Artigo de método

Reprogramação de Linhagens de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas a partir de Amostras de Buffy Coat Congeladas

DOI:

10.3791/70522

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10 de abril de 2026

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

Neste artigo

Resumo

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O protocolo atual detalha etapas para a resolução de problemas na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de amostras de pacientes que têm sido difíceis de reprogramar seguindo as instruções do fabricante. Esse protocolo é específico para amostras congeladas de camada buffy, mas também pode ser aplicado à reprogramação de PBMCs purificados.

Resumo

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As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são uma ferramenta valiosa para modelagem de doenças. Outras células-tronco podem ser reprogramadas a partir de células somáticas adultas, chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). A tecnologia iPSC permite a avaliação de participantes e populações específicas do estudo e se aventura na medicina personalizada. Sangue é rotineiramente coletado e criopreservado para fins de pesquisa. Essas amostras são processadas tanto como camadas buffy, uma amostra de sangue contendo glóbulos brancos e plaquetas, quanto como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), que representam uma população mais purificada de glóbulos brancos sem eosinófilos, basófilos, plaquetas ou glóbulos vermelhos. Ambos são uma fonte facilmente disponível e relativamente não invasiva para células somáticas reprogramáveis. Vários relatos detalham a reprogramação a partir de PBMCs, enquanto apenas um descreve esse processo a partir de brisas congeladas. Experiências recentes revelaram que protocolos de reprogramação PBMC disponíveis na literatura e dos fabricantes não têm sucesso quando aplicados a amostras congeladas de buffy coat, exigindo as adaptações e estratégias de solução de problemas descritas aqui. Para muitos pesquisadores que utilizam tecnologias iPSC, é imprescindível ter protocolos completos com alta taxa de sucesso, especialmente em casos em que amostras de pacientes podem conter poucas células, são obtidas em intervalos de tempo amplos, provenientes de um grupo limitado de participantes ou são altamente valiosas. Aqui, pontos de verificação e estratégias de solução de problemas são identificados para aumentar a chance de reprogramar brisas congeladas humanas ou PBMCs purificados. Em última análise, esse protocolo permitirá que os pesquisadores identifiquem preditores de sucesso da reprogramação e elaborem estratégias alternativas para melhorar as chances de derivação bem-sucedida de iPSC.

Introdução

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A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) é uma fonte de células humanas facilmente escalável e renovável que pode ser diferenciada em qualquer tipo celular do corpo, permitindo que pesquisadores investiguem tipos celulares e de tecidos difíceis de obter ou inacessíveis em pacientes. Além disso, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem ser derivadas diretamente das células somáticas do paciente1. Isso permite a diferenciação de tipos celulares específicos de cada paciente de interesse, uma ferramenta inestimável para modelagem de doenças e descoberta de medicamentos. Assim, métodos rigorosos, reprodutíveis e bem-sucedidos para reprogramar células somáticas em iPSCs são críticos.

Fibroblastos, células urinárias e célulassanguíneas 2,3, cada uma com suas próprias limitações, estão entre as fontes de células somáticas mais frequentemente usadas para a derivação de iPSC. Fibroblastos, historicamente a escolha mais popular parareprogramação 3, não são facilmente obtidos, exigindo uma biópsia de pele um tanto invasiva. Células reprogramáveis podem ser derivadas de amostras de urina, que são fáceis de obter e não invasivas, mas o processo de reprogramação deve começar com amostras frescas até 48 horas após acoleta 4. O sangue oferece uma ótima fonte de células reprogramáveis, pois é minimamente invasivo de obter e facilmente disponível. Existem muitos protocolos de reprogramação disponíveis a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), células sanguíneas com um único núcleo, incluindo linfócitos, monócitos e células naturalkiller 5. Como as PBMCs são menos densas que outras células sanguíneas, elas podem ser isoladas/purificadas de amostras de sangue inteiro recém-isoladas por centrifugação com gradientede densidade 5. Alternativamente, ao centrifugar, o sangue total se separa em três camadas distintas: plasma, camada buffy e glóbulosvermelhos 6. As pelagens buffy contêm PBMCs, além de plaquetas e alguns eritrócitos. No entanto, PBMCs são menos facilmente encontrados na maioria dos biobancos, enquanto os de sangue total ou de pele buffy são abundantes e acessíveis7. Apesar da disponibilidade de Buffy Coats em biobancos e da presença de PBMCs reprogramáveis nessas amostras, pouquíssimos protocolos detalham reprogramação a partir de Buffy Coats8 congelados, deixando esse recurso inexplorado.

Atualmente, existem muitos protocolospublicados 1,8,9 e kitscomercialmente disponíveis 10 para agilizar a reprogramação; No entanto, eles não investigam profundamente como maximizar o sucesso para células doadoras de pacientes que são difíceis de reprogramar. É geralmente aceito que algumas células simplesmente não reprogramam, e quando isso acontece, muitos pesquisadores podem tentar com outro tipo de célula doadora ou com outro paciente. No entanto, isso pode não ser uma opção viável para muitos pesquisadores ou populações de pacientes. Diferentemente dos protocolos8 e 9 publicados anteriormente, este protocolo inclui um guia com pontos de verificação e critérios, com base para prever o sucesso da reprogramação, e adota uma abordagem única ao purificar as camadas buffy congeladas com centrifugação por gradiente de densidade ao descongelar.

