Um Sistema de Contra-Seleção Baseado em Toxinas para Deleção Gênica Sem Marcadores e Mutagênese de Transposons Tn5 de Alta Densidade em Pectobacterium brasiliense

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para gerar deleções gênicas não marcadas e construir bibliotecas mutantes de inserção de Tn5 em todo o genoma em Pectobacterium brasiliense, um fitopatógeno responsável pelo blackleg da batata e pela podridão mole. Essa abordagem permite uma análise genética reversa eficiente e facilita a caracterização funcional dos genes associados à virulência nesse organismo.

Resumo

Pectobacterium brasiliense é uma bactéria altamente patogênica responsável pela podridão mole do tubérculo da batata, perna-preta e podridão aérea do caule. A elucidação de seus mecanismos patogênicos é essencial para o controle da doença; no entanto, as ferramentas genéticas para esse organismo continuam limitadas. Foi desenvolvido um sistema de contra-seleção baseado em toxinas para permitir a deleção gênica sem marcadores e a mutagênese do transposon Tn5 de alta densidade. A toxina vmi480 derivada do plasmídeo pLP12 foi usada como marcador de contra-seleção para construir o vetor de suicídio pKV2. Usando esse sistema, o gene recA da cepa SM P. brasiliense foi eliminado com sucesso. O mutante recA resultante serviu como cepa parental para a construção de uma biblioteca de inserção Tn5 composta por mais de 12.000 mutantes por conjugação com a cepa auxiliar RHO3 portadora de pKV2-LLtnp. Neste plasmídeo derivado, a toxina vmi480 foi substituída por uma transposase Tn5 hiperativa sob o controle de um promotor de lac voltado para fora para reduzir os efeitos polares. Ensaios de inoculação de tubérculos de alta produtividade permitiram a identificação de mutantes deficientes em patogenicidade, incluindo inserções no sistema de secreção tipo II, um determinante chave da virulência que media a secreção de enzimas degradadoras da parede celular das plantas. Esta plataforma apoia a genômica funcional e facilita a investigação dos mecanismos de virulência nesse patógeno economicamente importante.

Introdução

P. brasiliense é uma das espécies mais agressivas dentro do gênero Pectobacterium e é o agente causal da podridão mole da batata, da perna-preta e da podridão aérea^{do caule 1}. Essas doenças levam a uma perda estimada de 30% na produtividade da batata, uma cultura classificada como a terceira fonte de alimento mais importante do mundo e um componente chave do sistema de produção agrícola^{da China 2}. Apesar de seu impacto econômico, os mecanismos moleculares que regem a patogenicidade de P. brasiliense permanecem insuficientemente compreendidos, em grande parte devido à falta de ferramentas de manipulação genética eficientes e reprodutíveis para essa espécie ^3,4,5.

Estudos genômicos funcionais em muitas bactérias fitopatogênicas dependem de sistemas robustos de troca alélica e mutagênese de transposons; no entanto, ferramentas genéticas comparáveis para P. brasiliense continuam limitadas ou ineficientes. Em particular, marcadores eficazes de contra-seleção compatíveis com essa espécie são escassos. Enquanto o gene sacB é amplamente utilizado como marcador de contra-seleção para deleção gênica em várias bactérias, P. brasiliense pode apresentar alta tolerância de até 50% de sacarose durante o processo^{de seleção.} Essa tolerância provavelmente reflete a falta de sensibilidade a toxinas, possivelmente devido à conversão enzimática da sacarose em polímeros de açúcar. Além disso, altas concentrações de sacarose podem induzir choque osmótico^{deletério 6}. Além disso, métodos eficientes de mutagênese em grande escala, como a construção de bibliotecas de inserção de transposons Tn5, ainda não foram bem estabelecidos para esse organismo.

Para enfrentar essas limitações técnicas, foi desenvolvido um sistema de contra-seleção baseado em toxinas, e um fluxo robusto de triagem de mutagênese para Tn5 foi estabelecido para P. brasiliense. Comparado aos métodos tradicionais à base de sacarose, essa abordagem baseada em toxinas oferece vantagens distintas, incluindo maior rigor seletivo, maior especificidade na identificação de eventos de duplo cruzamento e eliminação do estresse osmótico de confusão. Sistemas semelhantes baseados em toxina-antitoxina vmi480 foram implementados com sucesso para superar barreiras de seleção na espécie^{Vibrio 7}. A metodologia estabelecida é altamente aplicável à caracterização funcional de alto rendimento de genes desconhecidos e fornece uma plataforma versátil que pode ser adaptada a outras espécies relacionadas de podridão mole das Pectobacteriaceae.

