Um Protocolo Padronizado para Avaliação da Toxicidade de Cádmio em Organoides Colorretais Humanos por Meio de Ensaio de Viabilidade Baseado em Luciferase

Resumo

O protocolo visa estabelecer organoides colorretais humanos e avaliar um ensaio de bioluminescência de ATP baseado em luciferase para detectar toxicidade induzida pelo cádmio. Ele avalia a viabilidade e sensibilidade do ensaio quantificando as mudanças dependentes da dose e do tempo na viabilidade dos organoides.

Resumo

O cádmio (Cd) é classificado como carcinógeno do Grupo 1 e constitui um grave problema ambiental global. Este estudo teve como objetivo estabelecer um modelo de organoide colorretal humano e avaliar a viabilidade e sensibilidade de um ensaio de bioluminescência de ATP baseado em luciferase para detectar respostas tóxicas de organoides colorretais (COs) à exposição ao CD. Células-tronco foram isoladas de tecido colorretal humano e cultivadas em uma matriz tridimensional da membrana basal para gerar COs. Organoides foram tratados com uma série graduada de concentrações de Cd para diferentes durações de exposição. Um reagente de viabilidade luminescente foi adicionado em proporção de volume igual, misturado suavemente por balanço em temperatura ambiente para promover a lise e penetração do reagente, e então incubado para permitir que a reação bioluminescente prossiga. A luminescência era registrada no modo luminescência em um leitor de microplacas multimodo. O ajuste da curva dose-resposta foi usado para calcular a concentração inibitória metade do máximo e avaliar mudanças na viabilidade ou viabilidade relativa. Células-tronco primárias foram isoladas com sucesso do tecido colorretal humano e usadas para gerar COs. A exposição ao CD produziu diminuições dependentes da dose e do tempo na atividade metabólica dos organoides; A análise dose-resposta resultou em curvas de sobrevivência e valores de IC50 para os organoides. Este estudo fornece orientações metodológicas e insights práticos para a utilização de COs humanos em estudos ambientais de toxicologia de metais pesados.

Introdução

O CD é um metal pesado naturalmente classificado como carcinógeno do Grupo 1 e tornou-se uma preocupação ambiental^{global 1}. A exposição humana ao CD ocorre principalmente por inalação e ingestão alimentar. Embora a exposição crônica a baixas doses esteja associada a uma variedade de consequências adversas à saúde, reduzir substancialmente seu uso e liberação ambiental continua sendo um^{desafio 2,3}. Culturas bidimensionais tradicionais crescem em substratos planos e não possuem arquitetura tecidual, polaridade celular e microambiente tumoral. Consequentemente, possuem uma capacidade limitada de recapitular heterogeneidade in vivo e respostas toxicológicas autênticas à exposição ao^{cádmio 4}. Tais sistemas não conseguem modelar adequadamente interações célula-célula, crescimento dependente da matriz ou os processos biológicos subjacentes ao desenvolvimento da resistência a^{fármacos 5}. Sistemas organoides tridimensionais derivados de tecidos de pacientes oferecem uma plataforma fisiologicamente mais relevante em comparação com as linhas celulares bidimensionais^{convencionais 6}. Os organoides mantêm as características genômicas, a organização histológica e os estados funcionais do tecido primário. Isso permite modelagens mais precisas do crescimento, evolução e sensibilidade tumorais à toxicidade do cádmio, proporcionando vantagens claras para a modelagem de doenças e pesquisas em^{toxicologia 7}. Os COs possuem uma arquitetura tridimensional complexa, heterogeneidade celular e capacidades intrínsecas para autorrenovação e autoorganização ^8,9. O transplante de COs em camundongos receptores pode promover a autorrenovação das células-tronco intestinais e modular o microambiente imune do hospedeiro, produzindo efeitos protetores⁴. Em 2009, Sato et al. demonstraram pela primeira vez que uma única célula-tronco intestinal adulta Lgr5⁺ pode se autoorganizar e diferenciar espontaneamente para formar estruturas cripto-vilosidades que abrangem todas as linhagens celulares^{intestinais 10}.