O processo começa com a coleta de sangue de indivíduos escolhidos e o isolamento de PBMCs ou de pelagem buffy. Para novos experimentos, isso provavelmente incluirá o recrutamento de novos doadores que farão coletas de sangue frescas sob aprovação do IRB e com o devido consentimento necessário. O próximo passo é a expansão das células somáticas, na qual células sanguíneas congeladas são descongeladas e cultivadas sob condições que promovem a proliferação de células-tronco hematopoiéticas e progenitores eritroides, as células sanguíneas que são as melhores candidatas parareprogramação 11. Após 10–14 dias, as células devem estar prontas para reprogramação, como evidenciado por uma morfologia distinta que não é discutida em protocolos anteriores, e são então transduzidas por inoculação com um vírus Sendai portador dos fatores Yamanaka Oct4, Sox2, c-Myc e Klf41. Após a transdução, as células começarão a expressar os fatores de transcrição Yamanaka e retornarão a um estado pluripotente, novamente denotado por uma mudança morfológica distinta e proliferação em colônias de células-tronco. Colônias emergentes são então colhidas individualmente, expandidas e criopreservadas. Após dez trechos, a caracterização por confirmação da expressão dos marcadores de caule e do potencial de diferenciação nas três camadas germinativas valida uma linha iPSC reprogramada com sucesso.

Esse protocolo funciona melhor para casacos buffy crioppreservados, que foram armazenados por < 1 mês, ou PBMCs crioppreservados armazenados por até 2 anos com pelo menos 1 milhão de células viáveis ao descongelar. No entanto, os checkpoints descritos podem ajudar a orientar a resolução de problemas da reprogramação a partir de qualquer amostra de sangue de qualidade. Além disso, detalhes sobre adaptação de iPSCs reprogramados para condições sem alimentadores podem ser aplicáveis a qualquer fluxo de trabalho de reprogramação de iPSC, independentemente do tipo de célula somática inicial.

Esse protocolo, estabelecido por meio de solução de problemas prática, detalha a reprogramação de iPSCs a partir de camadas buffy congeladas e identifica indicadores morfológicos do sucesso da reprogramação, fornecendo um guia viável para reprogramar amostras difíceis. Em última análise, implementar essas estratégias resulta em conservação de tempo, dinheiro, reagentes e amostras.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade da Geórgia. Todos os estudos com sujeitos humanos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque da Associação Médica Mundial. Com base no auto-relato, os voluntários não sofreram das seguintes doenças: fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica, tuberculose, asma, diabetes ou infecções agudas nas vias aéreas. Voluntários entre 18 e 50 anos e de ambos os sexos foram recrutados. As gestantes foram excluídas do estudo.

1. Extração e criopreservação por capa buffy ou PBMC

Critérios de decisão: Se as amostras permanecerão armazenadas por muito tempo, é melhor escolher a opção 2. Se os reagentes para purificação de PBMC não estiverem disponíveis, ou se as amostras forem armazenadas por um curto período, a opção 1 é adequada.

  1. Opção 1: Extração do Pelo Buffy
    1. Realize uma flebotomia (punção da veia para coletar sangue) conforme as melhores práticasda OMS 12 e retire 7–10 mL de sangue total em tubos de coleta revestidos com anticoagulantes. Mantenha as amostras no gelo.
    2. Transfira 7–10 mL de sangue total para um tubo cônico de 15 mL. Centrifuge o sangue usando uma centrífuga de balde oscilante a 200 x g por 15 minutos a 4 °C com os freios desligados. Isso deve formar 3 camadas com plasma amarelo no topo, a camada branca de pelagem bege no meio e os eritrócitos vermelhos na base.
    3. Colete o plasma usando uma pipeta sorológica estéril sem perturbar a camada buffy. Descarte o plasma. Transfira a camada branca de camada buffy para um tubo cônico novo de 15 mL (aproximadamente 1–2 mL).
      ATENÇÃO: Descarte o plasma na lixeira de resíduos bioperigosos apropriada.
      NOTA: Alguma contaminação por plasma da pelagem buffy é aceitável, pois ajuda na recuperação após o descongelamento.
    4. Adicione DMSO à camada buffy de modo que a composição final seja 10% DMSO v/v e congele em criovial (1 mL/frasco) a -80 °C imediatamente. No dia seguinte, mova os frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
      NOTA: Por exemplo, para 2 ml de camada buffy, adicione 200 μl de DMSO, misture bem e depois aliquota em 2 frascos. Isso normalmente resulta em 1–3 frascos congelados por amostra.
  2. Opção 2: Purificação com PBMC
    1. Realize uma flebotomia (punção da veia para coletar sangue) conforme as melhores práticasda OMS 12 e retire 7–10 mL de sangue total em tubos de coleta revestidos com anticoagulantes. Mantenha as amostras no gelo.
    2. Adicione 4 mL de solução gradiente de densidade 1 em um tubo cônico novo de 15 mL. Cuidadosamente coloque 4 mL de sangue sobre a solução 1 do gradiente de densidade.
    3. Centrifuge usando uma centrífuga de balde oscilante a 400 x g em RT por 30 minutos, desligando os freios. Isso resultará em plasma na camada superior, PBMCs na camada intermediária e o restante do sangue na camada inferior.
    4. Recolha a fração de PBMC em um tubo cônico novo de 15 mL, depois lave 2–3 vezes com 1x PBS, centrifugando em uma centrífuga de balde oscilante a 350 x g em RT por 5 minutos com o freio acionado. Descarte o supernadante. Para pular a criopreservação e iniciar imediatamente a reprogramação, prossiga para a etapa 2.3.4.
      ATENÇÃO: Descarte o sobrenadante na lixeira de resíduos bioperigosos apropriada.
    5. Resuspenda o pellet em meio criopreservação (90% soro e 10% DMSO) e congele em criovial (1 mL/frasco) a -80 °C imediatamente. No dia seguinte, mova os frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
      NOTA: Tubos de coleta de sangue isolando PBMC podem ser usados em vez da centrifugação por gradiente de densidade para purificação PBMC a partir de sangue fresco. Também é possível criopreservar usando meios alternativos de congelação comercialmente disponíveis. O rendimento típico é de 1 a 4 frascos congelados por amostra.

