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Elucidação da Base Material da Fórmula Yiqi Qingjie contra Nefropatia por IgA Usando o UHPLC-Q-Orbitrap HRMS Integrado com Farmacologia em Rede

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DOI:

10.3791/70541

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19 de maio de 2026

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de cromatografia líquida de ultra-alta performance acoplada à espectrometria de massa de alta resolução híbrida quadrupole-Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), combinada com farmacologia em rede e acoplamento molecular, para prever e validar a base material da fórmula Yiqi Qingjie (YQQJ) para o tratamento da nefropatia por IgA (IgAN).

Resumo

Este estudo utiliza o UHPLC-Q-Orbitrap HRMS para caracterizar os constituintes extraíveis por água e absorvidos pelo sangue do YQQJ. Farmacologia de redes e acoplamento molecular são ainda aplicadas para prever e verificar a base material subjacente aos efeitos terapêuticos do YQQJ contra o IgAN. O extrato aquoso e as amostras de soro de YQQJ foram analisados usando o UHPLC-Q-Orbitrap HRMS para caracterizar os constituintes químicos e identificar compostos absorvidos pelo sangue. A identificação de compostos foi realizada com base em bancos de dados de referência, literatura publicada e uma avaliação abrangente do tempo de retenção, precisão da massa dos íons precursores, padrões de fragmentação MS/MS e distribuição isotópica. Os alvos potenciais dos compostos absorvidos por sangue protótipo foram previstos usando bancos de dados de predição de alvos, enquanto alvos relacionados a IgAN foram coletados de plataformas integradas de bioinformática. Os alvos principais foram triados por meio de análise de redes PPI. Uma rede "composto–alvo–via–doença" foi construída para identificar constituintes-chave, e foi realizado acoplamento molecular para avaliar as interações entre compostos centrais e alvos. Um total de 185 compostos foram identificados no extrato aquático do YQQJ. Entre eles, 28 compostos entraram na corrente sanguínea em suas formas protótipos. A IBP identificou 42 alvos principais associados aos efeitos terapêuticos do YQQJ na IgAN. Análises de enriquecimento KEGG e GO mostraram envolvimento na proliferação celular, inflamação e apoptose, e enriquecimento em várias vias principais, como PI3K-Akt, MACK e JAK-STAT. A análise de acoplamento molecular previu interações de ligação favoráveis entre seis alvos críticos (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB e PIK3CA) e três compostos principais absorvidos pelo sangue — ácido Deacetilasperulosídico, ácido geniposidídico e Dioscina — com energias de ligação consistentemente baixas, sugerindo interações potenciais. Essa análise integrada revela que o YQQJ exerce efeitos terapêuticos contra a IgAN por meio de múltiplos componentes e múltiplos alvos. O ácido deacetilasperulossídico, ácido geniposídico e diocina são sugeridos como constituintes ativos chave que contribuem para esses efeitos.

Introdução

A nefropatia por IgA (IgAN) é uma das glomerulonefrites primárias mais comuns no mundo. Suas manifestações clínicas são altamente heterogêneas, tipicamente apresentadas como hematúria microscópica ou grosseira, frequentemente acompanhadas por graus variados de proteinúria, hipertensão e insuficiência renal. Estudos anteriores sugeriram que até 40% dos pacientes progridem para insuficiência renal dentro de 20 anos após odiagnóstico 1; No entanto, evidências mais recentes indicam um prognóstico marcadamente pior, com a maioria dos pacientes desenvolvendo insuficiência renal em 10–15 anos, e apenas uma pequena proporção mantendo a função renal ao longo da vida semprogressão 2,3,4. Embora terapias direcionadas tenham recentemente alcançado avanços clínicos no manejo da IgAN, seu alto custo e início relativamente lento da eficácia continuam sendo grandes desafios, e o equilíbrio entre benefício clínico e risco ainda está em debate 5,6.

A medicina tradicional chinesa (MTC) demonstra vantagens distintas no tratamento de doenças complexas. É caracterizado por eficácia terapêutica estável, incidência relativamente baixa de reações adversas e efeitos sinérgicosmulti-alvo 7. Ao contrário dos agentes farmacológicos de alvo único, as fórmulas da MTC normalmente contêm múltiplos componentes bioativos que podem modular simultaneamente diversas vias biológicas. Esse modo de ação multi-componente e multi-alvo oferece uma potencial vantagem terapêutica no tratamento de doenças complexas como aIgAN 8. Na teoria da MTC, a IgAN não possui um nome específico da doença, mas é geralmente classificada como "hematúria", "edema", "dor nas costas", "vento renal" e "doença consupositiva". A maioria dos estudiosos considera que sua patogênese central envolve a Deficiência de Qi do Baço Pulmonar, levando à perda de controle sobre o Qi defensivo e, consequentemente, à invasão de vento, umidade, calor e toxinas, danificando os rins. Embora o rim seja o órgão principal envolvido, o coração, fígado, baço e pulmões também podemser afetados. Com base nesse conhecimento, diversas pesquisas se concentraram na identificação de remédios e fórmulas herbais com propriedades tonificantes de Qi, consolidação externa, dissipação de calor, desintoxicação e resolução de umidade para o tratamento clínico da IgAN10,11.

A Fórmula Yiqi Qingjie (YQQJ) é uma prescrição empírica eficaz utilizada no Departamento de Nefrologia do nosso hospital para o tratamento da IgAN. A fórmula é composta por sete ervas, incluindo Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) e Plantago asiatica L. (Cheqiancao). O YQQJ exerce funções terapêuticas de tonificar o Qi, consolidar o exterior, eliminar o calor, desintoxicar, ativar a circulação sanguínea e promover adiurese 12. Estudos clínicos demonstraram que a YQQJ reduz significativamente a proteinúria e a hematúria em pacientes com IgAN, melhora a função renal e alivia sintomas imunológicos relacionados à mucosa, ao mesmo tempo em que apresenta um perfil de segurançafavorável 12,13.