O epitélio intestinal constitui a primeira linha de defesa contra toxicidade por CD após a ingestão. Na verdade, a biodisponibilidade oral do Cd é tipicamente abaixo de 5%. A toxicidade intestinal induzida por CD é caracterizada pela ruptura das junções intercelulares, aumento da permeabilidade paracelular e indução de respostas inflamatórias. Além disso, o Cd perturba a função imunológica intestinal e altera a composição e homeostase da microbiota^{intestinal 11}. Dependendo da dose e duração da exposição, o Cd pode causar desregulação do ciclo celular, promovendo fenótipos oncogênicos em alguns contextos enquanto induz apoptose em outros. A CD pode estimular indiretamente a produção de ROS (espécies reativas de oxigênio), desencadeando estresse oxidativo e desequilíbrio redox. A função de receptores, quinases, fosfatases, proteases, moléculas de adesão e fatores de transcrição pode ser modulada por sinalização redox. O CD também perturba cascatas de sinalização, alterando o status de ativação de ERK1/2, JNK (cinase N-terminal c-Jun) e p38 MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno p38) em múltiplos tipos^{celulares 12}. Ao ativar ERK1/2 dentro da cascata MAPK, o Cd pode promover a proliferação e sobrevivência celular, suprimir a morte celular programada e contribuir para a hiperproliferação^{aberrante 13}. A CD pode regular direta ou indiretamente a expressão e atividade das principais proteínas efetoras. Por exemplo, ele reduz o supressor tumoral p53 e aumenta proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 e Bcl-xL, interrompendo a apoptose e a homeostase^{do ciclo celular 14}.

Em modelos de CO usados para avaliar os efeitos citotóxicos da Cd, a medição do conteúdo de ATP é amplamente empregada para avaliar a viabilidade dos organoides. O ATP, a molécula central do metabolismo energético, reflete diretamente o estado metabólico geral e a viabilidade dos organoides. Após a exposição ao cádmio nos COs, o Cd induz principalmente disfunção mitocondrial, agrava o estresse oxidativo e prejudica a homeostase da energia organoide. Esses eventos prejudicam coletivamente a produção de ATP e, em última análise, reduzem a viabilidade dos organoides. Portanto, alterações nos níveis de ATP servem como uma leitura funcional robusta da citotoxicidade induzida pelo cádmio. Ensaios convencionais de citotoxicidade incluem ensaios colorimétricos MTT/CCK-8, coloração viva/morta e análises baseadas em citometria de fluxo. Comparados a esses métodos, ensaios baseados em ATP oferecem vantagens distintas em sistemas organoides tridimensionais. Devido à complexidade estrutural e à acentuada heterogeneidade espacial dos organoides, as abordagens tradicionais de coloração e imagem são frequentemente limitadas por penetração inadequada dos tecidos e precisão quantitativa reduzida. Em contraste, os ensaios ATP dependem de uma reação bioluminescente mediada pela luciferase, permitindo quantificação direta sem perturbar a estrutura organoide. A medição de ATP apresenta alta sensibilidade e ampla faixa dinâmica. Isso permite a detecção de respostas biológicas contínuas, que vão desde a supressão metabólica precoce até a morte dos organoides, facilitando análises precisas dose-resposta em diferentes concentrações de cádmio. Os níveis de ATP refletem de forma abrangente o status funcional geral dos organoides, superando abordagens dependentes da avaliação morfológica ou de marcadores moleculares únicos. Consequentemente, este ensaio é particularmente adequado para triagem de toxicidade de alta potência, oferecendo maior estabilidade e reprodutibilidade.

