio condicionado a 300 x g por 10 minutos a 4 °C. Colete cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para novos tubos centrífugos de 50 mL.
   2. Centrifuge o sobrenadante a 3.000 x g por 10 minutos a 4 °C. Recolha o sobrenadante e transfira-o para novos tubos, garantindo que o pellet não seja perturbado.
2. Centrifugação e filtração intermediárias.
   1. Centrifuge o sobrenadante a 10.000 x g por 30 minutos a 4 °C.
   2. Colete o sobrenadante e filtre-o através de um filtro a vácuo de 0,22 μm para remover vesículas maiores e contaminantes.
3. Primeira ultracentrifugação: pelletagem de sEV.
   1. Transfira o sobrenadante filtrado para tubos de centrífuga de policarbonato de 40 mL.
   2. Ultracentrífuga as amostras a 110.000 x g por 70 min a 4 °C usando um rotor de ângulo fixo (fator k = 70). Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta.
   3. Resuspenda o pellet em 10 mL de PBS pré-resfriado e estéril. Filtre a solução ressuspensa através de um filtro de seringa de 0,22 μm para garantir a remoção de quaisquer agregados restantes.
4. Segunda ultracentrifugação: purificação de sEVs
   1. Ultracentrífuga novamente a 110.000 x g por 70 min a 4 °C usando o rotor de ângulo fixo (fator k = 70).
   2. Descarte cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet de sEV no fundo do tubo. Resuspenda o último pellet de sEV em 200 μL de PBS estéril.
   3. Divida a suspensão do sEV em alíquotas de 20 μL para evitar danos causados por ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Armazene as aliquotas a -80 °C para uso prolongado.

4. Caracterização de sEVs por análise western blot

1. Prepare as amostras de proteína do sEV.
   1. Misture o pellet de sEV (do passo 3.5.2) com 80–120 μL de tampão de lise RIPA suplementado com inibidores de protease.
      NOTA: Busque uma razão de aproximadamente 1 μL de tampão RIPA por 0,5–1,0 μg de proteína estimada. Recomenda-se uma concentração final de proteína de pelo menos 1,0 μg/μL para garantir uma separação eletroforética eficiente e a detecção de sinais de alta qualidade durante a análise western blot.
      ATENÇÃO: O buffer RIPA contém detergentes e irritantes. Use equipamentos de proteção individual.
   2. Faça um vórtice na mistura brevemente e incube as amostras no gelo por 15–30 minutos com balanço suave.
      NOTA: Uma mistura cuidadosa nesta fase é fundamental para a completa ruptura da membrana e a liberação ótima de proteínas. Vórtices insuficientes podem resultar em lise incompleta e concentrações inconsistentes de proteínas entre os replicados.
   3. Centrifuge o lisado a 12.000–14.000 x g por 10–15 minutos. Colete cuidadosamente o sobrenadante.
   4. Determine a concentração total de proteína do lisato de sEV usando um ensaio proteico de ácido bicincônínico (BCA) de alta sensibilidade.
      NOTA: Um ensaio BCA de alta sensibilidade é recomendado em vez do ensaio padrão para amostras de vesículas extracelulares devido ao seu intervalo de detecção mais baixo (0,5–20 μg/mL), o que permite quantificar com precisão as concentrações tipicamente baixas de proteínas obtidas em preparações purificadas de sEV. Realize o ensaio de acordo com o protocolo do kit.
2. Análise de Western Blot.
   1. Misture as amostras de proteína com 5 x buffer de carregamento de amostras SDS-PAGE.
      NOTA: Para a detecção do CD63, prepare as amostras usando um buffer de carga 5x não redutor (sem β-mercaptoetanol) e incube a 70 °C por 10 minutos. Essas condições preservam os epítopos conformacionais e impedem a agregação induzida pelo calor dessa proteína tetraspanina. Para outros marcadores, incluindo ALIX (proteína X interagente com ALG-2), TSG101 (gene de suscetibilidade tumoral 101) e Calnexina, prepare amostras usando um tampão de carga reduzidora 5x contendo 10% de β-mercaptoetanol e aqueça a 95 °C por 5 minutos para garantir a desnaturação completa da proteína.
   2. Carregue as amostras preparadas (tipicamente 20–40 μg de proteína total) em um gel gradiente pré-moldado (4%–12%).
   3. Carregue o marcador de peso molecular da proteína no poço designado conforme as recomendações do fabricante.
   4. Passe o gel em um buffer de funcionamento a uma tensão constante de 100 V.
   5. Continue a corrida por 1 a 1,5 hora, ou até o corante de carga atingir o fundo do gel.
      NOTA: O tempo de execução pode variar dependendo do sistema de eletroforese e da porcentagem do gel.
   6. Transfira as proteínas do gel para as membranas PVDF usando um sistema de transferência úmida a 400 mA por 30 minutos.
      NOTA: A duração da transferência pode variar dependendo da marca do buffer de transferência utilizado.
   7. Bloqueie as membranas em um tampão bloqueador sem proteínas, preparado em soro sorológico trô-tamponado contendo 0,2% de Tween-20 (TBS-T) por 30 minutos em temperatura ambiente, com agitação suave. O tampão bloqueante é formulado sem proteínas séricas, biotina ou proteínas fosforiladas para minimizar a ligação não específica e a interferência de fundo.
   8. Incubar a membrana com anticorpos primários específicos diluídos em um tampão de diluição de anticorpos sem soro, contendo estabilizadores à base de proteínas e aditivos preservadores de anticorpos a 4 °C durante a noite (12–16 h), com agitação suave.
   9. Lave as membranas no buffer de lavagem (TBST contendo 0,2% Tween-20) sob uma agitação suave em um shaker.
   10. Incube as membranas com os anticorpos secundários apropriados em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave.
   11. Lave as membranas novamente no buffer de lavagem sob uma agitação suave em um shaker.
   12. Visualize as bandas proteicas usando substrato quimioluminescente.
       ATENÇÃO: Substratos quimioluminescentes podem irritar a pele e os olhos. Use luvas e óculos de proteção apropriados. Descarte o substrato conforme as diretrizes institucionais de resíduos perigosos.

