Artigo de método

Isolamento e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares Derivadas de Agregados de Células-Tronco Mesenquimais Auto-Assembladas

DOI:

10.3791/70534

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24 de abril de 2026

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha o isolamento eficiente de grandes vesículas extracelulares (LEVs) de agregados de células-tronco auto-montadas e sua aplicação terapêutica para regeneração óssea mandibular.

Resumo

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Vesículas extracelulares (EVs) são mediadoras vitais da comunicação intercelular e agentes livres de células promissoras para a medicina regenerativa. Entre as subpopulações de EV, as grandes vesículas extracelulares (LEVs) são particularmente adequadas para reparo tecidular devido à sua carga pró-regenerativa enriquecida. No entanto, métodos padronizados e reprodutíveis para gerar LEVs funcionais derivados de células-tronco odontológicas para caracterização posterior e avaliação terapêutica continuam limitados. Utilizando o excepcional potencial osteogênico das células-tronco da papila apical (SCAPs), desenvolvemos um modelo de cultura 3D sob condições de baixa adesão para induzir agregados SCAP auto-montados. Esse modelo imita a condensação mesenquimal fisiológica, aumentando significativamente as interações célula-célula e aumentando a secreção de LEV. Parâmetros-chave de cultura e notas de manuseio são fornecidos para melhorar a consistência agregada e maximizar a saída de LEV, mantendo a viabilidade da célula. Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para a produção eficiente de LEVs funcionais derivados do SCAP, abrangendo geração de agregados 3D, isolamento via centrifugação diferencial, análise de distribuição e concentração de partículas baseadas em análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), e entrega terapêutica usando um hidrogel termicamente reticulado para reparo de defeitos ósseos mandibulares. Essa abordagem otimiza a produção de LEVs para estudos mecanicistas posteriores e avaliação pré-clínica na regeneração craniofacial. Esse fluxo de trabalho otimizado garante a preparação reprodutível de LEVs bioativos com rendimentos consistentes e carga pró-osteogênica enriquecida, facilitando pesquisas fundamentais e acelerando a tradução clínica da reconstrução craniofacial mediada por EV. Em aplicações representativas, LEVs carregados em hidrogel fornecem um depósito localizado nos locais de defeito e facilitam o manuseio conveniente durante a implantação. Coletivamente, esse método fornece uma plataforma escalável para preparar LEVs derivados do SCAP e destaca considerações-chave para relatórios padronizados e design de estudos translacionais. Essa abordagem apoia uma adoção mais ampla em laboratórios de veículos elétricos craniofaciais.

Introdução

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Vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas ligadas à membrana liberadas por células que mediam a comunicação intercelular por meio da transferência de cargas bioativas como proteínas, miRNAs e lipídios 1,2,3. Entre as subpopulações de EV, as grandes vesículas extracelulares (LEVs) são distintas por sua liberação direta da membrana celular e pelo enriquecimento inerente de moléculas pró-regenerativas, tornando-as bem adequadas para demandas de reparo e regeneraçãode tecidos 4,5. Na medicina regenerativa, os EVs derivados de células-tronco mesenquimatosas (MSCs) são cada vez mais reconhecidos como uma alternativa viável livre de células à terapia com célulasinteiras 6,7,8. Eles recapitulam os efeitos regenerativos paracrinos das MSCs parentais, evitando limitações do transplante celular direto, como baixa eficiência de entravemento, imunogenicidade e variabilidade emlotes 7,8,9,10. Entre as fontes de MSC, células-tronco da papilla apical (SCAPs) exibem potencial superior de diferenciação osteogênica eodontogênica 11,12,13, tornando os EVs derivados do SCAP particularmente atraentes para reparo orofacial do osso e tecido dentário 8.