O princípio central subjacente ao uso da bioluminescência de ATP para avaliar a sensibilidade dos COs à exposição ao Cd é que a luciferase vaga-lume catalisa a oxidação da D-luciferina na presença de ATP, Mg²⁺ e O₂ para produzir oxiluciferina e emitir fótons. A intensidade da luz emitida é proporcional ao teor mensurável de ATP na amostra dentro de uma faixa linear definida. Portanto, a luminescência serve como um substituto quantitativo indireto para a atividade ou viabilidade metabólica celular. Organoides estão embutidos em uma matriz extracelular e possuem uma estrutura tridimensional multicamada. Para acomodar isso, os reagentes de ensaio ATP apresentam composições e procedimentos otimizados de lise-buffer. Essas otimizações melhoram a ruptura das células organoides internas, promovem a liberação de ATP e estabilizam o sinal^{bioluminescente 15}. Importante, a bioluminescência do ATP relata atividade metabólica e não uma contagem celular exata. Por exemplo, inibidores mitocondriais podem reduzir significativamente os níveis de ATP celular em curtos intervalos, mesmo enquanto as células permanecem viáveis. Por outro lado, algumas formas iniciais de morte celular podem preservar temporariamente níveis relativamente altos de ATP.

Apesar de demonstrarem relevância fisiológica superior nas avaliações de toxicidade do cádmio (Cd), os modelos organoides colorretais apresentam várias limitações práticas. Comparado às linhas celulares tradicionais bidimensionais (2D), o cultivo de organoides é mais demorado e custoso. Além disso, sua dependência de matrizes derivadas de animais introduz variabilidade de lote para lote, o que restringe sua utilidade em triagem toxica em larga escala e alto rendimento. Embora esses modelos sejam altamente adequados para avaliar os efeitos toxicológicos diretos dos metais pesados no epitélio intestinal, eles ainda não podem substituir totalmente os modelos in vivo para avaliar toxicidade sistêmica ou processos toxicocinéticos complexos.

Neste estudo, o tecido colorretal humano foi usado como material de origem para isolar células-tronco colorretais e estabelecer COs in vitro. Organoides foram expostos ao Cd em várias concentrações e por diferentes durações de exposição. A luminescência era então medida usando o leitor de microplacas multimodo no modo de detecção de luminescência. Os valores de viabilidade da célula ou IC50 foram calculados e visualizados usando software operacional para um leitor específico de microplacas.

Protocolo

O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (Aprovação nº SWYXLL202516) e foi conduzida de acordo com padrões éticos médicos. Todos os participantes desta pesquisa forneceram consentimento informado por escrito.

1. Isolamento do tecido colorretal humano e estabelecimento de COs

1. Transporte e Preservação de Amostras de Tecido
   1. Antes do experimento, descongele lentamente a matriz da membrana basal a 4 °C e equilibre o meio de cultivo necessário à temperatura ambiente.
   2. Coloque imediatamente o tecido colorretal humano obtido em procedimentos clínicos em solução pré-resfriada para preservação de tecido (2–8 °C).
      NOTA: Certifique-se de que o tecido permaneça totalmente submerso durante o transporte. Transfira as amostras para o laboratório.
2. Sob um armário de biossegurança, coloque o tecido em um recipiente de cultura de 6 cm para avaliação. Remova cuidadosamente o tecido adiposo visível e as camadas musculares usando bisturi e pinças, mantendo os componentes epiteliais.
3. Transfira o tecido para um recipiente de 6 cm contendo 3 mL de Soro Salino Tamponado com Fosfato (PBS) suplementado com 300 μL de antibióticos. Corte o tecido em fragmentos de 2 mm × 5 mm.
4. Transfira os fragmentos de tecido para um tubo centrífuga de 50 mL.
5. Adicione 10 mL de PBS pré-resfriado e 200 μL de 0,5 M EDTA (concentração final ~10 mM) ao tubo.
6. Coloque o tubo sobre um shaker em temperatura ambiente e agite suavemente a 0,072 g por 15 minutos.
7. Use pinças para transferir o tecido para a placa de cultivo e examiná-lo ao microscópio. Prossiga para a próxima etapa assim que as estruturas da cripta se tornam visíveis ou começam a se destacar.
   NOTA: Quando as estruturas cripto-criptas se tornam visíveis sob observação microscópica após o tratamento com EDTA, a digestão geralmente atinge um nível suficiente para isolamento da cripta, e as criptas começam a se desprender dos fragmentos soltos do tecido epitelial. Criptas intactas normalmente mantêm morfologia glandular ou tubular bem definida com um lúmen central discernível, enquanto uma digestão excessiva produz grandes números de células únicas dissociadas e detritos necróticos.
8. Encerrar a digestão assim que várias criptas intactas se tornarem visíveis e os fragmentos de tecido aparecerem soltos e translúcidos, permitindo que a pipetagem suave libere facilmente as criptas.
   NOTA: A incubação prolongada de EDTA prejudica a integridade da cripta, aumenta o acúmulo de detritos celulares e reduz a viabilidade das células-tronco intestinais, diminuindo assim a eficiência da formação subsequente de organoides.
9. Adicione 15 mL de PBS suplementado com antibióticos para interromper a digestão do EDTA. Misture suavemente.
10. Centrifuge a amostra a 300 × g por 3 minutos a 4 °C.
11. Remova o sobrenadante.
12. Adicione 1 mL de meio celular completo e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
13. Centrifuge a suspensão a 300 × g por 3 minutos e descarte o sobrenadante.
14. Adicione 500 μL da matriz da membrana basal a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misture bem.
15. Minimize a exposição à temperatura ambiente durante a mistura e mantenha a matriz da membrana do embasamento sobre gelo para evitar solidificação prematura.
16. Adicione 25 μL da mistura gota a gota em cada poço da placa de 24 poços para formar uma gota.
17. Inverta a placa de 24 poços e incube-a a 37 °C com 5% de CO₂ por 20 minutos.
18. Adicione 600 μL de meio de cultivo de CO a cada poço.
19. Obtenha meio de cultura organoide colorretal e reagentes de dissociação de fontes comerciais e utilize-os em estrita conformidade com as instruções do fabricante.
20. Para preparar o meio completo de cultura celular, suplemente 500 mL de meio basal DMEM com 50 mL de soro fetal bovino (FBS) e 5 mL de penicilina-estreptomicina. Misture a solução cuidadosamente por inversão suave.