Embora essa fórmula tenha demonstrado eficácia clínica favorável, a base farmacologicamente ativa do material permanece difícil de elucidar porque as fórmulas da MTC contêm numerosos constituintes químicos. O perfilamento químico baseado exclusivamente em análise cromatográfica ou espectrométrica de massa pode revelar a composição química geral de uma fórmula; no entanto, não pode determinar quais compostos são absorvidos pela circulação sistêmica e contribuem diretamente para efeitos terapêuticos14. Além disso, estudos convencionais de farmacologia em redes dependem em grande parte de previsões baseadas em bancos de dados e normalmente triam compostos candidatos usando parâmetros como biodisponibilidade oral e semelhança com medicamentos. Essa abordagem pode negligenciar compostos que realmente exercem atividade farmacológica invivo 15.

Para enfrentar essas limitações, estudos recentes adotam cada vez mais estratégias analíticas integrativas que combinam cromatografia líquida de ultra-alta performance combinada com espectrometria de massa híbrida quadrupole-Orbitrap de alta resolução (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) e farmacologia de sistemas em pesquisas daMTC 16,17. A farmacoquímica sérica identifica compostos que entram na circulação sistêmica após a administração, fornecendo assim evidências farmacocineticamente relevantes para a triagem de potenciais constituintesbioativos 18. Enquanto isso, o UHPLC-Q-Orbitrap HRMS permite a detecção e caracterização estrutural altamente precisas de constituintes químicos dentro de matrizes herbaiscomplexas 19.

Comparado a abordagens que dependem exclusivamente de perfil químico ou previsão teórica de alvos, o fluxo de trabalho integrativo aplicado neste estudo — que compreende identificação de componentes baseada no UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, triagem farmacoquímica sérica, análise de farmacologia em redes e validação de acoplamento molecular — oferece várias vantagens metodológicas. O UHPLC-Q-Orbitrap HRMS permite a identificação abrangente e precisa de constituintes químicos complexos. A farmacoquímica sérica restringe os compostos candidatos àqueles que são realmente absorvidos pela circulação sistêmica, melhorando assim a plausibilidade biológica das análises subsequentes em rede. A análise de farmacologia em redes baseada em compostos absorvidos confirmados experimentalmente permite a exploração em nível de sistema de mecanismos multi-alvo e reflete melhor as características farmacológicas holísticas das fórmulas da MTC. O acoplamento molecular também fornece validação computacional preliminar das interações previstas composto-alvo e apoia a priorização racional das moléculas candidatas para verificação experimental subsequente. Coletivamente, esse fluxo de trabalho integrativo fornece uma estratégia confiável, eficiente e fisiologicamente relevante para elucidar a base material e os mecanismos de fórmulas herbais complexas como a YQQJ.

Esse fluxo de trabalho é particularmente adequado para investigar a base e os mecanismos farmacologicamente ativos de fórmulas herbais complexas quando dados de absorção in vivo podem ser obtidos a partir de estudos farmacocinéticos em animais ou humanos. É especialmente aplicável a fórmulas com eficácia clínica estabelecida, mas constituintes ativos pouco claros. No entanto, várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, a precisão da previsão de alvos depende da qualidade e integridade dos bancos de dados públicos. Segundo, o fluxo de trabalho foca em compostos protótipo detectados em circulação e não leva em conta metabólitos bioativos gerados in vivo. Terceiro, previsões derivadas de análises de farmacologia em redes requerem validação experimental adicional. Apesar dessas limitações, o fluxo de trabalho oferece uma abordagem eficiente e confiável para geração de hipóteses e priorização de alvos em estudos mecanicistas de fórmulas da MTC.

Portanto, este estudo utiliza o UHPLC-Q-Orbitrap HRMS para caracterizar sistematicamente tanto os componentes do extrato aquoso quanto os compostos circulantes do YQQJ, estabelecendo assim um banco de dados relativamente abrangente de potenciais constituintes ativos. Com base nesse conjunto de dados, a análise farmacológica em rede, combinada com validação de acoplamento molecular, prevê os potenciais componentes farmacologicamente ativos do YQQJ para o tratamento da IgAN e fornece uma base para investigações mecanicistas subsequentes.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais estavam em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitidas pelo Comitê de Bem-Estar Animal da China. Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC) do Centro Experimental de Animais do Hospital Guang'anmen.

1. Administração de Animais e Medicamentos

  1. Use doze ratos machos de 6 semanas de Sprague–Dawley (SD) pesando entre 200 e 230 g.
  2. Abrigue todos os animais no Centro Experimental de Animais.
    NOTA: Mantenha a temperatura da casa entre 20 e 26 °C e a umidade relativa entre 40 e 70%. Use um ciclo claro/escuro de 12 horas por 12 horas para simular ritmos circadianos naturais.
  3. Aclimatar os animais por 7 dias em condições padrão, com acesso livre a comida e água antes do experimento. Divida aleatoriamente os ratos em dois grupos (n = 6 por grupo): um grupo controle e um grupo tratado com drogas.
  4. Consulte a dose equivalente convertida pela área de superfície corporal entre humanos eanimais 20. Administrar extrato concentrado de YQQJ via gavage oral a 24,68 mL/(kg·dia) ao grupo tratado com medicamento. Administrar simultaneamente um volume igual de água destilada ao grupo controle para garantir o tratamento síncrono.
  5. Continue administrando por 1 dia. Divida a dose diária total em três administrações iguais (por exemplo, às 08:00, 13:00 e 18:00) para garantir a dose completa em 1 dia.
    NOTA: Animais rápidos por 12 horas antes do último golpe, com acesso livre à água.
  6. Colete amostras de sangue às 2 e 8 horas após a administração final. Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 1% (50 mg/kg). Colete sangue da aorta abdominal.
  7. Deixe as amostras de sangue em pé em temperatura ambiente por 1 h, depois centrifuge a 450 × g por 5 minutos a 4 °C. Verifique se o sobrenadante (soro) está limpo e livre de hemólise. Transfira o soro sobrenadante e armazene a –80 °C para análise posterior.

