Explorando o Mecanismo do Grâul de Guben Pingchuan no Tratamento da Asma Brônquica

Resumo

Este protocolo investiga o mecanismo de ação dos grânulos de Guben Pingchuan em asma brônquica, utilizando farmacologia em rede, acoplamento molecular e validação in vivo.

Resumo

Este estudo investiga o mecanismo de ação dos grânulos de Guben Pingchuan no tratamento da asma brônquica utilizando farmacologia em rede, acoplamento molecular e validação experimental. Os ingredientes ativos e os alvos correspondentes foram identificados usando bancos de dados TCMSP, HERB e SymMap. Alvos relacionados à asma brônquica foram coletados de GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank e PharmGKB. Alvos sobrepostos foram identificados, e redes de interação componente–alvo e proteína–proteína (PPI) foram construídas. Foram realizadas análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) com correção na taxa de falsas descobertas (FDR). Foi realizada uma acoplagem molecular para avaliar a afinidade de ligação, seguida de validação in vivo . Um total de 121 componentes ativos e 234 alvos relacionados a medicamentos foram identificados, resultando em 155 alvos sobrepostos. Os alvos principais incluíam TP53, AKT1, TNF e IL6. A análise KEGG demonstrou enriquecimento significativo da via de sinalização PI3K–Akt, que foi selecionada para validação experimental. O acoplamento molecular revelou uma forte afinidade de ligação entre os componentes centrais e o AKT1. Em ratos asmáticos induzidos por ovalbumina, o grânulo de Guben Pingchuan reduziu os níveis séricos de IL-4 e IL-10 , aumentou a expressão de FoxP3 no tecido pulmonar e aumentou os níveis de mRNA de PI3K e AKT . Esses achados indicam que o grânulo de Guben Pingchuan alivia a asma brônquica modulando a via de sinalização PI3K–Akt ., regulando citocinas inflamatórias e aprimorando a função reguladora das células T.

Introdução

A asma brônquica é uma doença respiratória crônica heterogênea caracterizada por inflamação das vias aéreas, hiper-responsividade, hipersecreção de muco e remodelação das vias^aéreas. Sua patogênese envolve interações complexas entre ativação das células imunes, mediadores inflamatórios e múltiplas vias de sinalização. Clinicamente, a asma apresenta chiado recorrente, dispneia, aperto no peito e tosse. A inflamação das vias aéreas é um mecanismo central subjacente ao início e progressão da doença, caracterizada pelo aumento da secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, IL-4, IL-17 e TNF-α., infiltração de células inflamatórias incluindo eosinófilos e neutrófilos, e alterações estruturais como proliferação do músculo liso das vias aéreas, espessamento da membrana basal e hiperplasia das glândulas^{mucosas 2˒3}. Esses processos patológicos levam, em última análise, à obstrução das vias aéreas e à diminuição do fluxo de ar.

A fisiopatologia da asma é regulada por múltiplas vias de sinalização interativas, em vez de um único mecanismo. A via de sinalização PI3K–Akt desempenha um papel fundamental na modulação do equilíbrio imunológico, particularmente no eixo Treg/Th17, regulando a expressão de FoxP3. Essa via também interage com as vias de sinalização IL-17 e TNF para amplificar respostas inflamatórias e remodelação das vias aéreas, contribuindo para a heterogeneidade da doença e resistência ao^{tratamento 3,4}. Dados epidemiológicos indicam um aumento global contínuo na prevalência da asma, com mais de 358 milhões de indivíduos afetados no mundo todo e aproximadamente 45,7 milhões de pacientes adultos na^China. As estratégias de tratamento atuais dependem principalmente de agonistas de β₂ inalados e glicocorticoides; No entanto, essas terapias visam mecanismos patológicos limitados e podem levar a efeitos adversos e resistência aos glicocorticoides em certos pacientes. A desregulação de vias como PI3K–Akt. tem sido associada à redução da resposta terapêutica, destacando a necessidade de abordagens terapêuticas^{multi-alvo 7,4}.