Notavelmente, a biogênese e a funcionalidade dos VEs são profundamente influenciadas pelo microambiente celular14,15. Culturas convencionais de monocamada bidimensional (2D) diferem significativamente do contexto do tecidonativo 16,17, frequentemente resultando em EVs com capacidade regenerativacomprometida 18. Em contraste, agregados de MSC auto-montados tridimensionais (3D) replicam aspectos-chave da condensação mesenquimal fisiológica, um estágio de desenvolvimento caracterizado por alta densidade celular, contato intensivo célula-célula e matriz extracelular enriquecida (ECM), que fornece suporte estrutural e fornece pistas bioquímicas e mecânicas que regulam a adesão, migração e decisões de destino celular 19,20,21. Esse microambiente 3D biomimético não só aprimora a comunicação intercelular e a sinalização paracrina 22,23, mas também promove a secreção de veículos elétricos com maior rendimento e perfis bioativos de cargaaprimorados 24,25,26. A utilização de agregados MSC auto-montados 3D surge assim como uma estratégia altamente promissora para obter EVs funcionalmente potentes para aplicaçõesregenerativas 18.

Apesar das claras vantagens dos VE derivados de agregados, protocolos padronizados para seu isolamento e caracterização em relação aos sistemas 3D ainda estão pouco desenvolvidos. As metodologias atuais de isolamento de EVs, como a centrifugação diferencial, são bem estabelecidas e oferecem uma estrutura escalável para a produçãode EVs 27. De forma semelhante, métodos para gerar agregados de MSC foram relatados, muitas vezes baseando-se em curling celular e agregação induzidos por vitamina C a partir de células cultivadas em2D. No entanto, a arquitetura de MEE dentro desses agregados induzidos por vitamina C ainda pode diferir do microambiente espacialmente organizado, semelhante a condensação, dos tecidos mesenquimatosos nativos. Em contraste, a auto-montagem livre de andaimes sob condições de baixa aderência facilita a formação de agregados compactos e esféricos que se aproximam das características-chave da condensação mesenquimal. Atualmente, falta um fluxo de trabalho sistemático e reprodutível para isolar e aplicar EVs a partir desses agregados SCAP 3D induzidos por baixa aderência. Do ponto de vista prático, a produção de LEVs a partir de culturas convencionais de SCAP 2D normalmente fica na faixa de ~1011 partículas/mL por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), e a agregação 3D de baixa adesão deve aumentar a saída de LEV várias vezes, mantendo a reprodutibilidade para aplicações posteriores. Para suprir essa lacuna, detalhamos aqui um protocolo abrangente que aproveita a funcionalidade osteogênica/odontogênica inerente dos SCAPs e otimiza o microambiente MSC por meio da agregação 3D de baixa aderência. Esse protocolo possibilita a produção confiável de LEVs de alta qualidade, fornecendo uma ferramenta padronizada para avançar terapias regenerativas sem células na medicina craniofacial.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Quarta Universidade Médica Militar e conduzidos em conformidade com as diretrizes ARRIVE. A coleta e o uso de amostras humanas foram aprovados pelo Comitê de Ética da Quarta Universidade Médica Militar (aprovação nº IRB-REV-2022187). Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores antes da coleta da amostra; Para doadores menores de idade ou incapazes de dar consentimento, o consentimento informado por escrito era obtido de seus tutores legais. Todos os reagentes foram filtrados por estéreis, e procedimentos de cultura celular foram realizados em um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade (veja a Tabela de Materiais). Trate todos os materiais de origem humana (dentes, tecidos, células primárias, meios condicionados e preparações para EV) como potencialmente infecciosos. Realize todos os procedimentos envolvendo amostras humanas em um armário certificado de biossegurança, utilizando equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas e proteção ocular. Para biossegurança e descarte de resíduos, siga as diretrizes institucionais BSL-2: Manusear todos os materiais de origem humana e descartáveis contaminados como resíduos biohazardos BSL-2; Descontamine superfícies/equipamentos com um desinfetante aprovado institucionalmente após o uso. Colete resíduos líquidos de risco biológico em recipientes rotulados e iative-os usando métodos aprovados antes do descarte. Descarte os objetos cortantes imediatamente em recipientes aprovados (sem recaptar). Tratar tecidos/carcaças animais e resíduos anestésicos/químicos como resíduos biohazardos/químicos regulados e descartá-los por meio de serviços institucionais, conforme regulamentações aplicáveis.