2. Preparação de soluções

  1. Preparação de soluções de teste
    1. Colete todas as ervas brutas de YQQJ conforme a fórmula. Adicione 4 volumes de água purificada na panela de decocção e deixe de molho por 20 minutos.
      NOTA: Água purificada foi adicionada às ervas na proporção 4:1 (v/w).
    2. Leve a mistura para ferver e continue a decocção por 30 minutos em fogo baixo. Filtre através da gaze e colete o filtrado. Repita a decocção dos resíduos com 4 volumes de água por mais 30 minutos e filtre novamente.
    3. Combine os dois filtrados. Concentre a solução combinada usando um evaporador rotativo ajustado a uma temperatura de banho-maria de 60 °C até atingir uma concentração de 3 g/mL (p/v, equivalente a materiais medicinais brutos).
    4. Verifique se o extrato concentrado é um líquido escuro e viscoso, sem precipitação visível. Armazene a 4 °C para uso posterior.
  2. Preparação de soluções de referência
    1. Pesar com precisão os seguintes compostos de referência: Ácido Deacetilasperulosídico, Ácido Geniposídico, Ácido logânico, Moronisídeo, Ácido clorogênico, Swerosídeo, Ácido plantaagoguanínico, Rhein-8-O-β-D-glucopiranósido, Genistina, Apigenina-7-glicosídeo, Diosmetina-7-O-β-D-glicopiranosídeo, Calicosina, Protodioscina, Genisteína, Diosmetina, Pseudoprotodioscina, Formononetina, 3-Hidroxi-9,10-dimetoxipterpampano, Aloeemodina, Reno, Dioscina.
    2. Dissolva cada composto no metanol, faça um vórtice na mistura por 1 minuto e depois sonice em temperatura ambiente por 10 minutos para garantir a dissolução completa.
    3. Dilua cada solução com metanol para atingir uma concentração final de 10 μg/mL para cada padrão.

3. Preparação da amostra

  1. Preparação de amostras de extrato de YQQJ
    1. Pipete 100 μL do extrato aquoso YQQJ em um tubo centrífugo de 1,5 mL. Adicione 300 μL de metanol e vórtice por 1 minuto. Centrífuga a 1800 × g, 4 °C por 10 minutos. Certifique-se de que o sobrenadante resultante esteja limpo e livre de partículas suspensas.
    2. Pegue 100 μL do sobrenadante e misture com 100 μL de água ultrapura para obter uma diluição 1:1. Vórtice suavemente e transfira para um frasco autosampler para análise.
  2. Preparação de amostras de soro contendo medicamentos
    1. Pipete 100 μL de soro em um tubo centrífugo de 1,5 mL. Adicione 300 μL de metanol e faça vórtice por 10 minutos para garantir a precipitação de proteínas. Centrífuga a 1800 × g., 4 °C por 10 minutos.
    2. Colete 270 μL do sobrenadante e transfira para um tubo limpo. Evapore o sobrenadante até a secura usando um concentrador centrífugo a vácuo ajustado a 120 × g., 37 °C por 4 horas até que um resíduo sólido visível se forme.
    3. Reconstitua o resíduo com 90 μL de solução aquosa de metanol a 50%. Deixe o vórtice por 1 minuto para dissolver completamente o resíduo, depois centrifuge novamente a 1800 × g., 4 °C por 10 minutos.
    4. Colete 80 μL do supernadante transparente final e transfira-o para um frasco autoamostrador para análise.

4. Condições analíticas

  1. Condições cromatográficas
    1. Realizar separação cromatográfica usando um sistema UHPLC equipado com uma coluna cromatográfica.
    2. Use uma fase móvel binária (Fase A: água com 0,1% de ácido fórmico; Fase B: acetonitril). Aplique um programa de elução de gradiente conforme mostrado na Tabela 1, com uma vazão de 0,3 mL/min. Ajuste a temperatura da coluna para 40 °C e o volume de injeção para 6,0 μL.
      NOTA: As especificações da coluna são 2,1 mm × 100 mm, dimensão de partícula de 1,8 μm.
  2. Condições da EM
    1. Analise amostras usando um espectrômetro de massa quadrupolo-orbitrap equipado com uma sonda de ionização eletrospray aquecida (HESI).
    2. Defina os parâmetros da seguinte forma: tensão de ionização: 3,7 kV (modo positivo) / 3,5 kV (modo negativo); temperatura capilar: 320 °C; Pressão do gás da bainha: 30 psi; pressão auxiliar do gás: 10 psi; temperatura de desolvação: 300 °C; gás de revestimento e o gás auxiliar: nitrogênio; gás de colisão: nitrogênio, 1,5 mTorr.
    3. Adquirir dados em modo Full scan/dd-MS 2 . Defina os parâmetros completos da varredura da seguinte forma: resolução 70000, controle automático de ganho alvo 1×106, tempo máximo de isolamento 50 ms e alcance de varredura m/z 100 – 1500.
    4. Colete os dados do dd-MS2 com os parâmetros de resolução 17500, alvo de controle automático de ganho 1×105, tempo máximo de isolamento 50 ms, selecione os íons parentais mais intensos n (n≤10) mais intensos para fragmentação juntamente com um mecanismo dinâmico de exclusão, janela de isolamento de m/z 2, energia de colisão 10 V, 30 V, 60 V e limiar de intensidade 1×105.

5. Processamento de dados MS

  1. Processe os dados adquiridos do MS usando um software especializado de processamento de dados. Navegue até o módulo Importar Dados e faça o upload dos arquivos de dados brutos.
  2. Execute o módulo Peak Picking e realize a deconvolução de pico para agrupar íons adudutos e gerar características compostas.
  3. Pesquise em bancos de dados de referência de compostos, bancos de dados de previsão de alvos e literatura publicada relevante para identificação de candidatos.
  4. Identifique compostos usando duas estratégias complementares de identificação baseadas em dados de EM de alta resolução.
    1. Identificação baseada em correspondência de padrões de referência. Confirme os compostos por meio da comparação com padrões de referência autênticos. Aceitem identificações somente quando todos os seguintes critérios forem atendidos:
      1. Precisão de massa: O erro de massa tanto dos íons precursores quanto dos íons fragmentados deve estar dentro de ±5 ppm.
      2. Similaridade espectral: A pontuação de similaridade cosseno entre o espectro experimental MS/MS e o espectro MS/MS do padrão de referência deve ser ≥ 0,85.
      3. Distribuição isotópica: A pontuação de correspondência de padrões isotópicos deve ser ≥ 90%.
      4. Comportamento cromatográfico: O desvio de tempo de retenção entre o composto detectado e o padrão de referência deve ser < 0,2 min.
        NOTA: Compostos que atendem a todos os critérios acima são anotados como MSI Nível 1, representando identificação estrutural confirmada.
    2. Identificação baseada em dados de alta resolução da EM e na previsão espectral in silico. Para compostos sem padrões de referência disponíveis, realize a identificação putativa baseada em medições de massa precisas e previsão espectral computacional. Aceite anotações apenas quando os seguintes critérios forem satisfeitos:
      1. Precisão de massa: O erro de massa dos íons precursores deve estar dentro de ±5 ppm, e o erro de massa dos íons fragmentados deve estar dentro de ±10 ppm.
      2. Similaridade espectral: Compare o espectro experimental MS/MS com o espectro teórico MS/MS gerado a partir da estrutura composta SMILES usando o algoritmo Progenesis QI. Aceite correspondências com pontuação de similaridade cosseno ≥ 0,60.
      3. Distribuição isotópica: A pontuação de correspondência de padrões isotópicos deve ser ≥ 90%.
      4. Previsão do comportamento cromatográfico: A diferença entre o tempo de retenção experimental e o tempo previsto por aprendizado de máquina deve ser < 1,0 min.
        NOTA: O modelo de predição do tempo de retenção foi treinado usando dados cromatográficos experimentais de mais de 2000 compostos de referência analisados sob as mesmas condições cromatográficas. Compostos que atendem a esses critérios são anotados como MSI Nível 2, representando compostos supostamente identificados com alta confiança estrutural.

