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Oclusão Seletiva e Permanente da Artéria Cerebral Média em Ratos: Uma Abordagem Experimental para Estudar Déficits de Memória Motora e Espacial

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DOI:

10.3791/70519

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20 de março de 2026

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1Endocrine Physiology and Metabolism Laboratory, State University of Western Paraná, 2Laboratory of Experimental Morphology, State University of Western Paraná

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método reprodutível para realizar uma craniectomia seguida de oclusão permanente e seletiva da artéria cerebral média em ratos, para aplicação em estudos experimentais de déficits de memória motora e espacial.

Resumo

Com grande relevância clínica, o AVC isquêmico (IS) exige abordagens experimentais que possibilitem o desenvolvimento de novas terapias adjuvantes. Devido à semelhança da anatomia vascular cerebral com a dos humanos, os ratos são amplamente usados como modelos experimentais do SI. No entanto, ainda existe a necessidade de métodos capazes de gerar um ambiente isquêmico que se assemelhe mais ao observado em humanos, empregando uma abordagem que priorize a oclusão arterial seletiva. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi estabelecer um método reprodutível para realizar uma craniectomia seguida de oclusão permanente e seletiva da artéria cerebral média (MCA) em ratos, para padronizar o modelo e reduzir desafios técnicos para aplicação em estudos de déficits de memória motora e espacial. Ratos wistar (N = 28) foram divididos igualmente em dois grupos, um passando por craniectomia sozinha (SHAM) e o outro craniectomia, seguida pela oclusão seletiva da MCA (MCAO). Nos sétimo e oitavo dias pós-operatórios, foram realizados o teste postural e o teste de memória de reconhecimento de localização de objetos, respectivamente. Após a eutanásia, amostras cerebrais foram coletadas e seções histológicas coloridas com Nissl foram preparadas. Para demonstrar a viabilidade e eficácia do método, foi desenvolvido um protocolo cirúrgico detalhado, incluindo preparação pré-operatória, anestesia, posicionamento, craniectomia, MCAO e fechamento. O método aplicado demonstrou déficits no grupo MCAO, como evidenciado pelo teste postural (p = 0,015) e pelo teste de reconhecimento de localização de objetos (p < 0,001). A análise histológica confirmou a seletividade da abordagem, com lesão envolvendo áreas associadas ao hipocampo, como os córtices perirhinal, entorhinal e piriforme, além da cápsula externa, enquanto estruturas cerebrais mais profundas foram preservadas. Esse protocolo provou ser um método reprodutível e eficaz para induzir isquemia seletiva de MCA em ratos e representa uma ferramenta válida e tecnicamente acessível para estudos experimentais que investigam mecanismos fisiopatológicos e terapêuticos no AVC isquêmico.

Introdução

A penumbra isquêmica que envolve a área infartada no AVC isquêmico (IS) pode se recuperar se os tratamentos forem aplicados em tempo hábil, visando prevenir ou mitigar comprometimentos motores e de memória1. No entanto, terapias como trombólise química e trombectomia mecânica continuam pouco acessíveis na prática clínica para um grande segmento dapopulação 2, o que reforça a necessidade de modelos experimentais para investigar estratégias de tratamento mais amplamente disponíveis. Estudos em animais são indispensáveis devido à sua reprodutibilidade e à capacidade de analisar circulaçãocolateral 3, sendo os ratos amplamente utilizados nos modelosIS 4. Devido à sua estreita correlação com o IS5 humano e seu diâmetro do vaso, a artéria cerebral média (MCA) é o vaso-alvo principal em estudos experimentais da oclusãoarterial 6,7,8.

Um dos modelos animais mais amplamente utilizados para induzir isquemia cerebral é a oclusão intraluminal baseada em filamentos, seguida pelareperfusão 9,10. No entanto, a variabilidade associada ao posicionamento preciso do filamento dentro do MCA, a oclusão inadvertida dos vasos adjacentes do círculo de Willis, os efeitos colaterais devido à ligadura da artéria carótida externa (ECA) necessária para o procedimento e a duração da oclusão contribuem para resultados conflitantes nasmeta-análises 11,12.

No contexto clínico, a maioria dos pacientes com SII não alcança reperfusão cerebral e não apresenta danos hipotalâmicos ou sequelas associadas à oclusão da ECA, destacando a necessidade de abordagens experimentais que induzam isquemia seletiva sem reperfusão subsequente. Uma alternativa é a oclusão permanente da MCA (MCAO) realizada por craniectomia. Com visualização direta do MCA, a oclusão seletiva previne danos associados à ligadura ECA e lesões nas artérias coroidais anteriores, hipotalâmicas ecerebrais posteriores 13, resultando em um efeito isquêmico mais semelhante ao observado no infarto lacunar.

