Síntese Verde de Nanopartículas de Magnésio de Plantas Nativas de Savana Neotropical para Formulações Nanofitocosméticas Escaláveis

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para a síntese verde de nanopartículas de magnésio usando extrato de planta Stryphnodendron adstringens , uma espécie da Savana Neotropical Nativa, seguido de sua incorporação e avaliação em uma formulação de soro cosmético.

Resumo

Este estudo descreve um protocolo para a síntese verde de nanopartículas à base de magnésio usando extratos de etanol de Stryphnodendron adstringens, uma espécie vegetal nativa da savana neotropical, e sua incorporação em formulações nanofitocosméticas. O procedimento inclui coleta e preparação de material vegetal, seguida da extração de etanol, na qual os fitoquímicos atuam como agentes redutores e estabilizadores para íons de magnésio. Nanopartículas são sintetizadas sob condições controladas usando cloreto de magnésio e extratos vegetais, possibilitando um processo ambientalmente amigável sem o uso de agentes redutores tóxicos. As propriedades das nanopartículas são caracterizadas usando espalhamento dinâmico da luz e microscopia de força atômica para avaliar a distribuição de tamanho, morfologia e comportamento coloidal. O protocolo descreve ainda a incorporação das nanopartículas sintetizadas em uma formulação de soro cosmético. A estabilidade é avaliada sob condições controladas de armazenamento monitorando propriedades organolépticas, pH e viscosidade. Esse método oferece uma abordagem reprodutível e sustentável para produzir nanopartículas de magnésio mediadas por plantas e avaliar sua aplicação em formulações cosméticas.

Introdução

O domínio fitogeográfico do Cerrado, que compreende a maior formação de savana neotropical da América do Sul, representa a região de savana tropical mais biodiversa do mundo. Este ecossistema abriga milhares de espécies de plantas ricas em metabólitos secundários, como flavonoides, polifenóis, terpenos e ácidos fenólicos, muitos dos quais exibem atividades documentadas antioxidantes, anti-inflamatórias e fotoprotetoras de interesse para as indústrias cosmética e ^{farmacêutica} 1,2,3,4 . Esses fitoquímicos são amplamente incorporados como ingredientes ativos de alto valor em formulações cosméticas funcionais. Além de sua atividade biológica, os grupos funcionais hidroxila e carbonila presentes em muitos polifenóis e flavonoides permitem que atuem como agentes naturais redutores e estabilizadores para íons metálicos na^{solução 5,6}. Essa propriedade química tem sido cada vez mais explorada na nanotecnologia verde para a síntese de nanopartículas metálicas, representando uma oportunidade promissora e pouco explorada para desenvolver formulações cosméticas sustentáveis derivadas da biodiversidade neotropical 2,3,4,5,6.

Tradicionalmente, as nanopartículas (NPs) têm sido produzidas por abordagens top-down, nas quais materiais a granel são quebrados em partículas nanodimensionadas usando métodos físicos como ablação a laser ou sputtering, e abordagens bottom-up, nas quais as NPs são construídas a partir de unidades menores usando rotas químicas ou^{biológicas 7}. Embora métodos químicos e físicos sejam eficazes, eles frequentemente dependem de reagentes tóxicos, alto consumo de energia e equipamentos complexos. Isso levou ao surgimento de abordagens de química verde, que enfatizam sustentabilidade, sustentabilidade e segurança na produção de^{nanomateriais 6}.

Dentro desse contexto, a síntese verde de NPs ganhou atenção significativa. A capacidade dos fitoquímicos vegetais de atuarem simultaneamente como agentes redutores, estabilizantes e de cobrimento, permitindo a síntese eficiente de metais e NPs de óxidos metálicos, combinada com as limitações dos métodos convencionais, que exigem equipamentos especializados, condições extremas e geram resíduos tóxicos, justifica o desenvolvimento de um protocolo de síntese verde que opere sob condições moderadas, é escalável. e não produz subprodutos^perigosos 6,7,8,9. Entre os NPs de óxido metálico explorados por meio dessa estratégia, as nanopartículas de magnésio (MgNPs) apresentam vantagens significativas sobre nanopartículas de prata (AgNPs) e nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs), já que as MgNPs não apresentam tendência à bioacumulação, apresentam menor citotoxicidade em células humanas e são reconhecidas pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos como substâncias geralmente seguras para aplicações^{humanas 10. 11}. Além disso, espera-se que MgNPs sintetizados usando extratos de plantas Cerrado combinem as propriedades antioxidantes e antibacterianas do magnésio com os fitoquímicos bioativos presentes no extrato, aumentando assim seu valor funcional cosmético em comparação com os equivalentes sintetizados^{convencionalmente 10}.