6. Farmacologia de redes

  1. Identificação de componentes absorvidos pelo sangue e alvos relacionados à IgAN
    1. Importe os protótipos identificados de componentes absorvidos pelo sangue do YQQJ para os bancos de dados de previsão de alvos. Selecione "Homo sapiens" como espécie-alvo e obtenha seus potenciais alvos. Registre esses como o conjunto-alvo de compostos absorvidos pelo sangue no YQQJ.
    2. Use a palavra-chave "Nefropatia por IgA" para obter alvos de doenças relacionadas à IgAN das plataformas integradas de bioinformática. Consolide resultados de múltiplas fontes para minimizar o viés.
      NOTA: Use um banco de dados de proteínas para converter todos os alvos recuperados no formato de Símbolo Genético para maior consistência.
  2. Construção da rede de interação proteína-proteína (PPI) e identificação de alvos centrais
    1. Junte o conjunto-alvo de compostos absorvidos pelo sangue do YQQJ com o conjunto-alvo da doença IgAN e extraia sua interseção.
    2. Envie os alvos que se cruzam para a plataformaPPI 21. Configure as configurações: defina o organismo como Homo sapiens, a pontuação de confiança como 0,90 e descarte todos os nós desconectados.
    3. Importe os dados do PPI para o softwarede visualização 22. Inicie o plugin de análise topológica. Calcule a centralidade de grau (DC)23, a centralidade entre os degraus (BC)24 e a centralidade de proximidade (CC)25.
    4. Selecionar os principais alvos terapêuticos do YQQJ contra o IgAN filtrando nós com valores de parâmetros topológicos (DC, BC e CC) que excedam a mediana.
  3. Construção e análise da rede integrada "YQQJ–componentes absorvidos por sangue–alvos–vias–doença"
    1. Prepare o arquivo de atributos do nó: Crie uma planilha contendo duas colunas. Rotule a primeira coluna Nome do Nó e o segundo Tipo de Nó. Atribua uma das cinco categorias (Fórmula, Componente Absorvido pelo Sangue, Alvo de Interseção, Via ou Doença) a cada nó.
    2. Prepare o arquivo de interação de rede (borda): Crie uma planilha definindo as conexões entre nós (por exemplo, Componente Absorvido por Sangue para Alvo de Interseção). Certifique-se de que todos os nomes dos nós correspondam aos do arquivo de atributos do nó para evitar erros de mapeamento.
    3. Importar e construir a rede: Inicie o software de visualização da rede. Navegue até Arquivo > Importar > Rede para carregar o arquivo de borda. Na janela de visualização, mapeie as colunas como Nó Fonte e Nó Alvo e clique em OK para gerar o gráfico inicial.
    4. Mapear atributos do nó e definir estilos visuais: Importar o arquivo de atributos do nó via Arquivo > Importar > Tabela. Abra o painel de Estilo e mapeie a coluna do Tipo de Nó para propriedades visuais específicas, incluindo formato do nó, cor de preenchimento e tamanho.
    5. Execute análise topológica: navegue até Ferramentas > Análise de Rede para realizar cálculos topológicos. Filtre e identifique compostos ativos centrais e alvos terapêuticos principais com base nos valores de grau.
      NOTA: Use os mesmos parâmetros topológicos descritos no passo 6.2 para garantir consistência na identificação dos nós centrais.
    6. Exportar a imagem da rede: Finalizar o layout da rede. Navegue até Arquivo > Exportar > Rede para Imagem para salvar a visualização otimizada.
  4. Enriquecimento GO e análises da via KEGG
    1. Envie a lista de genes: Abra a plataforma de anotação funcional baseada na web. Navegue até a área Passo 1: Submeter a Lista de Genes e envie a lista principal de genesalvo previamente filtrada 26.
    2. Selecione espécies: Nos menus suspensos para o Passo 2: Input como Espécie e Passo 3: Análise como Espécie, selecione H. sapiens. (humano) para garantir que a análise seja realizada dentro do contexto biológico correto.
    3. Configurar análise personalizada: Selecione o modo de Análise Personalizada . Na categoria Enriquecimento , verifique os seguintes bancos de dados: Ontologia Gênica (GO) Função Molecular (MF), Processo Biológico GO (BP), Componente Celular GO (CC) e Via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG).
    4. Defina limiares de significância: Defina o corte do valor P para < 0,01, o Enriquecimento Mínimo para ≥ 1,5 e a Sobreposição Mínima para ≥ 3. Mantenha todos os outros parâmetros nas configurações padrão.
    5. Execute a análise: Clique no botão Análise de Enriquecimento para enviar a tarefa e aguarde a conclusão do cálculo.
    6. Recuperar e exportar resultados: Acesse a página do relatório de análise gerada. Clique no botão de download para exportar os dados detalhados de enriquecimento em formato de planilha, junto com os gráficos de barras e mapas de calor correspondentes.