5. Caracterização de sEVs por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA)

1. Ligue o analisador de rastreamento de nanopartículas e o módulo da bomba de seringas conforme as instruções do fabricante, e permita que o sistema se equilibre por pelo menos 30 minutos antes da medição.
2. Descongele suavemente as amostras de EV no gelo e dilua-as em soro salino estéril e sem partículas protegido com fosfato (PBS) para alcançar uma concentração ideal dentro da faixa recomendada de medição (aproximadamente 1 x 10⁸ a 1 x^{10 9} partículas/mL).
3. Coloque 1 mL da amostra diluída em uma seringa estéril e injete lentamente a amostra na câmara de medição, garantindo que nenhuma bolha de ar seja introduzida.
4. Ajuste o nível e o foco da câmera para visualizar claramente partículas individuais exibindo movimento browniano.
5. Grave três vídeos com duração de 60 s para cada amostra sob condições de fluxo constante usando a bomba de seringa para garantir uma distribuição consistente das partículas.
6. Analise os vídeos gravados usando o software NTA com um limiar de detecção definido em 12, tamanho de desfoque em Automático e distância máxima de salto em Auto.
7. Gerar perfis de distribuição e concentração do tamanho das partículas usando a função de análise automatizada do software.
8. Exporte os dados brutos, gráficos de distribuição de tamanho de partículas e medições de concentração para análises estatísticas adicionais.
9. Limpe a câmara de medição cuidadosamente com água estéril livre de partículas, seguida de 70% de etanol, e lave novamente com água estéril sem partículas para evitar contaminação cruzada entre amostras.

6. Caracterização de sEVs por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

1. Use grades de cobre de 200 malhas revestidas com carbono. Realize descarga de brilho nas grades por 30 s usando um sistema de descarga de brilho, se disponível.
2. Aplique 10 μL da suspensão sEV (ressuspensa em PBS estéril e filtrado) na grade e incube por 2–5 minutos em temperatura ambiente.
3. Remova o excesso de líquido tocando suavemente a borda da grade com papel de filtro.
4. Lave a grade colocando sequencialmente a superfície carregada pela amostra sobre três gotas separadas de água ultrapura.
5. Aplique 10 μL de solução de ácido fosfotungstico a 2% (pH 7,0) na grade e incube por 1–2 minutos em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: O ácido fosfotungstico é um reagente ácido corrosivo que pode causar irritação na pele, olhos e trato respiratório. Manuse-se de acordo com as diretrizes de segurança da instituição enquanto usa equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas e proteção ocular. Descarte resíduos manchados e materiais contaminados seguindo procedimentos aprovados para resíduos químicos perigosos.
6. Remova o excesso de mancha usando papel filtro e deixe a grade secar completamente ao ar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos.
7. Examine as grades usando um microscópio eletrônico de transmissão operado a uma tensão aceleradora de 80 kV.
8. Adquira imagens representativas com ampliações apropriadas para avaliar a morfologia das vesículas.

