Method Article

Decodificando o Epitranscriptoma: Insights In Silico sobre a Rede Reguladora M6A no Câncer de Mama

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta uma abordagem para realizar análises genéticas, moleculares e prognósticas in silico de reguladores de modificação m6A, integrando perfis de mutação, alterações no número de cópias, expressão gênica e resultados clínicos usando conjuntos de dados públicos do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), do projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e das plataformas de microarrays.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A N6-metiladenosina (m6A) é a modificação interna de RNA mais abundante em transcritos eucarióticos e desempenha um papel crítico no metabolismo do RNA, expressão gênica e homeostase celular. A desregulação dos reguladores m6A, incluindo "escritores", "borrachas" e "leitores", tem sido cada vez mais implicada na biologia do câncer; No entanto, seus papéis abrangentes no câncer de mama ainda precisam ser compreendidos. O objetivo principal deste artigo sobre métodos é fornecer aos iniciantes em bioinformática uma estrutura passo a passo para utilizar conjuntos de dados públicos de câncer para realizar análises mutacionais, avaliar alterações na expressão gênica e examinar suas associações com a sobrevivência dos pacientes. Como estudo de caso, reguladores m6A no câncer de mama foram analisados usando conjuntos de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), do projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e de plataformas de microarrays. Perfis transcriptômicos foram sistematicamente analisados para demonstrar fluxos de trabalho para avaliar a relevância prognóstica dos componentes regulatórios do m6A no câncer de mama. Usando essa estrutura analítica, padrões distintos de alterações genéticas e expressão diferencial entre reguladores-chave do m6A foram identificados. Vários reguladores, incluindo METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 e RBMX, estiveram associados a uma melhor sobrevivência dos pacientes, enquanto o YWHAG esteve associado a uma sobrevivência geral ruim. Este estudo oferece uma visão geral abrangente da genômica de sistemas dos genes reguladores m6A no câncer de mama, ao mesmo tempo em que demonstra um fluxo de trabalho prático e reprodutível de bioinformática baseada na web. Esses achados avançam a compreensão da regulação epitranscriptômica no câncer de mama e oferecem uma base para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas baseadas em m6A.

Introduction

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Modificações epitranscriptômicas representam uma camada importante de regulação gênica pós-transcricional e contribuem para diversos processos celulares e estados de doença. Entre mais de 170 modificações de RNA identificadas até o momento, a N6-metiladenosina (m6A) é a mais prevalente e bem caracterizada nos mRNAseucarióticos 1. Instalado por complexos "escritores" incluindo METTL3/METTL14, removido por "borrachas" incluindo FTO e ALKBH5, e interpretado por proteínas "leitoras" incluindo membros das famílias YTH e IGF2BP, o m6A orquestra a emenda, estabilidade, transporte e tradução do RNA, influenciando assim processos biológicos chave como desenvolvimento, diferenciação e resposta aoestresse 2,3.

Alterações nos componentes regulatórios do m6A foram relatadas em um amplo espectro demalignidades 4. Em muitos cânceres, a atividade aberrante de m6A impulsiona fenótipos malignos; por exemplo, a expressão elevada de METTL3 promove a iniciação e progressão do câncer de próstata ao modular a via do ouriço e a metilação do RNAMYC 5,6. Inicialmente identificada como implicada no exercício de efeitos oncogênicos na leucemia mieloide aguda, a FTO demonstrou impulsionar a progressão tumoral em cânceres de fígado, pulmão e colorretal 7,8,9,10. No entanto, foram identificados papéis dependentes do contexto de FTO e ALKBH5 que ilustram a natureza dupla da regulação mediada por m6A, que pode promover tanto a sinalização oncogênica quanto a supressoratumoral 11,12,13,14. Leitores M6A, incluindo YTHDF1/2/3, ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNPs) e proteínas ligadoras ao fator de crescimento semelhante à insulina-2 (IGF2BP1-3), também foram encontrados associados àcarcinogênese 15,16,17.

No câncer de mama, evidências crescentes sugerem que os reguladores do m6A frequentemente são desregulados e podem estar associados a subtipos tumorais, características imunológicas e desfechosclínicos 18,19. Diversos estudos mecanicistas posicionam o METTL3 como um fator pró-oncogênico frequentemente aumentado no câncer de mama. A instalação de m6A mediada por METTL3 pode estabilizar ou potencializar a tradução de transcritos que promovem proliferação, transição epitelial-mesenquimatar (EMT), metástase equimiorresistência 20. O METTL3 também demonstrou promover a progressão do câncer de mama ao direcionar oBcl-22 21. O ALKBH5 tem sido implicado na regulação de programas de stemness do câncer por meio do NANOG e outras moléculas relacionadas à stemness, mas seu impacto pode variar conforme o contextotumoral 22.