Na indústria cosmética, a aplicação da nanotecnologia revolucionou o desenvolvimento de produtos ao aprimorar a entrega, estabilidade e eficácia dos ingredientes^{ativos 11}. As NPs podem penetrar mais profundamente na pele, proporcionar liberação controlada e proteger compostos sensíveis da degradação, tornando-as altamente valiosas para formulações que focam no envelhecimento da pele, pigmentação, acne e proteção solar¹⁰. Apesar dessas vantagens documentadas, a síntese verde de MgNPs usando plantas nativas de savanas neotropicais como agentes redutores para aplicações cosméticas permanece amplamente inexplorada e carece de padronização metodológica, em contraste com o amplamente relatado para plantas da Ásia, África e^Europa 11,12,13,14 . A maioria dos estudos existentes dá atenção limitada à incorporação de NPs em formulações cosméticas funcionais e à sua estabilidade sob condições de armazenamento controlada 11,14,15. O protocolo atual ajuda a preencher essa lacuna metodológica integrando, em uma única metodologia reprodutível, a síntese verde de MgNPs da flora neotropical, sua incorporação em um soro facial nanofitoscómico e a avaliação abrangente de sua estabilidade fisicoquímica e funcional.

O objetivo geral deste protocolo é descrever uma metodologia padronizada, reprodutível e escalável para a síntese verde de MgNPs usando Stryphnodendron adstringens, uma planta nativa das savanas neotropicais do Cerrado, tanto como agente redutor quanto estabilizador, aproveitando assim suas propriedades bioativas intrínsecas em uma formulação de soro facial. O desenvolvimento de MgNPs sintetizados a partir de S. adstringens para aplicações tópicas em humanos constitui uma nova nanoformulação atualmente protegida sob o pedido de patente brasileiro (BR 10, 2025 015416 1). O desenho experimental proposto representa uma abordagem sustentável e biocompatível para a produção de NP, evitando o uso de agentes redutores tóxicos comumente empregados na síntese convencional de NP, ao mesmo tempo em que facilita a incorporação de fitoquímicos com potencial atividade biológica. Esse protocolo é particularmente adequado para pesquisadores que buscam métodos ambientalmente amigáveis para fabricação de nanopartículas para aplicações cosméticas, farmacêuticas ou biomédicas, especialmente quando extratos vegetais ricos em flavonoides e polifenóis estão disponíveis. Como esses compostos atuam como agentes naturais redutores e estabilizadores, o protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies de plantas com perfis fitoquímicos comparáveis, permitindo sua aplicação em flora nativa de diferentes regiões biogeográficas com base na disponibilidade local de material vegetal.