2. Ensaio de sensibilidade de COs expostos à Cd

1. Revestimento e cultivo de COs em placas de 96 poços
   1. Descarte o meio de cultivo de cada poço e adicione 500 μL de solução de dissociação organoide. Pipete suavemente para cima e para baixo para dispersar a matriz da membrana do basamento.
   2. Coloque a placa tratada em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ para digestão, com tempo inicial de digestão de 10 minutos.
   3. Colete a solução digestiva de cada poço da placa de 24 poços em um tubo centrífugo de 15 mL e adicione 10 mL de meio completo de cultura celular.
   4. Centrifuge a 300 × g por 3 minutos para coletar o organoide e descartar o sobrenadante.
   5. Adicione 1 mL de meio completo de cultura celular, misture cuidadosamente pipetando e transfira a suspensão para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   6. Centrifuge a 300 × g por 3 minutos, depois descarte o sobrenadante.
   7. Adicione 100 μL da matriz da membrana do basamento e misture cuidadosamente pipetando.
   8. Dissocie os organoides e estime o número de células individuais sob um microscópio antes de semear aproximadamente 3.000–5.000 células individuais por poço.
   9. Mantenha uma densidade de semeadura relativamente consistente em todos os grupos experimentais para garantir o crescimento organoide reprodutível e os resultados experimentais.
   10. Ajuste a faixa de semeadura com base na avaliação microscópica após a dissociação dos organoides e em condições previamente relatadas comumente usadas em estudos de cultura de organoides.
   11. Adicione 6 μL da mistura ao centro de cada poço de uma placa de 96 poços. Use 30 poços no total, com três réplicas técnicas.
   12. Inverta a placa e incube-a a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 15 minutos.
   13. Adicione 100 μL de meio de cultura organoide a cada poço da placa de 96 poços.
   14. Inicie o tratamento com cádmio exatamente 7 dias após a semeadura.
       NOTA: Esse período de cultivo de 7 dias permite que células individuais se desenvolvam completamente em COs estruturalmente intactos.
2. Diluição da Concentração de CD
   1. Dissolve 3,67 mg de pó de cloreto de cádmio em 2 mL de água ultra-pura estéril para preparar uma solução de estoque de 10 mM com volume final de 2 mL.
   2. Esterilize os 2 mL de solução de cádmio de 10 mM passando-os por um filtro de 0,22 μm.
   3. Aliquota a solução esterilizada de cádmio em tubos centrífugos de 1,5 mL e armazene-os a 4 °C, protegidos da luz.
   4. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas de proteção e óculos de proteção, durante todo o experimento.
   5. Realize todas as operações relacionadas dentro de uma exaustão química para minimizar os riscos de exposição.
   6. Classificar e gerenciar todos os resíduos contendo Cd, incluindo meios de cultivo suplementados com cádmio, pontas de pipeta, tubos de centrífuga e placas de cultura, como resíduos químicos perigosos.
   7. Descarte esses materiais em recipientes designados para coleta de resíduos líquidos ou sólidos de metais pesados.
   8. Descarte todo o lixo estritamente conforme as diretrizes institucionais e regulamentações ambientais locais.
   9. Nunca trate resíduos de CD como lixo comum de laboratório ou jogue na pia.
   10. Rotule a tampa de uma placa de 24 poços como 4, 3, 2, 1 e 0.