À medida que a lista de reguladores do m6A continua se expandindo nos últimos anos, é necessária uma atualização sobre como os reguladores recém-identificados podem estar desregulados no câncer de mama. A Tabela 1 fornece uma lista de reguladores m6A que incluem escritores, leitores e borrachadores da modificação m6A. Além disso, novos reguladores do m6A, incluindo LRPPRC e YWHAG, foram identificados com implicações na progressão do câncer23, 24 e 25. Portanto, foi realizada uma caracterização genética e molecular abrangente de todos os reguladores m6A conhecidos no câncer de mama, utilizando ferramentas que podem ser empregadas por pesquisadores com conhecimento limitado em bioinformática.

O objetivo deste artigo de Métodos é apresentar um protocolo de bioinformática baseado em plataforma passo a passo para analisar reguladores m6A no câncer de mama, utilizando recursos públicos de genômica do câncer. Utilizando conjuntos de dados do The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), do projeto Genotype Tissue Expression (GTEx) 26 e plataformas analíticas baseadas na web como cBioPortal e UCSC Xena, este protocolo demonstra fluxos de trabalho reprodutíveis para avaliar perfis mutacionais, alterações na expressão gênica e associação com a sobrevivência do paciente. Essa abordagem visualizada e acessível tem como objetivo facilitar a adoção da análise de dados epitranscriptômicos por pesquisadores iniciantes em bioinformática do câncer.

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Protocol

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NOTA: A lista de genes que codificam reguladores de metilação m6A, categorizados como escritores, leitores e borrachas, é apresentada na Tabela 1. Todos os genes listados foram incluídos nas análises subsequentes de mutações, padrões de expressão e sobrevivência geral. Todos os softwares e ferramentas utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Identificação de alterações genéticas em reguladores m6A

  1. Acesse o cBioPortal para genômica do câncer. Navegue até o site do cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Na página inicial, selecione a aba "Consulta" para iniciar uma nova análise.
  2. Selecione o estudo e a coorte de câncer apropriados.
  3. Na barra de busca "Selecionar Estudos para Visualização e Análise", digite "Carcinoma Invasivo da Mama" e selecione "Carcinoma Invasivo da Mama (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Na parte inferior, selecione "Consulta por Gene".
    CRÍTICO: Certifique-se de que a coorte selecionada (996 amostras) inclua dados tanto de mutação quanto de alteração de número de cópias (CNA).
  5. Defina a consulta genética. Na seção "Enter Genes", insira os símbolos do gene HUGO para a lista completa de reguladores m6A em investigação.
    NOTA: Os genes podem ser inseridos como uma lista separada por espaços. Em "Selecionar Perfis Genômicos", certifique-se de que os seguintes dois tipos de dados estejam verificados: Mutações e Alterações de Número de Cópia.
  6. Em "Selecionar Paciente/Conjunto de Casos", escolha o conjunto de amostras padrão que corresponde à coorte com todos os casos de perfil.
  7. Clique no botão azul "Enviar Consulta".
  8. Recupere e interprete os dados de alteração genética. Ao enviar, o resultado será carregado na aba "resumo". A visualização central "OncoPrint" fornece uma visão imediata das alterações genéticas em todos os genes consultados na coorte, que pode ser baixada.
  9. Ao lado do OncoPrint, localize o gráfico "Resumo do Tipo de Câncer". Isso fornece uma divisão quantitativa das alterações entre subtipos de câncer de mama.
  10. Realize uma análise pan-câncer. Retorne à página inicial do cBioPortal e selecione "TCGA PanCancer Atlas Studies" na aba "Consulta".
  11. Na caixa de entrada do gene, insira a mesma lista de genes reguladores m6A.
  12. Clique em "Enviar Consulta" e, na página de resultados, navegue até a aba "Resumo dos Tipos de Câncer". Isso oferece uma visão pan-câncer.