Protocolo

1. Material vegetal

1. Seleção e documentação
   1. Selecione plantas saudáveis de S. adstringens que crescem em áreas representativas do ambiente natural para coleta de casca. Registre o local da amostragem, data de coleta, coordenadas geográficas usando um dispositivo GPS e as condições ambientais locais no momento da coleta.
   2. Realize identificação botânica usando literatura taxonômica especializada para espécies de savana neotropical. Confirme a identificação consultando um taxonomista^{qualificado 17}.
   3. Colete e separe material vegetal representativo para documentação do herbário, incluindo estruturas vegetativas e reprodutivas (por exemplo, folhas, flores, frutos e pequenos galhos).
      NOTA: Colete o material do herbário separadamente da casca usada em procedimentos experimentais. Prensa e seca o material vegetal usando técnicas padrão de herbário, monte espécimes voucher e deposite-os em um herbário reconhecido para garantir a rastreabilidade.
2. Coleta de casca
   1. Colete a casca do tronco da árvore S. adstringens nos estágios 31–39 do BBCH (Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt e Chemische Industrie), correspondentes à fase de crescimento vegetativo conforme descrito em estudos fenológicos anteriores^16,17.
      NOTA: Armazene o material coletado em um saco escuro para evitar a degradação dos metabólitos secundários e evitar a degradação dos metabólitos secundários.
3. Determinação de umidade
   1. Pese as amostras de casca usando uma balança analítica. Divida o material em três réplicas e registre os pesos iniciais.
   2. Coloque as amostras de casca em um forno a 105 °C. Seque as amostras até que atinjam um peso constante.
      NOTA: Peso constante é alcançado quando duas medições consecutivas diferem em no máximo 1 mg, indicando a remoção completa da umidade.
   3. Retire as amostras do forno, deixe esfriar até a temperatura ambiente e registre o peso final. Calcule o teor de umidade e a matéria seca usando as seguintes equações:
      
      Matéria seca (%) = 100 - Umidade (%)
      Onde:
      W1 = peso do recipiente vazio
      W2 = peso do recipiente + amostra antes da secagem
      W3 = peso do recipiente + amostra após a secagem

2. Preparação do extrato

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo materiais perigosos foram conduzidos de acordo com as diretrizes de segurança química reconhecidas^{internacionalmente 18}.

1. Enxágue a casca recém-coletada com água corrente para remover o solo, poeira e impurezas superficiais.
2. Coloque as amostras de casca em um forno a 36 °C por 72 horas. Moa a casca seca usando um moinho de facas para obter um pó fino.
3. Pese 200 g de casca em pó e transfira para um frasco Erlenmeyer. Adicione 1000 mL de etanol 98%.
   ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável. Manuse-se longe das fontes de ignição e trabalhe em um local bem ventilado.
4. Sele o frasco e mantenha-o em temperatura ambiente por 72 horas, protegido da luz. Agite a mistura a cada 24 horas.
5. Filtre o extrato primeiro através de uma malha metálica e depois pelo algodão usando um funil para remover os resíduos residuais.

3. Avaliação da atividade antioxidante

1. Prepare uma solução de 100 mM DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) em metanol.
   ATENÇÃO: O metanol é tóxico e altamente inflamável. Manuse-se em uma exaustão e use equipamentos de proteção individual adequados. O DPPH é irritante e pode ser prejudicial se inalado ou ingerido. Evite contato direto e inalação.
   NOTA: Proteja a solução da luz realizando o ensaio em condições de pouca luz e tenha cuidado com o manuseio de metanol e DPPH, sempre realizando-os com luvas.
2. Dilua o extrato de casca etanolica de S. adstringens no metanol para obter concentrações que variam de 0,1% a 5% (v/v). Prepare soluções de vitamina C nas mesmas concentrações do controle positivo.
3. Dispense 100 μL de solução DPPH em cada poço de uma placa de 96 poços.
4. Adicione 50 μL de extrato ou solução de vitamina C em cada poço.
   NOTA: Use DPPH + metanol como controle negativo e metanol sozinho como o branco. Realize todas as medições em quadruplicate.
5. Incube o prato por 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
6. Meça a absorção a 515 nm usando um espectrofotômetro.
7. Calcule a atividade de saqueo radical usando a seguinte equação:
   
   Onde:
   Controle ABS = absorção de DPPH + metanol
   Amostra ABS = absorção de DPPH + extrato