2. Preparar amostras para expansão celular somática

  1. Preparação para a mídia
    1. Prepare a Mídia de Expansão (EM)9 alicitando 45 mL de base EM. Adicione 127,8 μL de ácido L-ascórbico (50 μg/mL de estoque de 100 mM) e 450 μL de penicilina-estreptomicina (100 vezes de estoque).
    2. Preparar EM + citocinas13 a 4 ml EM, adicionar 2 μL fator de células-tronco (SCF) (50 ng/mL de estoque de 100 μg/ml), 2 μL de interleucina-3 (IL-3) (10 ng/mL de estoque de 20 μg/mL), 16 μL de eritropoietina (EPO) (2 U/mL de estoque de 500 U/mL), 4 μL fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1) (40 ng/mL de estoque de 40 μg/ml), e 4 μL de dexametasona (1 μM a partir de estoque de 1 mM). Use EM + citocinas no mesmo dia em que for preparado.
      NOTA: Sistemas alternativos de meios comerciais de expansão podem ser utilizados.
  2. Opção 1: Purificação PBMC do Frost Buffy Coat
    Critérios de decisão: se a opção 1 do passo 1 foi escolhida (ou seja, extração da camada buffy), então escolha a opção 1 na etapa 2 (ou seja, purificação PBMC a partir da camada buffy congelada).
    1. Recupere a solução do gradiente de densidade 2 e deixe chegar à temperatura ambiente. Misture bem invertendo a garrafa. Transfira assépticamente a solução 2 do gradiente de densidade de 3 mL para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Prepare outro tubo cônico de 15 mL com 12 mL de soro tampão fosfatado Dulbecco (DPBS).
    3. Recupere o frasco de camada buffy congelada do nitrogênio líquido. Deixe no gelo até estar pronto para descongelar. Descongele suavemente a amostra girando em banho-maria a 37 °C. Remova quando restar apenas um pequeno cristal de gelo.
    4. Transfira cuidadosamente (gota a gota) o conteúdo do frasco para o tubo cônico contendo DPBS. Enxágue o frasco com 1 mL de DPBS e adicione ao tubo cônico contendo as células recuperadas.
    5. Centrífuga usando uma centrífuga de balde oscilante a 200 x g em RT por 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 4 mL de DPBS com soro fetal bovino (FBS) a 1%.
    6. Coloque suavemente a mistura de camada buffy sobre a solução de gradiente de densidade, tomando cuidado para não permitir a mistura. Centrífuga em uma centrífuga de balde oscilante a 800 x g por 20 minutos em RT com o freio desligado.
    7. Com uma pipeta, remova e descarte a camada superior de plasma sem perturbar a interface plasma:gradiente. Com um pipet, remova a camada PBMC na interface (Figura 1A) e transfira para um tubo limpo de 15 mL.
      ATENÇÃO: Descarte as outras camadas na lixeira de resíduos bioperigosos apropriada.
    8. Lave os PBMCs com 3 mL EM centrifugando a 200 x g por 10 minutos em RT. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL EM + citocinas. Placa em 1 poço de uma placa de 12 poços.
    9. Coloque a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e 20% deO2.
  3. Opção 2: Descongelar PBMCs congelados
    Critérios de decisão: se a opção 2 do passo 1 foi escolhida (ou seja, purificação com PBMC), ou se houver preocupação de que as pelagens buffy congeladas terão baixa viabilidade (ou seja, armazenadas por mais de 1 mês) (Figura 1B), então escolha a opção 2 na etapa 2 (ou seja, descongelar PBMCs congelados).
    1. Prepare um tubo cônico de 15 mL com 12 mL de DPBS.
    2. Retire o frasco de PBMCs congelados do nitrogênio líquido. Deixe no gelo até estar pronto para descongelar. Descongele suavemente a amostra girando em um banho-maria a 37 °C. Remova quando restar apenas um cristal pequeno.
    3. Transfira cuidadosamente (gota) o conteúdo do frasco para o tubo cônico. Certifique-se de retirar todas as células do frasco enxaguando o frasco com 1 mL de DPBS.
    4. Centrífuga em uma centrífuga de balde oscilante a 200 x g em RT por 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet (Figura 1C) em 2 mL EM, depois tome 10 μL para realizar o teste de exclusão do azul de tripano para verificar a viabilidade celular e obter a contagemcelular 14.
      ATENÇÃO: Descarte o sobrenadante na lixeira de resíduos bioperigosos apropriada.
    5. Placa 1,0 x 106–2,0 x 106 células/mL em 2 mL EM + citocinas em um poço de uma placa de 12 poços. Coloque a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e 20% deO2.