1. Isolamento e cultura dos SCAPs humanos

NOTA: P/S é uma mistura bioativa de antibióticos e pode causar irritação na pele/olhos ou reações alérgicas. Cabo em um armário de biossegurança BSL-2 ao abrir; usar luvas e proteção ocular; evitar a geração de aerossóis; e descartar resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de resíduos químicos. A colagenase tipo I (solução) é uma enzima bioativa e pode causar irritação na pele/olhos ou reações alérgicas. Cabo em um armário de biossegurança BSL-2; usar luvas e proteção ocular; evitar respingos e geração de aerossóis durante a pipeteação; e descontaminar os vazamentos rapidamente, de acordo com os procedimentos institucionais. Proteja a colagenase tipo I da luz durante o armazenamento e uso (veja a Tabela de Materiais).

  1. Colete os terceiros molares com ápices imaturos de doadores saudáveis (16–21 anos) e enxágue cuidadosamente com soro salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) (ver Tabela de Materiais).
  2. Disseca o tecido da papilla apical do ápice radicular usando pinças e tesouras oftálmicas estéreis, depois triturá-lo em pequenos fragmentos (<1mm 3).
  3. Transfira todos os fragmentos de tecido para um tubo centrífugo de 15 mL. Digere os fragmentos com 2 mg/mL de colagênase tipo I a 37 °C por 1 hora, com sacudidas suaves a cada 15 minutos.
  4. Interrompa a digestão adicionando um volume igual de meio essencial completo α-mínimo (α-MEM) (veja Tabela de Materiais).
    NOTA: O tempo de digestão da colagênase tipo I não é fixo e depende do estado digestivo dos tecidos. Monitore de perto, interrompa a digestão quando os tecidos ficarem semi-erodidos ao adicionar um substrato. A digestão excessiva pode prejudicar a viabilidade celular.
  5. Centrifuge a suspensão da célula a 100 × g por 5 minutos a 4 °C, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de α-MEM completo.
  6. Semeie a suspensão de tecido digerido em uma placa de Petri de 10 cm e adicione 8 mL de α-MEM completo a um volume final de 10 mL por placa.
  7. Cultive SCAPs a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
    NOTA: Monitore culturas continuamente, as células normalmente migram para fora dos fragmentos de tecido e se fixam no prato em padrão radial em 3–7 dias. Se a viabilidade tecidual for fraca ou não houver migração celular observada em até 5 dias, mude para α-MEM completo suplementado com soro a 20%.
  8. Para a passagem celular, as células foram lavadas com 5 mL de PBS para remover o meio residual ao atingirem 80–90% de confluência. Posteriormente, foram incubados com 2 mL de 0,25% de tripsina-1 mM de EDTA a 37 °C por 2 minutos (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A tripsina–EDTA é um irritante e pode danificar a pele e os olhos. Manuseie com luvas e proteção para os olhos, evite respingos e formação de aerossol, e enxágue imediatamente com bastante água se houver contato. Descarte resíduos líquidos contendo tripsina conforme as diretrizes institucionais.
  9. Quando as células se tornam arredondadas com junções intercelulares interrompidas sob o microscópio, desprenda suavemente as células do prato sem danos estruturais excessivos. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de α-EM completo.
  10. Colete as células pipetando suavemente e repetidamente em um tubo centrífugo novo de 15 mL. Após centrifugação a 100 × g por 5 minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda a célula em α-EM completo. Semeie as células ressuspensas em potes de cultivo fresco ou placas de poço. Troque o médio a cada dois dias.
    NOTA: Certifique-se de que os SCAPs usados para cultura agregada estejam dentro da passagem 5. A capacidade de formação e de agregação diminuem com o aumento dos númerosde passagens 30,31, o que pode reduzir a eficiência da formação agregada e o desempenho funcional.