4. Análise de viabilidade celular

1. Cultive fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina. Mantenha as células a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Seme as células em placas de 96 poços a 3 × 10⁴ células/poço e incube por 24 horas.
3. Substitua o meio por 100 μL de meio fresco e adicione 50 μL de solução extrata. Incubar por 24 horas.
4. Remova o meio e adicione 10 μL de solução MTT a cada poço. Incube por 4 horas para permitir a formação do formazan.
   ATENÇÃO: O reagente MTT é tóxico e deve ser manuseado com luvas e equipamentos de proteção adequados. Evite contato visual com pele.
5. Adicione 60 μL de solução de solubilização (HCl em isopropanol) para dissolver os cristais.
   ATENÇÃO: O ácido clorídrico é corrosivo e pode causar queimaduras graves. Manuseie com equipamentos de proteção apropriados e trabalhe em uma exaustão exaustiva. O isopropanol é inflamável e deve ser manuseado longe das fontes de ignição em uma área bem ventilada.
6. Meça a absorvância a 540 nm usando um espectrofotômetro.
   NOTA: Os ensaios de viabilidade celular foram realizados com grupos controle tratados e não tratados, com cada condição analisada em poços quadruplicados.
7. Calcule a viabilidade da célula usando:
   Viabilidade da célula (%) = (Extrato de Amostra ABS/Controle de Células ABS) x 100
   Onde:
   Controle de Células ABS = absorção de poços de controle não tratados contendo apenas células e meio de cultivo.
   Extrato de Amostra ABS = absorção de poços contendo células tratadas com extrato da planta.

5. Síntese verde de nanopartículas de magnésio

1. Adicione 9890 μL de água destilada a um tubo de reação estéril.
2. Adicione 100 μL de extrato vegetal.
3. Adicione 10 μL de 1 M MgCl₂ para obter uma concentração final de 10 mM.
   ATENÇÃO: Cloreto de magnésio pode causar irritação. Manuseie com equipamentos de proteção adequados e evite contato com olhos e pele.
   NOTA: A reação base consiste em extrato de 1% (v/v) + 10 mM de MgCl₂ em um volume total de 10 mL. Para otimizar a formação de NP, a concentração do extrato pode ser ajustada mantendo o volume final e a concentração de MgCl₂.
4. Misture bem para homogeneizar a solução.
5. Incube a 75 °C por 18 horas.
   ATENÇÃO: Temperaturas elevadas podem causar queimaduras. Use equipamentos de proteção adequados ao manusear amostras aquecidas.
   NOTA: Uma mudança de cor pode indicar formação de nanopartículas.
6. Deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente antes de caracterizar.

6. Caracterização de nanopartículas

1. Espalhamento dinâmico da luz (DLS)
   1. Transfira ~750 μL de suspensão de nanopartículas para uma célula de medição.
   2. Coloque a célula no instrumento e realize medições a 25 °C.
   3. Adquira dados de tamanho de partículas usando um modo de detecção apropriado.
   4. Analise cada amostra em triplicado com cinco sub-execuções por medição.
2. Microscopia de força atômica (AFM)
   1. Deposite 10 μL de suspensão de nanopartículas sobre mica recém-clivada.
   2. Seque a amostra em um dessecador por 2 horas.
   3. Enxágue suavemente a folha de mica três vezes com 20 μL de água destilada filtrada. Retorne a amostra ao dessecador e deixe secar em temperatura ambiente por mais 2 horas.
      NOTA: Enxaguar remove o excesso de sais e melhora a qualidade da imagem.
   4. Configure o microscópio de força atômica realizando a configuração do instrumento e o alinhamento do laser conforme as instruções do fabricante. Adquira imagens de superfície dos NPs com área de varredura de 500 × 500 milhas náuticas.
      NOTA: O AFM é usado para avaliar qualitativamente a rugosidade da superfície e visualizar as características morfológicas dos MgNPs sintetizados a partir de S. adstringens, gerando imagens superficiais tridimensionais de alta resolução.