3. Expansão celular somática (1 dia após o descongelamento)

  1. Remova cuidadosamente 1 mL de meio gasto de cada poço. O meio gasto pode ser coletado em outro poço ou tubo centrífuga e verificado para garantir que nenhuma célula foi perdida.
  2. Substitua o meio gasto por 1 mL de EM + citocinas frescas.
  3. Repita os passos 3.1 e 3.2 e tire fotos dos PBMCs dia sim, dia não, até que uma mudança significativa na morfologia seja observada, com células brilhantes e redondas de tamanho grande e pequeno (Figura 2A, seta laranja e azul, respectivamente), que são os eritroblastos, o tipo celular a ser reprogramado. Isso leva cerca de 10 a 14 dias.
    NOTA: Células que não apresentam essas morfologias, normalmente sem as células arredondadas maiores (Figura 2B), provavelmente não reprogramam com sucesso e podem estar mortas (Figura 2C).

4. Transdução (10–14 dias após o descongelamento)

  1. Prepare o Vírus Sendai
    1. Usando o valor do título específico do lote, calcule o volume de cada vírus necessário para a transdução de 2,0 × 10células 5 usando KOS: c-Myc: Klf4 com multiplicidade de infecção (MOI) de 5:5:3, conforme recomendado pelo fabricante. A equação para esse cálculo pode ser encontrada nos documentos do produto fornecidos pelo fabricante.
    2. Retire os vírus do freezer, mantendo-os no gelo até a hora de descongelar. Um a um, descongele suavemente os vírus girando em um banho-maria a 37 °C.
    3. Prepare alíquotas nas quais os três vírus estejam misturados no volume apropriado para a transdução de 2,0 × 105 células em MOIs de 5:5:3. Congele as aliquotas a -80 °C até estarem prontas para uso.
      ATENÇÃO: Certifique-se de descolorir cuidadosamente todos os resíduos que entraram em contato com o Vírus Sendai.
      NOTA: As instruções do fabricante recomendam uma contagem real de células com cálculo do MOI para determinar o volume de vírus adicionado, mas a aproximação de 2,0 ×10,5 foi bem-sucedida para os fins deste protocolo. A aliquotação pode ser mais econômica e reduz a quantidade de ciclos de congelamento/descongelamento para vírus.
  2. Dia da Transdução (d0)
    1. Se os PBMCs não foram alimentados no dia anterior, remova 1 mL de substrato gasto e substitua por 1 mL de EM + citocinas frescas. Descongele o vírus aliquota no gelo, depois adicione diretamente ao poço, gire o meio de ação.
    2. Envolva a placa em parafilme e centrifuge a placa em uma centrífuga de balde oscilante a 350 x g em RT por 90 minutos. Coloque a placa na incubadora a 37 °C, 5% deCO2 e 20% deO2 durante a noite.
      ATENÇÃO: Certifique-se de descolorir cuidadosamente todos os resíduos que entraram em contato com o Vírus Sendai.
  3. 1 dia após a transdução (d1)
    1. Recolha as células em um tubo cônico de 15 mL. Enxágue bem com 2 mL de EM e verifique ao microscópio que todas as células foram coletadas. Centrifuge as células a 300 x g em RT por 10 minutos.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda 2 mL EM + citocinas. Coloque em um poço fresco de uma placa de 12 poços e retorne a placa à incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e 20% deO2.
      ATENÇÃO: Certifique-se de alvejar cuidadosamente todos os resíduos que tiveram contato com o Vírus Sendai.