7. Verificação de acoplamento molecular

  1. Baixe as estruturas proteicas 3D de alta resolução (< 2,50 Å) dos alvos centrais e as estruturas químicas 2D dos constituintes absorvidos pelo sangue dos bancos de dados de biologiaestrutural 27.
  2. Inicie o software de acoplamento molecular e importe as estruturas baixas.
  3. Execute as seguintes etapas de pré-processamento sequencialmente: navegar para Editar > Remover Água para eliminar moléculas de água; selecione Editar > Remover Heteroátomos para descartar resíduos não padrão.
  4. Vá em Editar > Hidrogênios > Adicionar > Apenas Polar para adicionar átomos de hidrogênio polar. Salve as estruturas processadas no formato PDBQT via Arquivo > Salve > Escreva PDBQT.
  5. Defina o local de acoplamento usando a ferramenta Grid > Grid Box . As dimensões das caixas da grade foram ajustadas adaptativamente (20–100 Å) para garantir cobertura total das regiões de ligação previstas.
  6. Inicialize os parâmetros de acoplamento: Selecione o receptor via Docking > Macromolecule > defina o nome de arquivo Rigid e abra o ligando via Docking > Ligand > Open. Os parâmetros de acoplamento foram definidos da seguinte forma: exaustividade = 32, faixa de energia = 3 kcal/mol, e até 10 modos de ligação foram mantidos. Para proteínas com ligantes co-cristalizados, a caixa da grade de acoplamento estava centrada no centróide do ligante com extensão de 8,0 Å, enquanto para proteínas sem ligantes co-cristalizados, bolsões de ligação foram previstos usando DoGSiteScorer com aproximadamente 90% de cobertura.
  7. Escolha o Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA) como estratégia de busca. Execute a simulação via Docking > execute o AutoDock.
  8. Avalie a afinidade de ligação com base na energia de ligação calculada (pontuação de acoplamento)28.
    NOTA: Uma energia de ligação menor indica uma bioatividade prevista mais forte e maior estabilidade estrutural do complexo proteína-ligante. Um limiar de ≤ -5,0 kcal/mol é tipicamente usado para identificar estabilidade favorável na ligação.

Resultados

Análise dos constituintes no extrato aquoso YQQJ
A análise dos componentes do extrato aquoso YQQJ foi realizada sob as condições estabelecidas no PROTOCOLO 4. O HRHMS UHPLC-Q-Orbitrap foi empregado tanto em modos de varredura completa de íons positivos quanto negativos para perfilar o extrato aquoso de YQQJ, e o cromatograma de íons de pico de base (BPI) obtido é mostrado na Figura 1. Com base nisso, um banco de dados de constituintes químicos autoestabelecido, combinado com a caracterização espectral MS/MS, permitiu a identificação bem-sucedida de 185 compostos do extrato aquoso, com informações detalhadas resumidas na Tabela Suplementar 1. Padrões representativos de correspondência espectral MS/MS e fragmentação usados para identificação de compostos são ilustrados na Figura Suplementar 1. A análise estatística das categorias de compostos revelou que flavonoides e terpenoides eram os constituintes predominantes no YQQJ, representando 94 compostos, a proporção mais abundante.

Componentes absorvidos pelo sangue do YQQJ
Para esclarecer as substâncias bioativas diretas in vivo, amostras de soro coletadas após a administração do YQQJ foram analisadas. O cromatograma BPI do soro em branco (Figura 2) foi incluído para comparação, a fim de distinguir compostos derivados de medicamentos dos componentes endógenos do soro. Com base no IBP do soro contendo medicamento (Figura 3), foram identificados um total de 28 componentes protótipos absorvidos pela corrente sanguínea, incluindo principalmente flavonoides, terpenoides e esteroides. Cromatogramas iônicos extraídos (EICs) de compostos representativos no extrato YQQJ, soro em branco e soro contendo fármacos confirmaram ainda mais a presença de componentes derivados do medicamento na circulação (Figura Suplementar 2). Entre eles, 10 compostos se originaram de Spatholobus suberectus Dunn, 7 de Dioscorea nipponica Makino, 7 de Astragalus membranaceus, 6 de Hedyotis diffusa Willd., 6 de Lonicera japonica Thunb., 4 de Plantago asiatica L. e 4 de Rheum palmatum.L., conforme resumido na Tabela Suplementar 1.

Previsão do alvo de componentes absorvidos por sangue da YQQJ relacionados à IgAN
Um total de 28 protótipos identificados de constituintes que entram na corrente sanguínea foram inseridos em bancos de dados de previsão de alvos, resultando em 459 alvos potenciais. Enquanto isso, 2779 alvos relacionados à IgAN foram recuperados de plataformas integradas de bioinformática. A análise de interseção identificou 247 alvos sobrepostos entre YQQJ e IgAN (Figura 4).

Construção e análise da rede PPI
Os 247 alvos que se cruzam foram carregados na plataforma PPI, e o software de visualização foi utilizado para selecionar os alvos centrais com base em três parâmetros topológicos: DC, BC e CC. Um total de 42 alvos foi finalmente identificado como nós centrais. O fluxo de trabalho utilizado para triar esses alvos centrais é resumido na Figura Suplementar 3. Na rede PPI, o tamanho e a cor dos nós variaram com os valores dos parâmetros (Figura 5), entre os quais TP53, SRC, AKT1, ESR1 e STAT3 estavam entre os cinco principais alvos principais.

Rede "Fórmula–componentes absorvidos pelo sangue–alvos centrais–vias–doença" da YQQJ
Para revelar sistematicamente os mecanismos multicomponentes e multi-alvo do YQQJ contra IgAN, foi construída uma rede de interação "Fórmula–Componentes Absorvidos pelo Sangue–Alvos Coreais–Vias –Doença" usando software de visualização. A rede consistia em 96 nós e 459 arestas, onde cada aresta representava uma relação ou interação entre dois nós (Figura 6).

Análises de enriquecimento GO e KEGG
A análise de enriquecimento GO dos 42 metas principais revelou 1162 termos BP, 52 termos CC e 92 termos MF. A Figura 7 mostra os 10 termos GO mais significativamente enriquecidos nas categorias BP, CC e MF. A análise de enriquecimento KEGG identificou ainda 182 vias associadas a esses alvos centrais. A Figura 8 ilustra as 20 vias significativamente enriquecidas mais intimamente relacionadas à patogênese da IgAN. Nesses gráficos, cores vermelhas mais escuras indicam maior significância estatística, enquanto bolhas maiores ou comprimentos de barras maiores representam um número maior de alvos enriquecidos dentro de cada via.