       NOTA: Trate os organoides com Cd em concentrações finais de 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM e 0 μM. A diluição da solução de estoque de cádmio foi calculada usando a fórmula padrão:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Para preparar 4 mL da concentração de trabalho de 20 μM, adicione 8 μL da solução padrão de 10 mM a 3992 μL de meio de cultivo completo. Misture a solução cuidadosamente para garantir uma distribuição uniforme.
   1. Adicione 1,4 mL de meio de cultura aos 4 poços rotulados e adicione 700 μL de meio de cultivo em cada um dos poços restantes.
   2. Remova 5,6 μL de meio de cultura do poço 4 marcado e adicione 5,6 μL de solução de cádmio. Misture bem.
   3. Transfira 700 μL da solução do poço rotulado '4' para o poço rotulado como '3' e misture cuidadosamente.
   4. Repita o processo de transferência e mistura de cada poço para o próximo poço com números menores (de '3' para '2', '2' para '1' e '1' para '0'), misturando cuidadosamente em cada etapa.
      NOTA: Não realize nenhuma operação no poço rotulado 0.
   5. Remova a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio de cultivo existente.
   6. Rotule a tampa da placa de 96 poços da esquerda para a direita como 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM e 0 μM.
   7. Adicione 100 μL de meio de cultivo contendo cádmio a cada poço marcado correspondente.
   8. Coloque o prato na incubadora.

3. Adição do Reagente de Viabilidade Luminescente

1. Remova o reagente de viabilidade luminescente do freezer a −20 °C e deixe descongelar em temperatura ambiente. Adicione o reagente de viabilidade luminescente em uma proporção de volume 1:1.
2. Adicione 2,5 mL de reagente de viabilidade luminescente a um reservatório descartável.
3. Adicione 2,5 mL de meio de cultura organoide colorretal e misture cuidadosamente pipeteando.
4. Use um sistema de aspiração de resíduos para remover o meio de cultura organoide de cada poço da placa de 96 poços. Evite aspirar a matriz de membrana do embasamento dos poços.
5. Transfira 200 μL da solução do reservatório descartável para cada poço da placa de 96 poços contendo COs, e misture cuidadosamente por pipeteamento vigoroso. Evite introduzir bolhas de ar durante a pipeteação.
6. Incube a placa em temperatura ambiente por 25 minutos. Incube em temperatura ambiente, protegido da luz.

4. Medição de reagentes de viabilidade luminescente

1. Abra o software operacional para o leitor específico de microplacas (Figura Suplementar 1A).
2. Clique em ler agora (Figura Suplementar 1B).
3. Clique em Novo (Figura Suplementar 1B).
4. Clique em ler (Figura Suplementar 1C).
5. Selecione a luminescência (Figura suplementar 1D).
6. Selecione a Fibra de Luminescência (Figura Suplementar 1D).
7. Clique em OK (Figura Suplementar 1D).
8. Selecione a Placa Completa (Figura Suplementar 1E).
9. Clique em Limpar Tudo (Figura Suplementar 1F).
10. Selecione as posições correspondentes na placa alvo de 96 poços, totalizando 15 poços (Figura Suplementar 1G).
11. Clique em OK (Figura Suplementar 1G).
12. Coloque a placa de 96 poços no instrumento (Figura Suplementar 1H).
13. Selecione Use Tampa (Figura Suplementar 1I).
14. Clique em OK para iniciar a medição (Figura Suplementar 1I).
15. Após a conclusão da medição, clique em Exportar para exportar os dados para o Excel (Figura Suplementar 1J).