5. Replacar as células transduzidas em células alimentadoras

  1. Preparar a célula alimentadora
    1. Para 43,5 mL, o meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco adiciona 5 mL de FBS (concentração final de 10%), 0,5 mL solução mínima de aminoácidos não essenciais (MEM-NEAA) (a partir de 100x o estoque), 50 μL de 2-mercaptoetanol (55 μM a partir de estoque de 55 mM) e 0,5 mL de antibiótico-antimicoótico (a partir de 100x o estoque).
    2. Prepare placas de 6 poços revestidas com gelatina adicionando 600 μL de gelatina (0,1% a partir de 2% do estoque) a 12 mL de DPBS e distribuindo 2 mL por poço. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos.
    3. Retirar frascos congelados de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) irradiados e descongelar suavemente girando em banho-maria a 37 °C.
    4. Adicione gota a gota a tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de DPBS e enxágue o frasco com mais 1 mL de DPBS. Centrifuge a 200 x g em RT por 5 minutos.
    5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda a célula em meio fibroblasto de 1 mL. Remova 10 μL para realizar o teste de exclusão do tripano azul para verificar a viabilidade celular e obter a contagemcelular 14.
    6. Remova a solução de gelatina das placas de 6 poços e place MEFs irradiados a 2,5 × 104 células/cm2. Incubar em incubadora a 37 °C, 5% deCO2 e 20%O2 por 6–48 horas.
      NOTA: As placas das células alimentadoras devem ser preparadas antes do re-placagem das células transduzidas. Os melhores resultados foram observados quando MEFs irradiados são incubados por cerca de 2 dias antes do re-placing, mas incubação por pelo menos 6 horas pode ser suficiente.
  2. Células Transduzidas de Replacagem
    1. Prepare meios iPSC 90 mL DMEM/F12 com 10 mL FBS (concentração final de 10%), 1 mL de mem-neaa (de 100x o estoque), 1 mL de L-glutamina (2 mM do estoque de 200 mM), 1 mL de penicilina-estreptomicina (do estoque 100x), 100 μL de 2-mercaptoetanol (55 μL do estoque de 55 mM) e 100 μL de fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) (10 ng/mL do estoque de 10 μg/mL). Adicione ácido L-ascórbico (50 μg/mL) fresco em cada alimentação.
    2. No terceiro dia após a transdução, colete todo o meio e células do poço transduzido em um tubo cônico de 15 mL. Enxágue bem com pelo menos 1 mL adicional de EM e centrifuge em uma centrífuga de balde oscilante a 300 x g em RT por 10 minutos.
    3. Resuspenda o pellet em mídia iPSC de 6 mL. Aspire o meio de 3 poços da placa com MEFs irradiados.
    4. Células transduzidas por placas para esses 3 poços de MEF irradiado (2ml/poço). Incubar em incubadora a 37 °C, 5% deCO2 e 20% deO2.

6. Manutenção até o surgimento da colônia

  1. Nos dias 4, 5 e 6 após a transdução, adicione 1 mL de meio iPSC fresco a cada poço a cada poço a cada dia. Isso limita a perturbação desnecessária das células recém-reprogramadas enquanto elas se depositam nos alimentadores, ao mesmo tempo em que lhes fornece nutrientes frescos.
  2. No sétimo dia após a transdução, remova toda a mídia antiga e substitua por 2 mL de mídia iPSC nova por poço. Continue alimentando com mídia iPSC dia sim, dia não, até que as colônias comecem a surgir.
  3. Prepare meios hES 78 mL de DMEM/F12 com 20 mL de suplemento livre de FBS (20%), 1 mL de mem-neaa (100x), 1 mL de L-glutamina (2 mM de estoque de 200 mM), 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 100 μL de 2-mercaptoetanol (55 μM de estoque de 55 mM) e 100 μL de FGF2 (10 ng/mL de estoque de 10 μg/ml). Adicione ácido L-ascórbico (50 μg/mL) fresco em cada alimentação.
  4. Uma vez que pequenas colônias começam a emergir, continue mantendo as células transduzidas alimentando-se dia sim, dia não, com meio hES (Figura 3A).
    NOTA: As colônias começarão a aparecer já 7 dias após a transdução. Se nenhuma colônia surgiu até três semanas após a transdução, é improvável que elas surjam algum dia.

7. Escolha colônias quando elas crescerem até um tamanho maior (Figura 3B)

NOTA: Às vezes, as células transduzidas passam por uma mudança morfológica que não resulta em uma colônia semelhante a células-tronco (Figura 3C). Isso não é considerado uma colônia que poderia levar a uma linha iPSC bem-sucedida.

NOTA: A partir da emergência da colônia, as linhas de iPSC precisarão ser adaptadas às condições preferidas de cultivo de hPSC do laboratório. Este protocolo demonstrará como as linhas de iPSC foram adaptadas a condições livres de alimentadores, cultivadas em placas revestidas com vitronectina (VTN), alimentadas com meios hPSC definidos quimicamente e comercialmente disponíveis. Se as colônias não estiverem se adaptando bem às novas condições, podem precisar de uma transição mais suave, como serem colhidas em células alimentadoras com substrato hES.