7. Formulação de nano-fitocosméticos

1. Fase aquecida
   1. Pese 29,7 g de água purificada, 0,50 g de hidroxietilcelulose (HEC) e 3 g de glicerina em recipientes separados.
   2. Coloque a água em um agitador magnético e aqueça a 70–75 °C com uma mistura suave.
   3. Adicione o HEC gradualmente à água aquecida enquanto mexe para evitar que formem grumos.
      NOTA: A hidratação pode levar de 15 a 30 minutos.
   4. Adicione glicerina e misture até ficar homogêneo.
2. Fase de resfriamento
   1. Em béqueres separados, pesam 30 g de água purificada, 3 g de niacinamida, 33,3 g de MgNPs sintetizados a partir de S. adstringens, 0,3 g de ácido hialurônico de baixo peso molecular e 0,2 g de álcool benzílico e ácido desidroacético para formar a fase de resfriamento.
   2. Dissolva a niacinamida completamente em água em temperatura ambiente.
   3. Adicione ácido hialurônico e misture até ficar uniforme.
   4. Adicione S. adstringens MgNPs e misture suavemente.
   5. Adicione conservante e misture.
3. Mixagem
   1. Resfrie a fase aquecida a ~40 °C.
   2. Adicione a fase de resfriamento lentamente à fase aquecida enquanto mexe.
   3. Meça o pH da formulação. Para formulações séricas contendo niacinamida, um pH alvo de 5,0–6,5 é apropriado.
      NOTA: A niacinamida é estável entre pH neutro e levemente ácido. Use pequenas quantidades de ácido cítrico ou hidróxido de sódio para ajustar o pH, se necessário.

8. Avaliação de estabilidade estética

1. Estabilidade preliminar (12 dias)
   1. Prepare quatro amostras replicadas do soro cosmético em recipientes selados.
   2. Submeta as amostras a seis ciclos consecutivos de congelamento-descongelamento. Armazene as amostras a 50 °C por 24 horas e depois a −5 °C por 24 horas, completando um ciclo completo a cada 48 horas.
   3. Após cada ciclo, registre as características organolépticas inspecionando visualmente a formulação para detectar mudanças na aparência, cor, odor e separação de fases.
   4. Meça o pH das quatro amostras em temperatura ambiente, usando um medidor de pH digital calibrado. Determine a viscosidade usando um viscosímetro rotacional conforme as instruções do fabricante do equipamento.
      NOTA: Variações ≤10% são aceitáveis. Mudanças que ultrapassam esse limite podem indicar instabilidade na formulação e devem ser investigadas mais a fundo. Se a formulação passar no estudo preliminar, realizar um ensaio acelerado de estabilidade.
2. Estabilidade acelerada (90 dias)
   1. Prepare oito amostras da formulação cosmética. Armazene quatro amostras a 50 °C e quatro a 4 °C.
   2. Avalie em 0, 1, 7, 15, 30, 60 e 90 dias.
   3. Avalie e registre as características organolépticas inspecionando visualmente a formulação em busca de mudanças na aparência, cor, odor e separação de fases.
   4. Meça o pH das amostras em temperatura ambiente, usando um medidor digital calibrado. Determine a viscosidade usando um viscosímetro rotacional conforme as instruções do fabricante do equipamento.
      NOTA: A avaliação de estabilidade foi realizada de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Agência Brasileira de Vigilância da Saúde¹⁹. Nos Estados Unidos, o teste de estabilidade segue as recomendações da^{FDA 20}. Na União Europeia, a avaliação de estabilidade está em conformidade com o Regulamento (CE) nº 1223/2009²¹, que exige a inclusão de um Relatório de Segurança de Produtos Cosméticos (CPSR). O Anexo I deste regulamento exige dados documentados de estabilidade para apoiar a segurança e a vida útil da formulação cosmética, com testes geralmente realizados de acordo com a diretriz harmonizada ISO/TR 18811:2018²², "Diretrizes sobre testes de estabilidade de produtos cosméticos".

Resultados

O processo de secagem da casca das plantas é uma etapa crucial para preservar compostos bioativos e garantir sua aplicabilidade nas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmecêutica. Por outro lado, a secagem inadequada pode levar a escurecimento excessivo, perda de aroma, contaminação microbiana e degradação de compostos bioativos, comprometendo assim a qualidade da casca crua. A Tabela 1 resume os critérios usados para distinguir material vegetal corretamente e mal s...