2. Auto-montagem de agregados SCAP

  1. Colher a passagem de 3 a 5 SCAPs por tripsinização, centrifugar a 100 × g por 5 minutos e ressuspender em α-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) com 10% de EV e 1% de P/S (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Prepare o FBS com EVs reduzido centrifugando o FBS a 150.000 × g a 4 °C durante a noite para remover EVs e outrasimpurezas 32.
  2. Conte células usando um hemocitômetro e semeie 1 × 105 células por poço em placas de 24 poços de fixação ultra-baixa. Ajuste o volume médio para 500 μL por poço para manter o estado de suspensão.
  3. Incube as placas a 37 °C com 5% de CO₂ por 72 horas e substitua o meio de cultivo a cada 48 horas.
  4. Monitore a formação de agregados diariamente sob um microscópio óptico invertido. Colete EVs quando os agregados atingem 200–400 μm de diâmetro e apresentam uma estrutura compacta e de bordas lisas.
    NOTA: Defina um "lote" de produção como LEVs isolados do meio condicionado agrupado coletado de agregados SCAP semeados no mesmo dia a partir da mesma passagem celular e mantidos sob condições idênticas de cultura dentro de uma única janela de coleta (72 h). Processe cada lote independentemente por centrifugação. Substitua o meio de cultivo em 48 h após a semeadura e reabasteça com o mesmo volume de substrato fresco. Para a produção de LEV, colete o meio condicionado às 48 h e novamente às 72 h após a semeadura, e agrupe o meio colhido (0–48 h e frações de 48–72 h) em um único lote. Mantenha o meio condicionado em pool a 4 °C e processe-o para isolamento dos LEVs.