  1. Prepare as placas revestidas com VTN descongelando e misturando cuidadosamente o VTN. Para uma placa de 24 poços, prepare 12 mL de DPBS com 120 μL de VTN (5 μg/mL de material de 500 μg/mL) e distribua 0,5 mL de solução/poço de VTN. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  2. Prepare o médio hPSC descongelando 1 frasco de suplemento de hPSC a 4°C durante a noite. Depois de descongelar, adicione 10 mL de suplemento de hPSC a um frasco de 500 mL de médio basal de hPSC.
  3. Prepare as placas para a extração removendo a solução de VTN dos poços da placa de 24 poços e adicionando meio hPSC de 0,5 mL com 0,5 μL Y-27632 (10 μM a partir de material de 10 mM) a cada poço.
  4. Leve a nova placa, o de 6 poços contendo as células/colônias transduzidas, agulhas de seringa estéreis e uma pipeta p200 e pontas para um microscópio de dissecação em condições estéreis.
  5. Coloque a placa contendo as células transduzidas e as colônias emergidas no microscópio dissecante e use o microscópio para localizar uma colônia a ser escolhida. Levante a tampa da placa para expor o poço.
  6. Abra a seringa assépticamente e exponha a agulha. Guiada pelo microscópio, use a ponta da agulha para separar a colônia de quaisquer células alimentadoras ao redor, traçando o contorno da colônia com a agulha.
  7. Use a ponta da agulha para cortar a colônia em alguns pedaços de tamanho igual. Se as peças da colônia ainda não estiverem soltas da placa, use a lateral da agulha para raspá-las ou raspá-las da placa para que fiquem flutuando.
    ATENÇÃO: Descarte a agulha no recipiente apropriado para objetos cortantes.
  8. Com o p200, use o microscópio para realocar a colônia escolhida. Aspire a colônia flutuante com a pipeta e transfira para um poço da placa preparada de 24 poços. Tente colocar toda a colônia no poço sem receber outras colônias ou células alimentadoras.
  9. Coloque a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e 20% deO2.
  10. Alimente as colônias colhidas com 1 mL de meio hPSC todos os dias até que estejam em confluente.
    NOTA: Colônias têm potencial para serem geneticamente distintas umas das outras. Cada poço da placa de 24 poços deve conter apenas uma colônia escolhida. Cada colônia escolhida recebe um identificador distinto e, a partir daí, é tratada como uma linha celular diferente das outras colônias escolhidas. Para uma rodada rigorosa de reprogramação, escolha pelo menos 24 colônias e expanda e caracterize pelo menos 3.

8. Expandir

  1. Manutenção do hPSC
    1. As colônias colhidas estão prontas para se dividir quando são grandes e arredondadas com bordas brilhantes (Figura 4A). Colônias se quebram em vários pedaços quando colhidas. Se houver várias colônias em um mesmo poço, separe-as antes que cresçam o suficiente para se contarem e comecem a se diferenciar.
    2. Prepare uma placa de 6 poços revestida com VTN: Para uma placa de 6 poços, prepare 12 mL de DPBS com 120 μL de VTN (5 μg/mL de estoque de 500 μg/mL) e distribua 1 mL de solução/poço de VTN. Incube em temperatura ambiente por 1 hora. A solução de VTN pode ser substituída por DPBS e armazenada a 37 °C, 5% de CO2 por um mês. Nos poços que serão divididos, aspire DPBS e substitua por meio de 1 mL hPSC.
    3. Aspire o meio do poço para dividir, depois enxágue uma vez com 1 mL de DPBS. Aspire o DPBS e adicione 500 μL de tampão de dissociação de 0,5 mM EDTA (preparado em 500 mL DPBS com 0,9 g de NaCl e esterilizado com filtro)15. Incube a 37 °C, 5% de CO2 por 2 minutos, até que as colônias comecem a se soltar e as células dentro de cada colônia comecem a se juntar e se separar umas das outras.
    4. Remova a placa da incubadora, aspire o buffer de dissociação do EDTA. Usando uma pipeta p1000, colete as células com meio hPSC de 1 mL pipetando suavemente para cima e para baixo até que as colônias estejam totalmente destacadas e levemente fragmentadas. Transfira 1 mL de meio e células para o novo 6 poços contendo 1 mL de meio hPSC fresco. Essa primeira divisão é feita em uma proporção de divisão 1:1, todas as células da placa original são transferidas para a nova placa.
    5. Coloque as células na incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e 20%O2. Alimente iPSCs diariamente até que o poço esteja confluente e pronto para se dividir.
      NOTA: Morfologia pobre das células-tronco (Figura 4B) pode ser mitigada ajustando o protocolo de divisão, como a divisão mais cedo, o uso de um tempo de incubação EDTA mais curto ou o ajuste da razão de divisão.
    6. Expanda para um prato de 10 cm.
      1. Uma vez que as células estejam confluentes em cada poço das placas de 6 poços, recubra uma antena de 10 cm com VTN (7 mL DPBS com 70 μL VTN (5 μg/mL a partir de 500 μg/mL), incubada por 1 hora em RT).
      2. Repetir o protocolo de divisão, desta vez expandindo do poço 6 para o prato de cultura de tecido de 10 cm (razão de divisão 1:1). Use 7–10 mL de médio hPSC por prato de 10 cm.
      3. Uma vez que as células da antena de 10 cm estejam confluentes, repita esse processo de divisão (passagem). Em cada passagem, anote o número da passagem. A razão de divisão depende da morfologia e densidade celular. Uma proporção típica é 1:10, onde um décimo das células da placa original é transferido para a nova placa.
  2. Congelamentos e preparativos de estoque
    1. Após cerca de 3 passagens, expanda-se para quatro placas de cultura de tecido de 10 cm para estoques de passagem iniciais. Uma vez que as células dos pratos de 10 cm estão em confluente, elas estão prontas para serem congeladas.
    2. Prepare cryovials e coloque-os no freezer para esfriar. Certifique-se de que o rótulo inclua a linha celular, o clone, o número da passagem e a data do congelamento.
    3. Prepare meio congelante: 90% hPSC médio e 10% DMSO, você precisará de 1 mL/frasco (3 frascos congelados por recipiente de 10 cm).
    4. Execute o protocolo de divisão normalmente, usando um buffer de dissociação de 4 mL 0,5 mM EDTA para cada antena de 10 cm.
    5. Após a incubação do EDTA, aspire o EDTA. Adicione suavemente 10 mL de médio hPSC ao prato.
    6. Lave suavemente as células do recipiente pipetando o substrato. As células se soltam facilmente do chão do recipiente e se misturam no meio de ação. Pipete apenas 2 a 5 vezes para separar suavemente as colônias, mas evitar dissociação em células individuais.
    7. Centrifuge por 5 minutos a 200 x g em RT. Aspire o sobrenadante e ressuspenda a célula em meio congelante.
    8. Isole e congele imediatamente a -80 °C. Transfira os frascos congelados para o tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
    9. Congele mais estoques da mesma forma depois que a caracterização estiver concluída.