5. Processamento e análise de dados

1. Software aberto de análise estatística de dados capaz de regressão não linear. (Figura Suplementar 2A).
2. Selecione uma tabela de dados XY (Figura Suplementar 2A).
3. Defina X para números (Figura suplementar 2A).
4. Defina Y para Inserir valores replicados em subcolunas lado a lado e insira 3 réplicas (Figura Suplementar 2A).
5. Introduza os dados (Figura Suplementar 2B).
6. Análises de clique (Figura Suplementar 2C).
7. Clique em análises XY (Figura Suplementar 2D).
8. Clique em regressão não linear (ajuste de curva) (Figura suplementar 2D).
9. Clique OK. (Figura Suplementar 2D).
10. Selecione Dose–resposta – Inibição (Figura Suplementar 2E).
11. Selecione log(inibidor) vs. resposta normalizada – Inclinação variável (Figura Suplementar 2E).
12. Clique em OK para executar a análise (Figura Suplementar 2E).
13. Clique em Arquivo (Figura Suplementar 2F).
14. Clique em Exportar (Figura Suplementar 2F).
15. Clique em OK (Figura Suplementar 2G).

Resultados

Estabelecimento de comandantes humanos
Isolamos com sucesso estruturas de cripta colorretais de amostras de tecido, e a morfologia típica de cripta foi claramente observada tanto em microscopia de baixa quanto de alta ampliação. Durante a cultura in vitro, as criptas isoladas gradualmente se expandiram e apresentaram um processo ordenado de maturação morfológica (Figura 1A,B). No terceiro e sexto dia de cultura, organoides colorretais estruturalmente intactos haviam se formado, predominantemente apresentando estruturas esféricas ou semelhantes a brotação inicial (Figura 1C,D).

Sensibilidade dos COs à exposição ao CD
Os COs foram semeados em placas de 96 poços e cultivados por mais 5 dias, seguidos pelo tratamento com cádmio em concentrações de 0, 5, 10, 20 e 40 μM. Após 72 horas de exposição, foi realizado um ensaio de luminescência baseado em ATP para medir unidades relativas de luminescência (RLU), e os dados foram analisados e visualizados. Os resultados demonstraram uma queda significativa dependente da dose na viabilidade dos organoides com o aumento das concentrações de cádmio (Figura 2A). COs expostos a 10 μM, 20 μM e 40 μM de cádmio apresentaram valores de RLU marcadamente reduzidos (Figura 2B). Não observamos toxicidade significativa em organoides colorretais expostos a 5 μM Cd. Consistente com os dados de viabilidade, a análise morfológica revelou alterações estruturais pronunciadas em organoides colorretais tratados com cádmio, incluindo redução do tamanho dos organoides, severa perturbação da arquitetura epitelial e fragmentação estrutural progressiva (Figura 2C). Esses achados indicam que organoides colorretais são altamente sensíveis à citotoxicidade induzida pelo cádmio.