Estudos recentes indicam que modelos animais de IS devem apresentar uma correlação mais próxima entre a área isquêmica e desfechos clínicosdesfavoráveis 14,15. Desenvolver alternativas técnicas que permitam indução direcionada de isquemia com complicações mínimas que interferam nos resultados parece ser a estratégia mais adequada. Nesse contexto, o objetivo desse protocolo era estabelecer um método reprodutível para realizar craniectomia seguida de MCAO permanente e seletiva em ratos, com o objetivo de padronizar o modelo e reduzir desafios técnicos, para uso em estudos de déficits de memória motora e espacial. Essa abordagem foi adaptada a partir de estudosclássicos 16,17,18,19 que demonstraram altas taxas de sobrevivência, permitindo avaliações de longo prazo.

Utilizando a veia cerebral inferior (VCI) como marco anatômico, este protocolo busca desmistificar a dificuldade técnica historicamente citada como a principal limitação dessa abordagem, permitindo a investigação da isquemia cerebral seletiva tanto em fases agudas quanto crônicas. A função motora e a memória espacial foram avaliadas para verificar os déficits induzidos pelo modelo proposto de lesão, além da análise histológica das regiões cerebrais isquêmicas.

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Protocolo

O protocolo seguiu as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) da Universidade Estadual do Paraná Ocidental (UNIOESTE), protocolo número 25-23.

1. Preparação pré-operatória

  1. Prepare instrumentos cirúrgicos, gaze, almofadas de algodão e posicione o estereomicroscópio (Figura 1).
  2. Limpe a mesa cirúrgica e o equipamento com 70% de etanol.

2. Anestesia

  1. Induza anestesia com uma mistura de cetamina (3,75 mL), xilazina (2,5 mL) e 0,9% de cloreto de sódio (3,75 mL). Administrar 0,2 mL da mistura por 100 g de peso corporal intraperitonealmente. Confirme a profundidade da anestesia usando uma pata traseira ou um beliscão na cauda.
  2. Se necessário, administre doses adicionais correspondentes a um terço da dose máxima para evitar overdose.
  3. Administrar o antibiótico profilático enrofloxacina (20 mg/kg) e o analgésico tramadol cloridrato (12 mg/kg) intraperitonealmente.
  4. Meça a temperatura retal e mantenha a temperatura corporal em 37°C (± 2°C) usando uma bolsa térmica durante todo o procedimento.

3. Posicionamento

  1. Coloque o rato em decúbito lateral sobre um algodão no palco do microscópio (Figura 1A). Apoie a cabeça com um pequeno rolo macio e alinhe-a a 180° para expor a superfície lateral esquerda do crânio. Fixe a cabeça com fita adesiva (Figura 2A).
  2. Aplique colírios lubrificantes e prenda as pálpebras com fita.
  3. Verifique novamente a temperatura retal e ajuste a fonte de aquecimento, se necessário.

4. Craniectomia

  1. Realize a tricotomia entre o canto lateral e o trago (aproximadamente 1,6 cm × 0,5 cm) usando um mini tricotomizador ou lâmina de barbear (Figura 1B).
  2. Desinfete a área raspada com esfoliante de clorexidina a 2% e depois clorexidina aquosa a 0,2%.
  3. Faça uma incisão de 1 cm na pele e subcutânea usando tesoura reta (Figura 1C), mantendo uma margem de 0,3 cm atrás do canto lateral e anterior ao trago (Figura 2B).
    NOTA: Retrair essa camada com pinças Adson (Figura 1D) ou pinças hemostáticas.
  4. Identifique e coagule o ramo temporal médio dos vasos temporais superficiais usando eletrocauterização (Figura 1E).
  5. Palpar o arco zigomático usando um elevador mais livre (Figura 1F) e incisar longitudinalmente a fáscia do músculo temporal.
  6. Dissecar o músculo temporal cranial e caudal para expor os ossos temporal e frontal e parte do músculo masseter. Isole o arco zigomático longitudinalmente e remova um segmento de aproximadamente 0,5 cm (Figura 2C).
    1. Precauções:
      1. Controle o sangramento do ramo temporal anterior profundo dos vasos maxilares usando compressão ou eletrocauterização.
      2. Evite cortes oblíquos posteriores para evitar danos à articulação temporomandibular.
      3. Evite lesões na glândula lacrimal extraorbital localizada abaixo do arco.
      4. Evite abrir a cavidade orbital.
  7. Perfure o osso temporal lateral imediatamente posterior ao local de remoção do arco zigomático (Figura 2D) usando uma rebarba redonda revestida de diamante de 3,5 mm de diâmetro, montada em um motor rotativo de baixa velocidade (Figura 1G). Irrige intermitentemente com 0,9% de soro fisiológico para prevenir danos térmicos. Deixe pequenos fragmentos ósseos presos à dura-máter (Figura 2E) e remova-os delicadamente com pinças Halstead (Figura 1H).
    NOTA: Uma craniectomia usando uma broca menor é uma alternativa, mas aumenta o risco de lesão dural e cerebral.