9. Caracterização dos iPSCs:

  1. Expressão dos marcadores de caule. Após expandir por pelo menos 10 passagens, quando as colônias em um poço de 24 estiverem prontas para ser divididas, fixe com 4% de paraformaldeído e colora por imunohistoquímica para o marcador de caule NANOG. Serão necessárias pelo menos 10 passagens para que as colônias sejam negativas para o Vírus Sendai (SeV), o que pode ser confirmado por imunofluorescência (Figura 4C).
  2. Capacidade de pluripotência de teste: Três Diferenciações da Camada Germantal. A pluripotência da iPSC é confirmada por diferenciação bem-sucedida em cada uma das três camadas germinativas. Cada diferenciação começa a partir de um prato confluente de 10 cm que apresenta boa morfologia hPSC (Figura 4A).
    1. Ectoderma16
      1. No dia anterior ao início da diferenciação (dia-1): Semear iPSCs em placas de 24 poços revestidas por matriz com densidade de 2,6 × 10células de 5 células/cm 2 polegadas em meio hPSC com Y-27632 (concentração final de 10 μM) e XAV-939 (concentração final de 2 μM).
      2. Dia 0–dia 1: Alimentar com 1 mL/base de diferenciação de poço com LDN (concentração final de 100 nM), SB (concentração final de 10 μM) e XAV (concentração final de 2 μM).
      3. Dia 2–Dia 7: Alimentar com 1 mL/base de diferenciação do poço com LDN (concentração final de 100 nM) e SB (concentração final de 10 μM). A partir do d3, alimente dia sim, dia não.
      4. Dia 8: fixar com 4% de paraformaldeído e colorir por imunohistoquímica para o marcador ectodermaPAX6 17 e confirmar a perda do marcador de pluripotência NANOG (Figura 4D).
    2. Mesoderma18:
      1. No dia anterior ao início da diferenciação (dia -1): Semear iPSCs em placas de 24 poços revestidas com matriz com densidade de 2,5 × 105 células/cm 2 polegadas em meio hPSC com Y-27632 (concentração final de 10 μM).
      2. Dia 0: Alimentar com DMEM/F12 com ácido L-ascórbico (concentração final de 64 μg/mL), selenito de sódio (concentração final de 13,6 ng/mL), holotransferrina (concentração final de 10 μg/mL), concentrado lipídico definido quimicamente (100x) e CHIR (concentração final de 5 μM).
      3. Dia 1: Alimentar com DMEM/F12 com ácido L-ascórbico (concentração final de 64 μg/mL), selenito de sódio (concentração final de 13,6 ng/mL), holotransferrina (concentração final de 10 μg/mL), concentrado lipídico definido quimicamente (100x) e heparina (concentração final de 0,6 U/mL).
      4. Dia 2: Fixar com 4% de paraformaldeído e colorar por imunohistoquímica para BRACHYURY-T19 e confirmar a perda do marcador de pluripotência NANOG (Figura 4E).
    3. Endoderm20
      1. No dia anterior ao início da diferenciação (dia -1): Semear iPSCs em placas de 24 poços revestidas por matriz com densidade de 1,0 × 105 células/cm 2 polegadas em meio hPSC com Y-27632 (concentração final de 10 μM).
      2. Dia 0–dia 4: No dia 0, lave com DPBS e alimente com RPMI com substituto da L-glutamina (100x), FBS (0,5% de concentração final) e Activina A (100 ng/mL de concentração final). A partir do d0, alimente diariamente com a mesma mídia.
      3. Dia 5: Fixar com paraformaldeído a 4% e colorir por imunohistoquímica para o marcador endodermático SOX1721 e confirmar a perda do marcador de pluripotência NANOG (Figura 4F).
        NOTA: As diferenciações foram feitas de acordo com protocolos previamente publicados. Na nossa experiência, revestimentos matriciais podem ser intercambiáveis.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sucesso desse protocolo pode ser acompanhado em várias etapas. A Tabela 1 oferece um resumo dos exemplos nos quais esse protocolo foi realizado. Amostras iniciais, que são ou pelagens buffy criopreservadas armazenadas por uma semana ou PBMCs criopreservadas, que apresentam boa qualidade de amostra após o descongelamento e a aparência morfológica distinta após a expansão celular foram reprogramadas com sucesso 6 das 7 vezes (Tabela 1, categoria 1). Duas...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tecnologia iPSC tem imenso potencial no campo biomédico no que diz respeito à descoberta de mecanismos de doenças, medicina personalizada e "ensaios clínicos em um prato"22,23. Protocolos eficientes e adaptáveis para reprogramação de iPSC a partir de amostras de sangue são fundamentais para desbloquear o grande potencial da tecnologia iPSC, pois são fáceis de coletar e frequentemente facilmente disponíveis em biobancos. Embora ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Declaramos que a pesquisa foi conduzida sem relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indivíduos humanos foram recrutados e receberam consentimento informado para doação de sangue de acordo com o protocolo IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 e Emory# 000002114. Pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do Instituto Nacional de Saúde sob o número de prêmio 5T32GM142623 para J. Art, R01MH115174 para V. Michopoulos e R01NS114567 para N. Zeltner. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas padrão de cultura de tecidos de 10 cmFalcon353003