A medicina tradicional chinesa (MTC) classifica a asma como "Síndrome de Xiao", associada a deficiências na função pulmonar, baço e rin, combinadas com fatores patogênicos externos. As formulações da MTC têm sido amplamente utilizadas no manejo da asma devido às suas características multicomponentes e^{multi-alvo 8,9}. Ao contrário dos agentes farmacologicos de alvo único, os compostos da MTC exercem efeitos terapêuticos ao coordenar a regulação de múltiplas vias biológicas, alinhando-se com a complexa fisiopatologia da^{asma 10}. A farmacologia de redes oferece uma abordagem em nível de sistema para analisar interações entre componentes de medicamentos, alvos e vias de doenças, permitindo a identificação de compostos bioativos chave e mecanismos^{moleculares 11}. O acoplamento molecular complementa ainda mais essa abordagem ao avaliar a afinidade de ligação entre pequenas moléculas e proteínas-alvo.

O grânulo Guben Pingchuan é uma formulação medicinal tradicional chinesa composta por oito componentes herbais, incluindo Ephedra sinica (Erva Ephedra), fruto de Psoralea corylifolia , semente de Prunus armeniaca (semente de damasco), raiz de Pseudostellaria heterophylla , fruto de Perilla frutescens , folha de Eriobotrya japonica (folha de nêspera), bulbo de Lilium brownii e Epimedium brevicornum. Essa formulação é tradicionalmente usada para fortalecer a energia vital, eliminar o catarro e aliviar o chiado. Estudos clínicos anteriores demonstraram sua eficácia terapêutica na asma brônquica, com taxas de resposta mais altas em comparação com tratamentos^{convencionais 12}.

Para elucidar o mecanismo subjacente de ação, é aplicada uma abordagem integrada que combina farmacologia em rede, acoplamento molecular e validação experimental in vivo . A farmacologia em rede é usada para identificar componentes ativos e potenciais alvos associados à asma brônquica. O acoplamento molecular é empregado para avaliar interações entre compostos-chave e proteínas-alvo. A validação experimental em um modelo animal é posteriormente realizada para avaliar os efeitos regulatórios sobre vias críticas de sinalização, particularmente a via PI3K–Akt . Essa abordagem visa fornecer insights mecanicistas sobre os efeitos terapêuticos multi-alvo do grânulo de Guben Pingchuan e apoiar sua aplicação no tratamento da asma brônquica.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning (Aprovação nº: 21000042023058) e realizados de acordo com as diretrizes institucionais. As ferramentas de pesquisa usadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Bancos de dados e software

1. Acesse os seguintes bancos de dados e softwares: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt e Cytoscape (versão 3.9.1).

2. Aquisição de alvos componentes

1. Recupere constituintes químicos da Erva Ephedra, semente de damasco, raiz de Pseudostellaria, fruto Perilla, folha de nêspera, espécies de Lilium e Epimedium do banco de dados^{TCMSP 13}. Recupere compostos de Psoralea dos bancos de dados HERB e SymMap.
2. Selecionar compostos ativos usando biodisponibilidade oral (OB ≥ 30%) e semelhança com fármacos (DL ≥ 0,18)^14,15.
3. Prediga genes alvo usando TCMSP. Padronize todos os alvos usando o banco de dados UniProt selecionando Homo sapiens. Remova alvos duplicados e inválidos, incluindo entradas não humanas, proteínas não anotadas e identificadores obsoletos.

3. Aquisição de alvos para asma brônquica

1. Pesquise em GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank e PharmGKB usando a palavra-chave "asma brônquica". Defina a pontuação de relevância dos GeneCards para >4. Misture todos os alvos recuperados e remova duplicatas.

4. Identificação de alvos de interseção

1. Importe alvos de medicamentos e alvos de doenças para uma ferramenta online de análise de Venn. Identificar alvos sobrepostos e registrar o número total para análise subsequente.

5. Construção da rede componente–alvo

1. Importar alvos de interseção para o Cytoscape 3.9.1. Construa a rede componente–alvo. Ajuste o tamanho e a cor do nó com base nos valores de grau.

6. Construção da rede de interação proteína-proteína (PPI)

1. Envie os alvos de interseção para o banco de dados STRING. Selecione Homo sapiens e defina a pontuação de confiança para ≥0,900. Exporte a rede e importe para o Cytoscape.
2. Calcule parâmetros topológicos (centralidade de grau, centralidade entre os dois e centralidade de proximidade). Identifique alvos centrais usando limiares medianos e grau >20.

7. Análise de enriquecimento GO e KEGG

1. Envie metas sobrepostas para o banco de dados DAVID ou analise usando o cluster Profiler do pacote R.
2. Realizar análises de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) para categorias de processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares.
3. Realize a análise de enriquecimento de vias KEGG. Aplique a correção da taxa de falsas descobertas (FDR) e defina o limiar de significância para FDR < 0,05.
4. Visualize os termos mais enriquecidos usando gráficos de barras ou gráficos de bolhas.