Results

O isolamento bem-sucedido de pequenas vesículas extracelulares (sEVs) dos tecidos da almofada adiposa infrapatelar humana (IPFP) foi confirmado por meio de caracterização multimodal.

A microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou que as vesículas isoladas apresentavam a morfologia característica em forma de copo com membranas de bicamada lipídica claramente definidas, consistente com as características estruturais das sEVs (Figura 1)¹¹

Discussion

Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho reprodutível e prático para isolar pequenas vesículas extracelulares (sEVs) de tecidos de almofada adiposa infrapatelar humana (IPFP) usando cultura explantada, seguida de ultracentrifugação diferencial. As vesículas isoladas foram validadas por métodos complementares de caracterização, incluindo microscopia eletrônica de transmissão (TEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e detecção por Western blot dos marcadores EV

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga PET de 40 mL	Himaque (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Tereftalato de polietileno, 26 x 90 mm
70 & micro; Filtro de células m	Tecnologia Lanjieke de Pequim	560049	Para remoção de detritos de tecido
Anticorpo anti-Alix	Biotecnologia Shanghai Abways	CY7215	Marcador positivo de sEV
Anticorpo anti-Calnexina	Biotecnologia Shanghai Abways	CY5839	Marcador negativo (contaminação por RE)
Anticorpo anti-CD63	Biociências de Afinidade	DF2305	Marcador tetraspanin
Anticorpo anti-TSG101	Biotecnologia Shanghai Abways	CY5985	Marcador positivo de sEV
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Shanghai YaMei Biotechnology	ZJ102	Para quantificação de proteínas
Frasco de cultura celular (T175)	Biotecnologia NEST	560229	Para cultura de explantação de IPFP
Tubo centrífuga (50 mL)	BIOFIL	560041	Para etapas iniciais de baixa velocidade
Soro Bovino Fetal Empobrecido em Exossomos	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Para cultura de tecidos
HRP Cabrita anti-Coelho IgG	Biotecnologia Shanghai Abways	AB0101	Anticorpo secundário para o albo branco
Tampão de Carregamento Instantâneo de Proteína (Desnaturante, Reduzindo, 5 vezes)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT101	Para desnaturação de proteínas
Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA	Termo Científica	23235	Para quantificação de proteínas
Unidade de Filtro Millex-GP (0,22 & micro; m)	Tecnologia Lanjieke de Pequim	560360	Estéril, para filtração por vesícula
Analisador de Rastreamento de Nanopartículas	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Para análise de tamanho e concentração
Buffer de Transferência Rápida Omni-Flash Livre de Gelo	Shanghai YaMei Biotechnology	PS201S	Para transferência de proteína Western blot
Ácido fosfotongstico (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Para coloração TEM negativa
Buffer de Carga de Proteína (Desnaturante, Não Redutor, 5 vezes;)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT103	Para desnaturação de proteínas
Buffer de Bloqueio Rápido Livre de Proteínas (5 vezes)	Shanghai YaMei Biotechnology	PS108	Para bloquear as membranas
Buffer de lise RIPA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Para extração de proteínas sEV
TBS (20 e vezes)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Para preparar o buffer de lavagem
Microscópio Eletrônico de Transmissão	Hitachi	HT7800	Para caracterização morfológica
Buffer de Eletroforese Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotechnology	PS120	Para separação de proteínas
Pré-adolescente-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Para preparar o buffer de lavagem
Ultracentrífuga	Himaque (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Sistema de isolamento de alta velocidade
Kit de detecção quimioluminescente ultra-sensível	Shanghai YaMei Biotechnology	SQ201	Para visualização de bandas proteicas
Buffer Universal de Diluição de Anticorpos	Shanghai YaMei Biotechnology	PS119L	Para anticorpos primários/secundários