3. Isolamento e caracterização de VE a partir de agregados SCAP

  1. Centrifugação diferencial para isolamento de grandes LEVs
    1. Colete o meio de cultura contendo agregados SCAP em tubos centrífugas de 15 mL.
    2. Centrifuge a 800 × g por 10 minutos a 4 °C para remover agregados intactos e detritos de células grandes.
    3. Transfira o sobrenadante para novos tubos de 15 mL e centrifuge a 2.500 × g por 15 minutos a 4 °C para eliminar plaquetas residuais e fragmentos de pequenas células.
    4. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos cônicos estéreis de 1,5 mL e centrifuge a 16.800 × g por 30 minutos a 4 °C para aplicar LEVs em pellets.
      NOTA: Use tubos cônicos de 1,5 mL para aumentar o rendimento dos LEVs.
    5. Descarte o sobrenadante, resuspenda o pellet em 1 mL de PBS estéril e centrifuge novamente a 16.800 × g por 30 minutos a 4 °C usando um rotor de ângulo fixo (compatível com uma centrífuga de bancada padrão) para pelletar os LEVs.
    6. Ajuste a desaceleração/freio para a configuração "lenta" ou "baixa" (normalmente no freio Nível 1 ou 2) para evitar a resuspensão do LEV durante a fase final de desaceleração.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o último pellet LEV em 50 μL de PBS estéril. Use a suspensão imediatamente (dentro de 24 horas) ou armazene-a a 4 °C. Evite congelar para minimizar a perda de bioatividade.
      NOTA: Prepare aproximadamente 80 poços de agregados para obter LEVs suficientes para experimentos típicos a jusante. Amostras de LEVs são recomendadas para caracterização imediata ou aplicação terapêutica, em vez de armazenamento a longo prazo. Se for necessário armazenamento mais longo, aliquota a suspensão LEV (por exemplo, 5–10 μL por tubo) para evitar flutuações repetidas de temperatura e ciclos de congelamento-descongelamento. Congele as alíquotas em gelo seco e armazene a −80 °C para armazenamento prolongado de curto prazo (por exemplo, até 1–3 meses). Descongele uma vez no gelo e use imediatamente. Note que o congelamento pode reduzir a bioatividade e alterar a recuperação/distribuição de tamanho das partículas; portanto, sempre que possível, realize estudos funcionais usando LEVs recém-preparados. Para controle de qualidade após o armazenamento, remeça a concentração e a distribuição de tamanho das partículas usando NTA, e prossiga somente se os valores permanecerem dentro da faixa de aceitação pré-definida. Além disso, neste protocolo, a concentração de partículas NTA é usada como o principal método de quantificação para evitar a perda de vesículas associadas a ensaios baseados em proteínas como o BCA, maximizando assim o rendimento para aplicações posteriores.
  2. NTA para tamanho e concentração de partículas
    NOTA: O NTA é realizado usando um analisador de rastreamento de nanopartículas comercialmente disponível (veja Tabela de Materiais) para avaliar a distribuição de tamanho e a concentração de partículas.
    1. Dilua 1 μL da suspensão dos LEVs (da Seção 3.1, Passo 6) em 1.499 μL de PBS estéril em um tubo cônico estéril de 1,5 mL e misture completamente.
    2. Inicie o software compatível e encha a célula da amostra com 10 mL de água ultrapura. Confirme que a contagem de partículas de fundo é < 10 por quadro para garantir que o sistema esteja limpo (veja Tabela de Materiais).
    3. Calibre o instrumento com uma solução padrão preparada. Defina os parâmetros do software para: Sensibilidade 70, Obturador 70, Área mínima 5 e Brilho mínimo 20. Realize o "AutoAlinhamento" para garantir que o laser esteja focado. Ajuste a diluição padrão até que a contagem de partículas mostrada no software seja 50–400 (preferencialmente ~200) e então execute o programa de calibração.
      NOTA: Prepare a solução padrão reconstituindo 1 μL de esferas de calibração em 1 mL de água destilada para produzir uma solução primária. Dilua 100 μL da solução primária em 25 mL de água destilada (diluição 1:250.000) e armazene a 4 °C por até 1 semana.
    4. Enxágue a célula da amostra com 5 mL de água destilada antes da análise.
    5. Lave o canal com 1 mL de água destilada e confirme que a contagem de partículas na interface de detecção é <10.
    6. Injete 1 mL da amostra diluída de LEVs a uma velocidade constante de 0,5 mL/s usando uma seringa estéril de 1 mL.
      ATENÇÃO: Controle manualmente a seringa para manter uma velocidade de injeção constante.
    7. Realize análises de partículas e gere relatórios. No software, crie uma nova medição e selecione o modo Tamanho/Concentração. Ajuste a aquisição para 3 gravações, 60 segundos por gravação, a 25 °C usando os mesmos parâmetros de detecção do Passo 3 (Sensibilidade 70, Obturador 70, Área Mínima 5, Brilho Mínimo 20).
    8. Inicie a aquisição e verifique se a contagem de partículas na tela permanece dentro de 50–400 partículas/quadro (preferencialmente ~200); se estiver fora dessa faixa, pare e ajuste a diluição da amostra, depois repita o Passo 6. Após a aquisição, execute a análise para obter tamanho médio, tamanho do modo, D10/D50/D90 e concentração de partículas (partículas/mL). Depois, exporte os gráficos de resultados e distribuição de tamanho como .csv e .pdf (ou formatos de relatório equivalentes) e salve o arquivo de medição para registro.