8. Acoplamento molecular

1. Baixe estruturas 2D de compostos centrais no PubChem. Gerar estruturas 3D usando o ChemOffice e salvar como arquivos mol2.
2. Baixe estruturas proteicas do banco de dados RCSB PDB. Remova moléculas de água e ligantes usando PyMOL.
3. Realize acoplamento molecular usando AutoDock Vina. Defina os parâmetros da grade box e execute simulações de acoplamento.
4. Registre energias de ligação (kcal/mol) e resíduos de interação com chaves. Visualize os resultados do acoplamento usando plataformas de modelagem molecular, visualização e simulação.

9. Validação experimental

1. Animais
   1. Obtenha 48 ratos machos de Sprague–Dawley (9 semanas de idade, 220–240 g). Animais domésticos a 20–25 °C com umidade de 55%–60% sob condições padrão.
2. Medicamentos e reagentes
   1. Prepare grânulos Guben Pingchuan compostos de Erva Ephedra, Psoralea, semente de damasco, raiz de Pseudostellaria, fruto de Perilla, folha de nêspera, Lilium e Epimedium.
   2. Prepare dexametasona, ovalbumina (OVA), hidróxido de alumínio, kits ELISA, kits de extração de RNA e anticorpos conforme listado na Tabela de Materiais.
3. Instrumentos
   1. Prepare equipamentos laboratoriais padrão, incluindo um leitor de microplacas, sistema de eletroforese, microtomo de parafina e sistema de imagem.
4. Agrupamento e tratamento de animais
   1. Distribua aleatoriamente os ratos em seis grupos (n = 8): grupo controle em branco, grupo modelo, grupo dexametasona-dexametasona (0,3 mg/kg), grupo de medicina chinesa em baixa dose, grupo de medicina chinesa de dose média e grupo de medicina chinesa em doses altas.
   2. Nos dias 1, 7 e 14, administre 1 mL de injeção intraperitoneal de 10% OVA + 10% Al(OH)₃ em ratos do grupo modelo, grupo de medicina chinesa de baixa dose, grupo de medicina chinesa de dose média, grupo de medicina chinesa de alta dose e grupo de dexametasona para sensibilização.
   3. Administrar 1 mL de injeção intraperitoneal de 0,9% de soro fisiológico em ratos do grupo controle em branco nos dias 1, 7 e 14.
   4. Dos dias 15 ao 21, realize estimulação inalatória nebulizada uma vez ao dia por 20 minutos. Administrar inalação nebulizada com OVA a 5% em ratos do grupo modelo, grupo de baixa dose de medicina chinesa, grupo de médio dose, grupo de alta dose e grupo de dexametasona.
   5. Administrar 0,9% de inalação fisiológica nebulizada por solução salina aos ratos do grupo controle em branco dos dias 15 a 21.
   6. Administrar tratamentos por gavage oral uma vez ao dia, dos dias 22 a 36, de acordo com o grupo de tratamento designado.
   7. Monitore o peso corporal e a condição geral diariamente durante o experimento. A linha do tempo experimental é resumida na Tabela 1.
5. Histopatologia
   1. Colete tecido pulmonar. Corrigir, incorporar e amostrar seções. Realize coloração por hematoxilina–eosina.
   2. Realize a coloração de Masson para avaliar a deposição de colágeno.
6. Análise RT-PCR
   1. Extraia RNA total do tecido pulmonar.
   2. Homogeneize tecido pulmonar congelado sob condições de temperatura ultrabaixa. Após pesar a amostra, transfira-a rapidamente para um almofariz pré-resfriado contendo nitrogênio líquido e moa-a até virar pó.
   3. Transfira a amostra em pó para um tubo centrífuga. Adicione 1 mL de TransZol UP e 0,2 mL de reagente de extração de RNA a cada 50–100 mg de tecido. Agite o tubo em temperatura ambiente por 5 minutos.
   4. Centrifuge a amostra a 1000 × g . e 2–8 °C por 15 minutos. Transfira a fase aquosa incolor para um novo tubo de centrífuga.
   5. Adicione 1 mL de TransZol até 0,5 mL de isopropanol. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos.
   6. Centrifuge a amostra a 1000 × g por 10 minutos. Adicione 1 mL de etanol a 75% e centrifuge novamente por 5 minutos.
   7. Descarte o sobrenadante e seque o precipitado ao ar em temperatura ambiente por 5 minutos. Dissolva o precipitado em 50–100 μL de solução de RNA e depois incube por 10 minutos.
   8. Armazene a amostra a −70 °C para preservação a longo prazo.
   9. Sintetize cDNA e realize PCR quantitativa para medir a expressão de PI3K e AKT.
7. ELISA
   1. Amostras de soro de descongelamento a 4 °C. Meça os níveis de IL-4 e IL-10. usando kits ELISA conforme as instruções do fabricante.
8. Imunohistoquímica
   1. Tecido pulmonar fixo com 4% de paraformaldeído, embutido na parafina, fatiado, decerado e hidratado.
   2. Realize a coleta de antígenos, bloqueio e incubação de anticorpos. A coloração, segundo o kit de imunohistoquímica FoxP3, solução de coloração DAB e expressão positiva aparece como coloração amarelo-acastanhada ou marrom escuro.
   3. Observe e fotografe sob um microscópio, e utilize o software Image J para análise estatística quantitativa da expressão FoxP3.
9. Análise estatística
   1. Normalidade dos dados do teste usando o teste de Shapiro–Wilk e homogeneidade de variância usando o teste de Levene.
   2. Analise dados usando ANOVA unidirecional ou testes não paramétricos, conforme apropriado. Expresse os dados como média ± desvio padrão.
   3. Defina p < 0,05 como estatisticamente significativo. ★★p < 0,01 e ★p < 0,05 vs. grupo de controle; ◆◆p < 0,01 e ◆p < 0,05 vs grupo de modelos; ##p < 0,01 e #p < 0,05 vs grupo dexametasona.