Discussão

O protocolo apresentado aqui descreve um fluxo de trabalho reprodutível para a síntese verde de MgNPs usando extrato de S. adstringens e sua incorporação em uma formulação de soro nanofitocosmético. Vários passos são críticos para garantir resultados confiáveis. Primeiro, a coleta e documentação do material vegetal deve ser cuidadosamente padronizada, incluindo o registro preciso de coordenadas geográficas, condições ambientais e estágio fenológico, já que a variabilidade na fis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 96 poços	Sigma-Aldrich	M0812	Ensaios celulares
Álcool benzílico & Ácido desidroacético	Sigma-Aldrich	1,09,626	Conservante
Tubos centrífugas (15 mL / 50 mL)	Falcão (Corning)	430766	Manuseio de amostras
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C0759	Ajuste do pH
Incubadora CO2	ThermoFisher Scientific	3110	Incubadora CO2 usada para cultura celular
Material de filtro de algodão	Fornecedor local	LH R/260	Filtração
Dessecador	merck	BAF424002141	Secagem
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)	Sigma-Aldrich	D9132	Ensaio antioxidante
Forno de secagem	Nova & Eacute; TICA	400/5NDR	Forno para secagem de material vegetal
Forno fácil	SolidSteel	SSE-85L	Forno usado para ensaios de estabilidade estética
Frascos Erlenmeyer 1000 mL	VIDROLABOR	76200B01000	Extração
Etanol (98%)	Dinamica-Quimica contemporanea	P.10.0051.015.36	Solvente de extração
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher)	ES-009-C	Suplemento
Freezer	Gelopar	GTPC-575	Freezer usado para ensaios de estabilidade
Glicerina	Bottica botanika	TBV084.003904.086	Humectant
Ácido hialurônico (baixo peso molecular)	Bottica botanika	J201220136	Agente hidratante
Ácido clorídrico (HCl)	Sigma-Aldrich	1,00,317	Solubilização de MTT
Hidroxietilcelulose (HEC)	Bottica botanika	AH230641697	Espessante
Isopropanol	Sigma-Aldrich	100995	Solubilização de MTT
Moinho de Facas	7LAB	920Willye 4 vezes; 4 Lâminas	Moendo folhas, raízes, sementes e tubérculos
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	1,01,872	Síntese de nanopartículas
Agitador magnético e traço; Placa elétrica	IKA	5030000	Mixagem
Metanol	Sigma-Aldrich	900641	Ensaio DPPH
Folhas de mica	ThermoFisher Scientific	NC9655733	Preparação para AFM
Leitor de microplacas	ThermoFisher Scientific	Multiskan GO 1510-03581	Leitor de microplacas
Reagente MTT	Sigma-Aldrich	CT01-5	Ensaio de viabilidade celular
Células NHDF	BCRJ	0089	Fibroblastos dérmicos humanos
Niacinamida	Bottica botanika	211847	Ingrediente ativo
Forno	Termo Scientific	PR305225M	Secagem
Penicilina– Estreptomicina	Gibco (Thermo Fisher)	15140122	Antibiótico
Phmeter	Digimed	DM-220	Usado para monotorar pH em ensaios de estabilidade
Pipetas e pontas	Eppendorf	30078551	Manuseio de líquidos
Água purificada/destilada	Merck (Milli-Q)	ZIX7010T0C	Uso geral
Geladeira	Metalfrio	VB40W	Refrigerador usado para ensaios de estabilidade
Viscosível rotativo	Novotest	VISC-5SA	Usado para medir visosidade em ensaios de estabilidade
RPMI-1640 médio	Gibco (Thermo Fisher)	11875093	Cultura celular
Escala	Engenharia BEL	HPBG-2285	Balança para pesar materiais
Microscópio de Sonda de Varredura	SHIMADZU	SPM-9700HT	AFM, Microscópio de sonda de varredura
Hidróxido de sódio (NaOH)	Dinamica-Quimica contemporanea	P.10.0594.024.00	Ajuste do pH
Espectrofotômetro	ThermoFisher Scientific	A51119700C	Absorção
Vitamina C (ácido ascórbico)	Sigma-Aldrich	PHR1008	Controle positivo
Zetasizer Pro	Malvern Panalytical	Zetasizer Pro	Para espalhamento dinâmico da luz e tamanho zeta-