4. Aplicação terapêutica de LEVs na regeneração óssea mandibular

  1. Preparação de hidrogel carregado com LEV
    1. Prepare o estoque do Pluronic F-127 (20% em w/v). Adicione o pó de F-127 Plurônico a PBS estéril até uma concentração final de 20% (p/v) e mexa a 4 °C durante a noite até que esteja totalmente dissolvido e homogêneo (veja a Tabela de Materiais). Mantenha a solução a 4 °C durante toda a preparação para evitar gelificação prematura.
      NOTA: 20% (p/v) Plurônico F-127 é líquido a 4 °C e passa por termogelação a ~20–25 °C (dependendo do tubo/ambiente); torna-se um gel estável a 37 °C.
    2. Carregue LEVs em condições frias. Pré-resfrie tubos, pontas de pipeta e o hidrogel a 4 °C. Misture LEVs de 50 μg (equivalentes a LEVs de duas placas de agregados de 24 poços) com 1 mL de Plurônico F 127 a 20% por pipeteamento suave e breve vórtice em baixa velocidade para garantir uma distribuição uniforme. Mantenha a mistura no gelo ou a 4 °C até a implantação.
    3. Orientação de manuseio/uso (para reprodutibilidade). Faça o carregamento e o carregamento com seringa/ponta rapidamente no gelo. Se a mistura esquentar acima de ~20–25 °C, a viscosidade aumenta e a gelificação pode começar; nesse caso, retorne a 4 °C até que o material volte a ser totalmente fluido antes do uso. Após a colocação no defeito, permita que a gelificação ocorra in situ à temperatura corporal (37 °C).
  2. Estabelecimento do modelo de defeito ósseo mandibular murino
    1. Anestesiar camundongos C57Bl/6 de 8 semanas (machos ou fêmeas) por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).
      ATENÇÃO: O pentobarbital sódico é um sedativo/anestésico potente e é tóxico para humanos se for injetado, ingerido ou inalado acidentalmente. Prepare e administre usando práticas seguras para objetos cortantes (não recapsule agulhas; descarte imediatamente em um recipiente para objetos cortantes), use luvas e proteção ocular, evite contato com a pele e armazene/registre o uso conforme as políticas institucionais de medicamentos controlados. Confirme a anestesia adequada nos camundongos verificando a ausência do reflexo corneano e a ausência de retirada dos membros ao pinçar a almofada dos pés. Aplique uma pomada oftálmica protetora para evitar o ressecamento da córnea.
    2. Raspe o pelo da região mandibular esquerda e desinfete alternadamente com 10% de povidona-iodo e 75% de etanol.
      ATENÇÃO: O etanol de 75% é altamente inflamável; Use-o longe das fontes de ignição e garanta uma boa ventilação. O iodo de povidona-iodo pode causar irritação na pele/olhos ou reações alérgicas; Use luvas, evite contato com olhos/mucosa e limpe os vazamentos rapidamente.
    3. Faça uma incisão longitudinal de 1 cm ao longo da borda mandibular e dissece de forma direta os tecidos moles para expor o ângulo mandibular.
    4. Crie um defeito ósseo circular (2 mm de diâmetro) usando uma broca dentária com irrigação contínua por soro fisiológico para evitar danos térmicos (veja a Tabela de Materiais).
      ATENÇÃO: Monitore de perto o sangramento intraoperatório, controle a hemorragia com pequenos algodões para manter o campo cirúrgico limpo e reduzir o risco de infecção. Evite contato com tecidos moles ao redor com a furadeira para evitar emaranhamento.
  3. Implantação de hidrogel carregado com LEV
    1. Coloque a mistura de LEV-hidrogel em uma seringa estéril e injete-a no defeito ósseo, garantindo o preenchimento completo.
      NOTA: Administrar ~10 μg de LEVs por mouse. São necessárias duas placas de agregados SCAP de 24 poços para fornecer LEVs suficientes para um experimento com n = 5 camundongos.
    2. Para o grupo controle, injete um volume igual de hidrogel F-127 plurônico sem LEVs.
    3. Suture a incisão com suturas absorvíveis 4-0 e administre analgesia subcutânea (Carprofeno, 5 mg/kg) para aliviar a dor pós-operatória (ver Tabela de Materiais).
      ATENÇÃO: O carprofeno é um AINEs farmacologicamente ativo e pode ser prejudicial se for injetado acidentalmente ou se entrar em contato com a pele/olhos. Use luvas, evite ferimentos cortantes, descarte agulhas/seringas em um recipiente para objetos cortantes e descarte medicamentos não utilizados e materiais contaminados conforme procedimentos institucionais de resíduos farmacêuticos.
    4. Coloque os camundongos em uma manta de reaquecimento até a recuperação da anestesia, depois transfira para gaiolas individuais com livre acesso a comida e água.
      NOTA: Não deixe camundongos desacompanhados até que recuperem consciência suficiente para manter a reposição esternal. Devolva os camundongos ao alojamento coletivo somente após a recuperação total.