Placas de 12 poçosFalcon353043
Tubos cônicos de 15 mLFisher7200886
Placas de 24 poçosCorning7200740
Solução de paraformaldeído a 4%Termo CientíficaJ19943-K2
Placas de 6 poçosFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activin ABio-techne338-AC
AF488-burro e alfa; cabrainvitrogenA11055
AF555-burro e alfa; RBTinvitrogenA31572
AF647-burro e alfa; minvitrogenA31571
AF647-burro e alfa; RBTinvitrogenA31573
Antibiótico-Antimicoótico (100X)Fisher15 240 096 
Pipetas Serológicas de Poliestireno BasixFisher14955233
14955234
14955235
14955236
Seringas de tuberculina BDFisher14-826-87
Tubos de Preparação de Células Mononucleares de Vidro BD Vacutaine (CPT)Fisher Scientific02-685-125Tubos de coleta de sangue isolantes PBMC
BD  Tubos plásticos de coleta de sangue Vacutainer com K2EDTA: Fechamento HemogardFisher Scientific02-657-32Tubos de coleta de sangue revestidos de anticoagulantes
B-MercaptoetanolFisher21 985 023 
Gelatina bovinaSigmaG1393
IgG policlonal de cabra com anticorpos Brachyury-TR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Centrífuga 5702EppendorfEP022628102-1EA
concentrado lipídico quimicamente definidoFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
Incubadora CO2SanyoMCO-20AIC
Sistema de Armazenamento de CriopreservaçãoSistemas Biogênicos PersonalizadosV-1500AB
CryoStor CS10Tecnologias de Células-Tronco100-1061Meio de congelação alternativo
Kit de Reprogramação CytoTune-iPS 2.0 SendaiFisherA16517
DexametasonaSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X SEM MG  de CA;FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Eritropoetina (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essencial 6 Médio (E6)FisherA1516401base de diferenciação 
Médio Essential 8 (E8)FisherA1517001Meio basal hPSC
Microscópio EVOS FLTermodinâmicaAMF4300
Soro Fetal BovinoVWR45000-734
FGF básico (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Revestimento matricial
Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco MEM (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061Substituto da L-glutamina  
HeparinaTecnologias de Células-Tronco7980
Histopaque 1077Sigma10771solução do gradiente de densidade 1 
HolotransferrinaSigmaT0665
Fator de Células-Tronco Humanas (SCF)Peprotech300-07-100UG
Fator de Crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleucina-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Banho-maria Isotemp 210Fisher Scientific210
Substituição do Soro de Nocaute (KSR)Fisher10828028Suplemento gratuito FBS  
Ácido L-AscórbicoSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutaminaFisher25030081
LymphoprepTecnologias de Células-Tronco7801Solução do gradiente de densidade 2
MatrigelCorningCB-40234Revestimento matricial
Fibroblastos Embrionários de CamundongosFisherA34964 
IgG de cabra policlonal NanogR& DAF1997-SP
Nunc Biobanking e Tubos Criogênicos de Cultura CelularFisher Scientific12-565-163N
Penicilina/EstreptomicinaFisher15140122
IgG policlonal policlonal de coelho com anticorpos anti-Pax-6 purificadoBiolenda901301
QBSF-60 Meio Livre de SoroQualidade Biológico160-204-101Base EM
Meio de Congelação de Cultura de Células de RecuperaçãoThermo Fisher Scientific12648010Meio de congelação alternativo
rhVitronectina (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MédioFisher11875093
SB431542R& D1614
Vírus Sendai HN Anticorpo Monoclonal de Camundongos IgG2aInvitrogen14649482
Selenito de sódioSigmaS5261
Sox17 Anticorpo IgG policlonal de cabraR& Daf1924
Suplemento de Expansão Eritroide StemSpanTecnologias de Células-Tronco2692Suplemento alternativo de meio comercial de expansão
Meio StemSpan SFEM IITecnologias de Células-Tronco9605Meio alternativo de expansão comercial
Freezer de Ultra Baixa TemperaturaThermo Fisher ScientificTSX60086A
Ponteiras Universais de Pipeta - FiltradasVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 CloridratoBioGems1293823

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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