Tabela 1: Linha do tempo experimental. Cronograma de sensibilização, desafios e procedimentos de tratamento. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Resultados

Triagem de ingredientes ativos
Um total de 121 componentes ativos foram identificados no banco de dados TCMSP após filtragem por atividade-alvo. Incluíam 23 componentes da Erva Ephedra , 7 de Psoralea, 19 de semente de damasco, 8 da raiz de Pseudostellaria , 16 do fruto Perilla, 18 da folha de nêspera, 7 de Lilium e 23 de Epimedium. (Tabela 2). Dezesseis componentes comuns foram identificados, incluindo lut...

Discussão

A asma brônquica é uma doença comum no departamento^{respiratório 16}. É um distúrbio obstrutivo das vias aéreas causado por alérgenos e hiper-resposta das vias^{aéreas 17}. Tem alta incidência clínica, é propenso a recidivas e é difícil de curar, afetando significativamente a saúde e a qualidade de vida dos pacientes. A Iniciativa Global para a Asma (GINA) de 2025 relata que a terapia com glicocorticoides inaláreos é eficaz para

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Detecção da expressão relativa de mRNA de genes alvo
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Adiuvante imunológico para melhorar a resposta imune ao antígeno
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 peças por caixa	Quantificação total de proteínas para padronizar o carregamento da amostra
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	Imagem de banda WB, coleta e análise de imagens de gel e blot
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Referência de peso molecular de proteínas para experimentos de eletroforese
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 peças por caixa	Extração e purificação de RNA total de tecidos e células
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Detecção quantitativa de citocinas e conteúdos proteicos em amostras
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/peça	Ligação direcionada à proteína FOXP3 para imunoensaio
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 conjuntos	Preparação rápida de gel de separação e gel de empilhamento para eletroforese
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 comprimidos	Coloração específica para fibras de colágeno tecidual e observação de fibrose
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Alérgeno clássico para estabelecimento de modelos animais alérgicos
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Diluição do anticorpo primário, manutenção da atividade e redução da ligação não específica
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Detecção quantitativa do fator anti-inflamatório IL-10 de rato
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Detecção quantitativa do fator inflamatório IL-4 de rato Th2
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Transcrição reversa de RNA em cDNA para análise gênica subsequente
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 frasco	Coloração específica e detecção de gotículas lipídicas teciduais
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Ligação ao anticorpo primário de coelho para reação de cor WB
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / frasco	Tampão para lavagem de membrana e diluição de anticorpos no Western blot
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Usado para eletroforese de proteínas e transferência de membranas de Western blot
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	Criopreservação de reagentes, amostras de proteínas e tecidos em baixa temperatura
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	Separação eletroforética vertical de amostras de proteínas e ácidos nucleicos