Avaliação de acoplamento molecular
Neste estudo, com base na análise anterior de alvos-chave e vias relacionadas do YQQJ no tratamento do IgAN 29,30,31,32, seis alvos centrais, incluindo CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) e PIK3CA (PDB ID: 5FI4), foram selecionados como proteínas receptoras para acoplamento molecular. Correspondentes à patogênese central da MTC do IgAN, definida como "vento patogênico, calor úmido e toxinas invadindo o rim", componentes ativos representativos com propriedades de limpeza de calor, remoção de umidade e desintoxicação foram selecionados como ligandos, a saber, ácido Deacetilasperulossídico e ácido geniposídico de Hedyotis diffusa Willd., e Dioscina de Dioscorea nipponica. Makino. Os resultados do acoplamento estão mostrados na Figura 9. Entre todas as combinações ligante-receptor, a Dioscina apresentou energias de ligação marcadamente menores com todos os alvos selecionados, sugerindo uma maior afinidade de ligação prevista. Exceto pelas interações entre JUN e ácido Deacetilasperulossídico/ácido geniposídico, os outros pares de acoplamento também demonstraram atividades de ligação favoráveis. Conformações representativas de acoplamento 3D são visualizadas na Figura 10.

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Figura 1: Cromatogramas de íons de pico de base do extrato aquoso YQQJ. (A) Cromatograma BPI em modo iônico positivo. (B) Cromatograma BPI em modo iônico negativo. Os cromatogramas mostram o perfil químico geral do extrato aquoso YQQJ sob as condições estabelecidas do UHPLC-Q-Orbitrap HRMS. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Cromatogramas de íons de pico base do soro em branco. (A) Cromatograma BPI em modo iônico positivo. (B) Cromatograma BPI em modo iônico negativo. Os cromatogramas representam o perfil de fundo sérico endógeno usado como controle para comparação com soro contendo medicamento, a fim de distinguir componentes derivados de fármacos de constituintes endógenos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Cromatogramas de Íons de Pico de Base do soro contendo YQQJ. (A) Cromatograma BPI em modo iônico positivo. (B) Cromatograma BPI em modo iônico negativo. Os cromatogramas representam o perfil dos componentes absorvidos pelo sangue detectados no soro após a administração do YQQJ. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Diagrama de Venn de alvos sobrepostos entre YQQJ e IgAN. O diagrama mostra o número de alvos previstos para YQQJ, alvos relacionados ao IgAN e sua interseção, destacando os alvos compartilhados potencialmente envolvidos em efeitos terapêuticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Rede de interação proteína-proteína (PPI) de alvos centrais. Nós representam alvos proteicos, e arestas representam interações entre alvos. O tamanho dos nós e a intensidade da cor correspondem aos valores de grau, com nós maiores e mais escuros indicando maior conectividade dentro da rede. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6: Rede integrada de componentes, alvos, vias e doenças do YQQJ. A rede ilustra as relações entre a fórmula, componentes absorvidos pelo sangue, alvos centrais, vias e IgAN. Triângulo representa doença; círculo representa caminhos; O nó em forma de V representa a fórmula YQQJ; Diamante representa ervas; hexágono representa componentes; Octagon representa protótipos de componentes absorvidos por sangue; Retângulo representa alvos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 7: Análise de enriquecimento GO de alvos centrais. O gráfico de barras mostra os 10 principais termos enriquecidos da Ontologia Gênica nas categorias BP, CC e MF. O eixo x representa os termos GO, e o eixo y mostra −log10(valor p), indicando a importância do enriquecimento. Abreviações: BP = Processo biológico; CC = componente celular; MF = Função molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 8: Análise de enriquecimento de vias KEGG de alvos centrais. O gráfico de bolhas mostra as 20 principais vias enriquecidas do KEGG. O tamanho do ponto indica o número de genes enriquecidos, e o gradiente de cor indica −log10 (valor p), com cores mais vermelhas indicando maior significância estatística. O eixo x mostra a razão gênica, e o eixo y lista os termos das vias. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-9
Figura 9: Mapa de calor de energia de ligação molecular de acoplamento. O mapa de calor apresenta energias de ligação (kcal/mol) entre alvos centrais e compostos-chave absorvidos pelo sangue. Valores mais baixos de energia de ligação indicam uma afinidade de ligação prevista mais forte. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-10
Figura 10: Conformações representativas de acoplamento molecular. (A) Conformação de ligação do ácido Deacetilasperulossídico com CASP3. (B) Conformação de ligação de Dioscina com STAT3. (C) Conformação de ligação do ácido geniposídico com PIK3CA. As imagens mostram as interações previstas entre ligante e proteína e as orientações de ligação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura Suplementar 1: Identificação estrutural de compostos representativos por MS/MS de alta resolução. (A) Comparação espectral cabeça-cauda do ácido Deacetilasperulosídico entre o espectro experimental (superior, vermelho) e o espectro do banco de dados de referência (inferior, azul). (B) Espectro de fragmentação MS/MS de alta resolução do ácido Deacetilasperulosídico. (C) Comparação espectral cabeça-cauda do ácido geniposídico com o banco de dados de referência. (D) Espectro experimental de fragmentação MS/MS do ácido geniposídico. (E) Comparação espectral cabeça a cauda de Dioscina com o banco de dados de referência. (F) Espectro de fragmentação MS/MS de alta resolução da Dioscina. Esses painéis ilustram a correspondência espectral usada para identificação de compostos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Cromatografias iônicas extraídas (EICs) de compostos representativos entre amostras. (A) EIC do ácido Deacetilasperulossídico. (B) EIC do ácido geniposídico. (C) EIC de Dioscin. Para cada painel, o traço superior representa o extrato aquoso YQQJ (ZY), o traço do meio representa o soro controle em branco (KBX) e o traço inferior representa amostras de soro contendo componentes absorvidos pelo sangue após administração do YQQJ (GYX). A comparação destaca a presença de compostos derivados de medicamentos no soro. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Fluxo de trabalho para triagem dos alvos centrais. O fluxograma ilustra o processo passo a passo da identificação de alvos, incluindo a previsão de alvos compostos, coleta de alvos relacionados à IgAN, análise de interseções, construção de redes PPI e triagem de alvos centrais com base em parâmetros topológicos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tempo (min)Fase móvel
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabela 1: Programa de elução por gradiente do UHPLC. A tabela apresenta a composição de fase móvel e as condições de gradiente usadas para separação cromatográfica, incluindo pontos de tempo e as proporções correspondentes de solventes aquosos (Fase A) e orgânicos (Fase B).