Figura 1: Isolamento das criptas colorretais humanas e estabelecimento de culturas organoides colorretais. (A) Imagem representativa de criptas colorretais humanas isoladas. (10×). (B) Vista de alta ampliação de uma única cripta (20×). (C) Imagem representativa dos COs após 3 dias em cultura (4×). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Alterações citotóxicas e morfológicas induzidas por CD em COs. (A) Curva dose-resposta relativa de COs expostos a diferentes concentrações de Cd. O eixo x representa as concentrações de Cd e o eixo y indica a viabilidade relativa do organoide. (B) Valores relativos de RLU dos COs após tratamento com concentrações variáveis de Cd. O eixo X representa as concentrações de Cd e o eixo Y indica os valores relativos da RLU. ANOVA unidirecional *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Imagens representativas em campo claro de COs não tratados (0 μM) e tratados com CD em 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura Suplementar 1: Um fluxo de trabalho detalhado de 16 etapas para detecção de RLUs utilizando o software operacional de um leitor específico de microplacas. (A) Ícone de software. (B) Interface de lançamento de software. (C) Menu de configurações. (D) Interface de seleção de ensaio. (E) Menu de configuração de disposição de placas. (F) Disposição padrão da placa. (G) Configurar as posições dos poços de acordo com o layout experimental da placa. (H) Carregando a microplaca. (I) O instrumento inicia a medição da RLU. (J) Exportação de dados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Após a exportação de dados, processamento de dados e análise estatística são realizados em softwares de análise estatística. (A) Tela inicial. (B) Tabela de digitação de dados. (C) Diálogo de análise. (D) Menu de parâmetros de análise. (E) Menu de configuração para regressão não linear. (F) Menu de opções de arquivo. (G) Diálogo de exportação de dados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo estabelece um protocolo padronizado para ensaios de exposição ao cádmio e viabilidade do ATP usando COs para avaliar o impacto do cádmio na viabilidade dos organoides. Esse protocolo otimiza especificamente as etapas de dissociação dos organoides e de placagem de 96 poços para aumentar a reprodutibilidade experimental e a estabilidade das leituras subsequentes de ensaios de ATP. Embora o protocolo experimental atual foque principalmente no estabelecimento de um modelo 3D de organoide colorretal para avaliação de toxicidade por CDs, pesquisas extensas demonstraram que culturas celulares 2D tradicionais e modelos organoides 3D diferem significativamente em respostas a medicamentos, interações célula-célula, arquitetura tecidular e perfis toxicológicos. Comparados às monocamadas 2D, os organoides recapitulam de forma mais fiel a arquitetura espacial, a heterogeneidade celular e o microambiente in vivo dos tumores, oferecendo relevância fisiológica superior. Devido à ausência de interações complexas célula-célula e matriz extracelular (ECM), a resposta das culturas 2D à exposição a metais pesados pode não capturar com precisão processos toxicológicos genuínos in^{vivo 16}. Por outro lado, o modelo CO estabelecido neste estudo simula efetivamente a dinâmica tridimensional de crescimento dos tecidos tumorais, fornecendo uma plataforma altamente relevante fisiologicamente para avaliar a toxicidade induzida por Cd.

Durante a passagem do organoide, o tempo de dissociação foi mantido estritamente em aproximadamente 10 minutos. Essa otimização previne dissociação incompleta, que leva a agregados celulares excessivamente grandes, ao mesmo tempo em que evita a dissociação excessiva, que gera um número excessivo de células individuais. Ao controlar com precisão a extensão da dissociação, alcançamos estruturas organoides relativamente uniformes, aumentando a consistência dos tratamentos farmacológicos subsequentes e dos ensaios de viabilidade com ATP.

Empregamos um sistema de cultura de alta produtividade com 96 poços e padronizamos o volume de placagem da matriz da membrana do embasamento para 6 μL por poço. Essa padronização minimiza a variabilidade entre poços ao garantir densidade e características de crescimento organoides consistentes em todos os poços, melhorando, em última análise, a reprodutibilidade experimental e a comparabilidade dos dados. Ao acoplar ensaios de luminescência de ATP com análises da curva dose–resposta usando softwares de análise estatística, alcançamos uma avaliação quantitativa robusta das mudanças na viabilidade dos organoides após a exposição ao CD. Coletivamente, este estudo estabelece um protocolo experimental altamente reprodutível para a aplicação de modelos organoides em toxicologia ambiental e exposição a metais pesados.