5. Oclusão do MCA (Figura 3)

  1. Abra a dura-máter usando uma agulha ultrafina de 6 mm × 0,25 mm.
    NOTA: Evite danificar vasos corticais adjacentes.
  2. Identifique a veia cerebral inferior (VCI) abaixo da janela da craniectomia e o cruzamento do MCA perpendicularmente acima dela (Figuras 3A,C). Identifique o ramo basal e o mais grosso do MCA localizado no centro do campo da craniectomia.
  3. Passe um 8-0 não absorvível Sutura de polipropileno ao redor do MCA usando um suporte fino para agulhas (Figura 3B e Figura 1I). Faça três nós para ocluir a embarcação (Figura 3C).
    NOTA: Outros pontos não absorvíveis, como nylon, algodão ou seda, podem ser usados.
  4. Confirme a ausência de fluxo sanguíneo a jusante. Se houver um ramo adicional de MCA, ligue-o também.
  5. Irrige a cavidade com soro fisiológico e realize hemostasia com eletrocauterização ou compressão suave, conforme necessário.
    NOTA: Evite coagular tecido cerebral para prevenir artefatos histológicos ou neuroinflamatórios.

6. Encerramento

  1. Reaproxime a dura-máter quando possível.
  2. Reaproxima a camada muscular profunda e sutura a fáscia temporal com sutura 4-0 absorvível (Figura 3D).
  3. Feche as camadas subcutânea e cutânea usando suturas absorvíveis de poliglactina 4-0 910 em um padrão contínuo.
    NOTA: Evite deixar pontas expostas dos pontos. Recomenda-se sutura contínua.
  4. Limpe o local cirúrgico com clorexidina aquosa a 0,2%.
  5. Mantenha os animais aquecidos até a recuperação da anestesia. Monitore a temperatura antes de devolvê-los às gaiolas. A duração total da cirurgia, desde a incisão cutânea até o fechamento da ferida, normalmente varia entre 30 e 45 minutos.
  6. Administre uma segunda dose profilática de antibiótico no dia seguinte à cirurgia.

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Resultados

Um total de 28 ratos Wistar machos (10–12 semanas, peso médio 349 g) foi dividido aleatoriamente e igualmente em dois grupos: MCAO (submetido ao protocolo completo descrito) e SHAM (submetido apenas ao estágio de craniectomia). Neste estudo, 3 animais foram excluídos intraoperatório e substituídos durante a cirurgia devido a sangramento venoso (2 MCAO) ou lesão cortical mínima durante a craniectomia (1 SHAM). Outro animal MCAO morreu no quinto dia pós-operatório. A taxa geral de mortalid...

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Discussão

O modelo MCAO em ratos tem sido usado desde 1975 como paradigma experimental para isquemia cerebral, e foi refinado ao longo dos anos, demonstrando eficácia na indução de danos neurológicos 822,23,24,25,26,27,28...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoio de Pós-Graduação (PROAP) por meio do Projeto de Assistência Financeira para Educação ou Pesquisa, processo número 88881.594204/2020-01, bolsa número 1359/2020. Agradecemos aos professores, técnicos e estudantes dos Laboratórios de Fisiologia, Metabolismo e Anatomia Humana da UNIOESTE (Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, Brasil) pelo apoio técnico e acadêmico ao longo de todo o projeto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adson toothed forcepsABC stainlessL47-P4-164Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Castroviejo needle holderGolgran135-3Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
ElectrocauteryChunguang medical128Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Freer elevatorABC stainless47P4-819Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Halsted curvedABC stainlessAI1055Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Micro drillNail drillZS-710Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Mini trichotomizerKemeiKM-666Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
ProleneEthicon 8730HSutura tamanho 8-0
StereomicroscopeAlltionASM-112Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Straight scissorABC stainlessL23-W4Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Surgical compresseCremer158595Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
Surgical gauzeCremer198669Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
ThermometerG-TechDMT-2027Outras opções podem estar disponíveis de diferentes empresas
VicrylEthicon VCP346HSutura tamanho 4-0

Referências

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