Tabela suplementar 1: Constituintes químicos identificados do extrato aquoso de YQQJ. A tabela lista compostos identificados pelo UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, incluindo componentes absorvidos por sangue protótipo (A1–A28), juntamente com sua classificação e origem herbal. Abreviações: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Reumato palmado L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiática L.; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Classes compostas incluem A = alcaloides; Ald = aldeídos; F = Flavonoides; N = Nucleósseos; O = Outros; OA = Ácidos orgânicos; P = Fenóis; PA = Ácidos fenólicos; Phe = Fenilpropanoides; Q = Quinones; S = Sacarídeos; STE = Esteroides; T = Terpenoides; Taninos = Taninos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

No presente estudo, uma estratégia integrada que combina "identificação UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – análise farmacoquímica sérica – predição farmacológica de redes – validação de acoplamento molecular" foi empregada para elucidar sistematicamente a base material potencial e os mecanismos do YQQJ no tratamento do IgAN. Diferentemente de pesquisas anteriores que se baseavam principalmente na EM para analisar constituintes químicos de fórmulas herbais e depois previam mecanismos usando apenas farmacologiaem rede 16, a farmacoquímica sérica segue um fluxo de trabalho de "constituintes herbais complexos – componentes absorvidos pelo sangue – substâncias ativas diretamente in vivo – base de material farmacodinâmico". Ao identificar os componentes que entram na circulação sistêmica após a administração, essa abordagem é amplamente considerada uma estratégia eficaz para identificar a base material farmacodinâmica das fórmulas da MTC.

Neste estudo, a análise UHPLC-Q-Orbitrap HRMS identificou inicialmente 185 constituintes no YQQJ, dos quais 28 foram confirmados como compostos protótipos absorvidos por sangue, fornecendo assim uma base química confiável para estudos mecanicistas subsequentes. A precisão dessa identificação dependia da correspondência abrangente do tempo de retenção, massa exata e informações de fragmentação MS/MS 14. Com base na estratégia de farmacoquímica sérica, esses compostos protótipo absorvidos pelo sangue foram usados como ponto de partida para a construção de uma rede, o que aumentou a relevância entre componentes herbais e a eficácia real invivo 33. Ao integrar alvos de interseção composto-doença com triagem baseada em IBP dos nós centrais, seguida por análises de enriquecimento GO e KEGG, foramidentificadas vias-chave de sinalização associadas à IgAN 15. Resultados de acoplamento molecular sugeriram que os principais componentes absorvidos pelo sangue derivavam de Hedyotis diffusa Willd. e Dioscorea nipponica Makino.pode interagir com alvos centrais com base em afinidades de ligação previstas, em vez de atividade funcional confirmada experimentalmente. Esses achados apoiam a hipótese de que o ácido Deacetilasperulossídico, ácido geniposídico e Dioscina podem servir como potenciais constituintes farmacodinâmicos-chave do YQQJ, aguardando validação experimental adicional.

Do ponto de vista técnico, o pré-tratamento da amostra foi crucial. Devido à complexidade do soro e à presença de proteínas endógenas (por exemplo, hormônios e enzimas), a interferência na detecção de componentes absorvidos pelo sangue é inevitável. Neste estudo, a precipitação de metanol foi aplicada para enriquecer analitos e reduzir a interferência de fundo, garantindo tanto a sensibilidade quanto a precisão da análise daEM 34. Em relação aos pontos de tempo da amostra de sangue, diferentes constituintes em fórmulas herbais podem apresentar padrões distintos de absorção e transformação in vivo, o que pode influenciar sua detecção no soro. Portanto, com base em testes preliminares, amostras de soro foram coletadas em 2 h e 8 h após a administração final para maximizar a cobertura dos constituintes circulantes.

Vários passos procedurais foram considerados particularmente críticos para a implementação bem-sucedida desse fluxo de trabalho. A identificação precisa do composto depende fortemente da avaliação combinada do tempo de retenção, precisão de massa de alta resolução e íons de fragmentos MS/MS diagnósticos. Além disso, pontos de tempo apropriados para amostragem sérica são essenciais para capturar constituintes absorvidos pelo sangue que podem aparecer na circulação em diferentes estágios após a administração. Portanto, é necessária uma otimização cuidadosa do pré-tratamento da amostra e das condições de separação cromatográfica para garantir a detecção confiável de compostos protótipo em matrizes biológicas complexas.

Desafios analíticos potenciais podem surgir durante a preparação da amostra e a análise da EM. Por exemplo, precipitação incompleta de proteínas pode resultar em efeitos matriciais que suprimem a eficiência de ionização, enquanto ruído de fundo excessivo pode reduzir a sensibilidade à detecção. Esses problemas podem ser mitigados otimizando as razões dos solventes durante a precipitação de proteínas, melhorando as condições de separação cromatográfica e ajustando os parâmetros de aquisição da EM. Durante o processamento de dados, anotações de compostos falsos positivos podem ocorrer quando se depende exclusivamente da correspondência de banco de dados; portanto, recomenda-se a verificação manual dos padrões de fragmentação MS/MS e do comportamento de retenção para melhorar a confiabilidade da identificação.