Durante a cultura dos COs, a mistura completa do pellet cripto com a matriz de membrana do basamento é um passo crítico para garantir a formação adequada dos COs e o crescimento estável. A proporção da matriz da membrana basal deve ser mantida acima de 70% (o volume da matriz da membrana basal > 70%). Os volumes recomendados da matriz de membrana do basamento são 6 μL por poço para placas de 96 poços, 20 μL por poço para placas de 48 poços e 25 μL por poço para placas de 24 poços. Após a polimerização matricial, adicione os seguintes volumes aos poços: 100 μL por poço para placas de 96 poços, 300 μL por poço para placas de 48 poços e 500 μL por poço para placas de 24 poços. Deve-se ter cuidado para evitar a pipeteação direta do meio nas cúpulas da matriz membrana do embasamento, pois isso pode prejudicar a arquitetura tridimensional. Para preservar a estabilidade fenotípica e genética, este estudo limitou o uso de organoides colorretais a um máximo de 4 passagens aéreas.

Quando criptas ou COs atingem um diâmetro de aproximadamente 600 μm ou apresentam escurecimento e parada de crescimento, a passagem deve ser realizada prontamente para possibilitar análises de sensibilidade subsequentes. Durante a dissociação enzimática dos COs, a digestão deve ser monitorada ao microscópio. Se os COs não forem suficientemente dissociados em pequenos agrupamentos celulares ou células individuais, o tempo de digestão pode ser gradualmente estendido com base no tamanho do organoide e no status de dissociação. A digestão prolongada em uma única etapa deve ser evitada para minimizar o risco de excesso de digestão e perda de viabilidade celular.

Calcule a viabilidade relativa de cada poço usando a seguinte equação e use a porcentagem média dos poços replicados como valor de resposta para cada concentração

 

O ensaio de bioluminescência ATP é baseado na oxidação catalisada da D-luciferina por luciferase de vaga-lume, que resulta na emissão de fótons. Devido à sua alta sensibilidade, compatibilidade com formatos de alta produtividade baseados em placas e à disponibilidade de kits comerciais padronizados, esse método tem sido amplamente aplicado para triagem preliminar de toxicidade nos modelos^{organoides 17}.

Vários fatores de confusão devem ser considerados. Certos compostos químicos podem inibir diretamente a reação enzimática da luciferase por meio de interferência química ou supressão enzimática, levando à extinção do sinal. A luminescência de fundo da matriz extracelular tridimensional, a heterogeneidade no tamanho e densidade dos organoides e a lise incompleta podem introduzir variabilidade substancial entre poços e entre lotes. A luminescência baseada em ATP sozinha não pode distinguir com precisão modalidades de morte celular nem elucidar mecanismos toxicológicos subjacentes¹⁸.

Para aumentar a confiabilidade metodológica, são recomendadas medidas sistemáticas de controle de qualidade. utilizando buffers de lise recomendados pelo fabricante ou previamente validados, e tempo de lise estendido, dissociação mecânica ou ciclos de congelamento-descongelamento quando necessário para melhorar a eficiência da lise celular dentro da matriz. Segundo, realizar experimentos de recuperação de spik-in de ATP durante a otimização do ensaio para avaliar a possível inibição direta da reação luminescente pelos compostos de teste ou pelo ambiente de lise. Terceiro, confirme a faixa linear de detecção usando uma curva padrão ATP e controle rigorosamente o tempo entre adição de reagentes, incubação e leitura da placa para minimizar a variabilidade técnica. Por fim, inclua controles em branco, veículo e negativo em cada ensaio e incorpore réplicas técnicas suficientes para avaliar e corrigir efeitos de borda e variações relacionadas a lotes. Recentemente, vários ensaios de viabilidade otimizados para organoides foram desenvolvidos com química de lise aprimorada e maior estabilidade do sinal, e essas formulações geralmente demonstraram desempenho superior em ensaios de toxicidade^{tridimensional 19}. Em resumo, este estudo utilizou COs humanos como modelo in vitro da toxicologia ambiental de metais pesados e estabeleceu um ensaio de alta produtividade e sensível baseado em bioluminescência de ATP para avaliar a suscetibilidade aos organoides à exposição ao CD. Este trabalho fornece uma referência experimental prática e orientação metodológica para avaliação de toxicidade em sistemas de pesquisa baseados em organoides.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 µm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 µL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	O software operacional para leitor de microplacas específico.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Reagente de viabilidade luminescente em uma proporção volumétrica de 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	A matriz da membrana basal
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Solução de dissociação de organoides
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		O software operacional para leitor de microplacas específico.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S