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Resultados

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De acordo com o fluxo de trabalho experimental, etapas principais incluindo isolamento do SCAP, formação de agregados, extração de LEVs e implantação terapêutica foram executadas com sucesso (Figura 1). Os terceiros molares impactados clínicos de doadores apresentaram ápices imaturos com tecido papilar apical intacto preso ao redor dos orifícios do canal radicular abertos, confirmando a fonte adequada do SCAP (Figura 2A). Quando...

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Discussão

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O crescente interesse em terapias regenerativas sem célula posicionou os LEVs derivados de células-tronco mesenquimais como alternativas promissoras ao transplante de células inteiras, devido à sua capacidade de entregar moléculas bioativas sem os riscos associados às abordagens baseadas em células. No entanto, a tradução clínica das terapias baseadas em LEVs tem sido dificultada pela falta de sistemas de cultura fisiologicamente relevantes que possam preservar e aprimorar plenamente a f...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por bolsas do Programa Nacional Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2021YFA1100600), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82471011, 82401201), do Projeto do Laboratório Estatal Chave de Reconstrução e Regeneração Oral e Maxilofacial (2024MS04), da Fundação Pós-Doutoral de Ciências da China (BX20230485) e do Projeto do Programa de Cooperação e Intercâmbio de Laboratórios Parceiros da Quarta Universidade Médica Militar (2024HB014).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL de seringa com agulhaBD300841Anestesiação
Prato de Cultura Celular de 10 cmCorning353003Cultura celular
Tubo centrífugo de poliestireno de 15 mLCorning352095Cultura celular
Desinfetante com etanol 75%Hai Shi Hai NuoHS-750Operação
Sutura Absorvível 4-0Jinhuan MedicalR413Operação
Centrífuga de bancadaWIGGENSCE187Isolamento de veículos elétricos
Incubadora de CO2, 150 L, Tipo UniversalThermoFisher51032874Cultura celular
Colagenase Tipo IThermoFisher17100017Cultura celular
Bolinhas de algodãoDeroyal30-033Operação
Tesoura Curva de OperaçãoInstrumento Cirúrgico JZJ21040Operação
Unidade Móvel de Turbina OdontológicaKaVoS609COperação
Balanço EletrônicoZhi KeZK-DSTCultura celular
Tubo EppendorfEppendorf3810XIsolamento de veículos elétricos
Pinça, tudo bemInstrumento Cirúrgico JZJD1020Operação
Creme DepiladorVeet1.00097E+11Operação
Escavador de Bolas de alta velocidadeDentsply SironaE0123Operação
Peça de mão de alta velocidadeKaVoKV-1-008-1644Operação
Microscópio InvertidoMshotMF53-NCultura celular
MEM e Alpha; (Médio Essencial Mínimo α)ThermoFisher12561056Cultura celular
Microscópio de vídeo de rastreamento de nanopartículas PMX-120Metrix de partículasZetaView PMX120Análise de rastreamento de nanopartículas
Penicilina-Estreptomicina (P/S)ThermoFisher15140122Cultura celular
Pentobarbital sódicoSigma-Aldrich57-33-0Anestesiação
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher10010023Cultura celular
F-127 PlurônicoSigma-AldrichP2443Implantação de EV
Solução de Povidona IodoBaxter PROSL500Operação
Soro Fetal Bovino Especial (FBS)ThermoFisher12664025Cultura celular
Bloqueio de gaze estérilVitória10-000-681Operação
Microcentrífuga de Alta Velocidade de MesaHitachiCT15EIsolamento de veículos elétricos
Broca de TrephineMicrofixação Biomet01-9182Operação
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Referências

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