Diversas considerações metodológicas foram incorporadas nesse trabalho. Primeiro, em vez de aplicar critérios convencionais como biodisponibilidade oral e semelhança com medicamentos, apenas componentes absorvidos de sangue verificados experimentalmente foram usados para a predição do alvo. Essa abordagem evitou a possível omissão de compostos ativos devido a limiares de filtragem pré-definidos e eliminou constituintes irrelevantes que não estão biodisponíveis in vivo, fortalecendo assim a relevância fisiológica da previsão deredes 16. Segundo, a seleção de ligantes ativos para acoplamento focou especificamente em componentes principais originados de ervas com funções de "dissipar a umidade do vento e eliminar a toxina térmica" (Hedyotis diffusa Willd. e Dioscorea nipponica Makino), estabelecendo uma ponte mecanicista entre o conceito patológico da MTC de "toxina do vento úmida e calor invadindo o rim" e as características patológicas modernas da IgAN. Isso fornece evidências preliminares que apoiam a teoria da MTC sobre correlação fórmula–padrão. Terceiro, considerando possíveis diferenças no tamanho e qualidade dos dados entre bancos de dados, múltiplas plataformas foram integradas para ampliar a cobertura alvo e reduzir o viés introduzido por qualquer bancode dados único 35.

Comparado às estratégias convencionais que aplicam diretamente a farmacologia em rede a todos os constituintes químicos detectados, o fluxo de trabalho atual enfatiza a priorização de compostos guiada por evidências com base em componentes absorvidos pelo sangue detectados experimentalmente. Esse processo de filtragem passo a passo reduz o número de compostos candidatos que entram na análise computacional e melhora a interpretabilidade das redes de interação composto–alvo. Além disso, ao contrário de estudos voltados para metabolômica que capturam principalmente perturbações metabólicas endógenas, a estratégia atual foca em compostos protótipos exógenos derivados de medicamentos fitoterápicos, permitindo assim uma atribuição mais direta da atividade farmacológica a constituintes fitoterápicos específicos.

Do ponto de vista metodológico prático, esse fluxo de trabalho oferece várias vantagens para investigar formulações herbais complexas. A integração do HRMS com a farmacoquímica sérica permite a identificação confiável dos constituintes biodisponíveis, enquanto a subsequente combinação de farmacologia em rede e acoplamento molecular estabelece uma estrutura analítica hierárquica que liga evidências químicas à previsão mecanicista. Além disso, restringir a construção da rede a compostos experimentalmente verificados reduz a complexidade da rede e facilita a identificação mais clara das interações composto-alvo centrais.

Este estudo também apresenta limitações. Primeiro, farmacologia de redes e acoplamento molecular são abordagens computacionais preditivas. Forte afinidade de ligação não necessariamente se traduz em regulação biológica in vivo, já que o acoplamento molecular não leva em conta a dinâmica proteica, o contexto celular ou a sinalização a jusante. Além disso, o atual protocolo de acoplamento não incluiu validação de reacoplamento usando ligantes cocristalizados nem benchmarking contra inibidores conhecidos, o que pode limitar a avaliação da precisão do acoplamento. Estudos futuros que incorporem validação baseada em RMSD, simulações de dinâmica molecular e ensaios experimentais fortalecerão ainda mais a confiabilidade dessas previsões. Atualmente, nosso grupo concluiu a validação mecanicista demonstrando que a Dioscina atua via JAK2/STAT3, o que fortalece em certa medida a credibilidade da previsão e fornece suporte experimental parcial para os principais alvos identificados neste estudo, embora outras interações componente-alvo ainda exijamconfirmação 36. Segundo, as influências da compatibilidade proporcional e das relações de dosagem entre ervas não foram incorporadas na análise atual. Trabalhos futuros podem introduzir modelos de rede ponderados dose-efeito para refletir melhor as práticas clínicas deprescrição 37.

Em conclusão, o fluxo de trabalho atual — identificação de constituintes absorvidos por sangue baseada em EM de alta resolução, análise focada em alvos e vias em farmacologia em rede, e validação por acoplamento molecular — permite o estreitamento eficiente da base do material ativo e dos alvos de ação a partir de uma fórmula herbal complexa. Isso fornece uma direção experimental clara para verificação biológica subsequente e acelera investigações mecanicistas das fórmulas da MTC. No futuro, integrar metabolômica espacial, modelos organoides e tecnologias multi-ômicas pode permitir a validação dinâmica e tridimensional e a extensão das descobertas atuais em sistemas que recapitulam mais de perto condições fisiológicas e patológicas, fornecendo assim evidências mais robustas para elucidar a base científica das fórmulas da MTC.

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 81973675), o Projeto de Promoção de Hospitais Médicos Chineses de Alto Nível (Bolsa nº HLCMHPP2023039), e a Fundação de Ciências Naturais de Pequim (Bolsa nº 7252259).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AutoDock 4.2.6O Instituto de Pesquisa de Roteiros-
Coluna cromatográficaWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeTecnologia do Laboratório HettichMikro 220R
Plataformas integradas de bioinformáticaWeizmann  Instituto   of  Ciência-Banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/)
Plataformas integradas de bioinformáticaThe  Johns  Hopkins  Universidade & nbsp; Escola  of  Medicina-Banco de dados OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitriloThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MetanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L ÁguaThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL Ácido fórmicoThermo Fisher ScientificA117-50
Software de processamento de dados em espectrometria de massaWaters Corp.-Software Progenesis QI 3.0
Software de acoplamento molecularLaboratório OlsonAutoDock 4.2.6
Plataforma PPIEmpresa de banco de dados STRING-A plataforma online STRING (https://string-db.org)
Banco de dados de proteínasInstituto Europeu de Bioinformática; o Instituto Suíço de Bioinformática; Recursos de Informação sobre Proteínas-Plataforma UniProt (https://www.uniprot.org/)
Espectrômetro de massa quadrupolar orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Bancos de dados de compostos de referênciaTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
Evaporador rotativoShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Bancos de dados de biologia estrutural.Laboratório Nacional de Brookhaven-O banco de dados RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
Bancos de dados de biologia estrutural.Centro Nacional de Informação em Biotecnologia-O banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Bancos de dados de previsão de alvosSIB Instituto Suíço de Bioinformática-Banco de dados SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
Bancos de dados de previsão de alvosXangai & nbsp; Instituto   of  Matéria  Medica-Banco de dados TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Plugin de análise topológica--plugin Centiscape 2.2; Analisador de Rede
Sistema UHPLCVanquish Flex-
Cromatógrafo líquido de ultra-alto desempenhoThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Extrator ultrassônicoKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Concentrador centrífugo a vácuoNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Software de visualização--Cytoscape 3.10.4
Plataforma de anotação funcional baseada na web.Broad  Instituto-A plataforma online Metascape (https://metascape.org)

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