2. Análise transcriptômica comparativa de reguladores m6A usando UCSC Xena.

  1. Acesse a plataforma Xena da UCSC. Acesse o site da UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Na página inicial, clique no botão "Iniciar Xena" para acessar o navegador principal de análise.
  3. No navegador Xena, clique em "DATA SETS".
  4. Entre os conjuntos de dados, selecione "TCGA TARGET GTEx". Este contém dados de RNA-Seq processados uniformemente dos tecidos normais dos projetos TCGA e GTEx.
  5. Na próxima página, clique em "VISUALIZAR".
  6. Defina a variável fenótipo (grupo amostral). Na seção "Selecione sua Primeira Variável", selecione "Categoria Principal" no tipo de dado fenotípico.
  7. Clique em "PARA SEGUNDA VARIÁVEL". Depois, no tipo de dado Genômico, marque "Expressão Gênica" no conjunto de dados. Adicione a lista de genes na caixa "Adicionar Gene ou Posição". Clique em "Pronto".
  8. Visualize padrões de expressão com um mapa de calor.
  9. Para separar as amostras de mama (TCGA+GTEx) do TCGA TARGET GTEx, digite "Mama" e use a opção de filtro para manter as amostras.
  10. O mapa de calor agora está visível e pode ser baixado em PDF.
  11. Gerar gráficos de caixa comparativos para genes individuais. Para quantificar e visualizar diferenças de expressão para um gene específico, use o "Ver como gráfico". Usando essa opção, os dados podem ser visualizados como um diagrama de caixa, um gráfico de pontos e um gráfico de violino, comparando a distribuição de expressões entre os dois grupos de amostras.
  12. Use a opção "Download as PDF" para baixar as paradas.
  13. A significância estatística (valor-p) pode ser obtida clicando em "ESTATÍSTICAS".

3. Avaliação da importância prognóstica dos reguladores m6A usando o Plotter Kaplan-Meier.

  1. Acesse a ferramenta Kaplan-Meier Plotter. Navegue até o site do Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Na página inicial, selecione a aba "câncer de mama" para iniciar uma análise específica para conjuntos de dados de câncer de mama.
  3. Configure a consulta de genes para um único gene.
  4. Na seção de entrada principal, localize a caixa "Símbolo do gene".
  5. Insira o símbolo oficial do gene regulador m6A a ser analisado (por exemplo, METTL3).
    CRÍTICO: Logo abaixo da caixa de entrada do gene, localize e ative a caixa de seleção "Only JetSet best probe set". Isso garante que a sonda de microarray mais confiável e específica seja automaticamente selecionada para o seu gene, otimizando a qualidade e a reprodutibilidade dos dados.
  6. Defina os parâmetros da análise de sobrevivência. Na seção "Sobrevivência", selecione "Sobrevivência geral (OS)" como o ponto final principal desta análise. A ferramenta utilizará automaticamente dados de 1880 pacientes com câncer de mama quando essa configuração for selecionada.
  7. Certifique-se de que a opção "Dividir pacientes por" esteja definida como "mediana". Isso estratificará os pacientes em dois grupos iguais; alta e baixa expressão, baseadas no valor mediano de expressão do gene consultado em todas as amostras.
  8. "Limiar de acompanhamento" pode ser usado para selecionar o período de acompanhamento. Para este estudo, foram selecionados 180 meses.
  9. Gerar e interpretar o Gráfico de Kaplan-Meier.
  10. Clique no botão "Desenhar Enredo de Kaplan-Meier".
  11. Uma nova janela será carregada, exibindo a curva de sobrevivência.
  12. Interprete os principais elementos da trama; O eixo X indica o tempo em meses, o eixo Y mostra a probabilidade de sobrevivência geral, as duas linhas coloridas representam as curvas de sobrevivência para os grupos de pacientes de alta expressão (vermelho) e baixa expressão (preto). O valor P de ordem logarítmica é exibido, indicando a significância estatística da diferença entre as duas curvas de sobrevivência.

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Results

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Paisagem mutacional dos reguladores de metilação de m6a no câncer de mama

Em um estudo anterior sobre análise genômica de conjuntos de dados TCGA, mutações recorrentes em vários genes que codificam reguladores da metilação do DNA foramrelatadas 31. No presente estudo, o cBioPortal foi utilizado para analisar o conjunto de dados "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" para examinar perfis mutacionais dos genes que codificam os escritores, lei...

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Discussion

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O artigo deste Método oferece um fluxo de trabalho abrangente, acessível e integrado para o perfil multiômico sistemático e a tradução clínica de qualquer assinatura gênica em pesquisa do câncer, demonstrado aqui pela análise dos reguladores de metilação de RNA m6A em câncer de mama. Ao combinar essas principais plataformas públicas de bioinformática, essa abordagem permite que pesquisadores progridam eficientemente da descoberta genômica para hipóteses clinicamente relevantes, sem exigi...

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Disclosures

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Partes deste manuscrito foram revisadas com a ajuda de ferramentas linguísticas baseadas em IA para melhorar a clareza e a legibilidade. Todo o conteúdo substantivo, interpretação, análises e conclusões são da responsabilidade dos autores. Declaramos que não há conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma bolsa da Alfaisal University (IRG 25450) para a RM é felizmente reconhecida.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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