Protocolo

1. Geração de um mutante de deleção recA sem marcador em P. brasiliense

1. Extraia DNA genômico do plasmídeo SM e pKV2 de P. brasiliense (pLP12 derivado com modificação do marcador de seleção do antibiótico e do sítio de clonagem múltipla) da cepa doadora de E. coli usando procedimentos padrão de preparação de DNA.
2. Verifique a qualidade e concentração do DNA genômico extraído e do DNA plasmídico por meio da eletroforese em gel de agarosa e espectrofotometria NanoDrop.
3. Linearize o plasmídeo pKV2 por dupla digestão com EcoRI e NheI a 37 °C por 5 horas. Verifique a digestão completa por eletroforese em gel de agarose e purifique o plasmídeo linearizado.
4. Identifique aproximadamente 800 regiões de bp a montante e a jusante do gene recA usando software de análise genômica e projete os pares correspondentes de primers LBF/LBR e RBF/RBR (Veja a Tabela de materiais para todos os primers usados neste estudo).
5. Amplificar ambos os braços homólogos sob condições padrão de ciclo de PCR e purificar os produtos da PCR. Uma PCR de 50 μL normalmente gera 2,5 μg de produto.
   NOTA: Os valores de Tm e o conteúdo de GC dos primers podem ser ajustados modificando as fronteiras das regiões homólogas.
6. Monte o plasmídeo suicida recombinante pKV2-recA usando um kit de montagem de DNA, ligando os braços homólogos purificados com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado.
7. Transforme a mistura de montagem em células λpir quimicamente competentes de E. coli S17-1 por choque térmico, recupere as células em meio LB e coloque em ágar LB contendo kanamicina (LB + kan).
   NOTA: As concentrações finais utilizadas são 50 mg/mL de canamicina, 0,2% (p/v) de glicose, 0,3% (p/v) de arabinosa e 0,3 mM de ácido 2,6-diaminopimélico (DAP).
8. Valide clones positivos por digestão de restrição ou PCR em colônia. (Veja a Tabela de materiais para todas as receitas de médios utilizadas neste estudo).
9. Extraia o plasmídeo confirmado de pKV2-recA e transforme-o em E. coli WM3064 usando transformação por choque térmico (taxa de transformação esperada > 10⁶ cfu/μg).
10. Selecione transformantes em ágar LB contendo canamicina e ácido diaminopimélico (DAP).
11. Realize a conjugação biparental misturando culturas durante a noite da cepa doadora (WM3064 pKV2-recA) e da receptora P. brasiliense SM em proporção de 1:1 (v/v), normalmente resultando em 10⁴ a^{10 6} transconjugantes por mililitro de células doadoras e receptoras.
12. Lave a cultura mista uma vez com água estéril, coloque a mistura em ágar LB suplementado com kanamicina e DAP, e incube a 28 °C por 48–72 horas.
    NOTA: Se não forem observados transconjugantes, a proporção doador-receptor pode ser aumentada para 2:1 (v/v) para melhorar a eficiência da conjugação. Se for observado alto crescimento de fundo, o DAP residual pode ser removido lavando a cultura mista duas vezes com água estéril.
13. Recuperar a mistura de conjugação e colocar o placar em ágar LB contendo kanamicina e glicose (sem DAP) para contra-seleção.
14. Escolha 6–8 colônias e faça réplicas delas tanto em LB + kan quanto LB + kan + arabinose.
15. Selecione colônias que crescem em LB + kan, mas não crescem em LB + kan + arabinose; Esses são candidatos que fazem o primeiro crossover.
16. Inocular confirmou as primeiras cepas cruzadas em meio LB e incuba durante a noite. Placar as culturas sobre ágar LB contendo L-arabinose para induzir a segunda recombinação homóloga.
17. Escolha várias colônias e faça réplicas em LB + arabinose e LB + kan. Selecione colônias que cresçam em LB + arabinose, mas não em LB + kan; estes são mutantes supostos de deleção recA .
    NOTA: Se nenhuma colônia for observada após o segundo evento de cruzamento, a potencial essencialidade do gene alvo para o crescimento bacteriano deve ser avaliada. Alternativamente, as regiões homólogas a montante e a jusante podem ser estendidas para 1.200 pb para aumentar a eficiência da recombinação homóloga.
18. Confirme os mutantes recA por PCR de colônia usando par de primers checkF/checkR, projetado para amplificar através das regiões do promotor recA e do terminador para verificar a deleção no quadro do gene alvo. Sequencie o produto PCR para confirmar a exclusão precisa dentro do quadro da recA.
19. A deleção bem-sucedida é indicada por uma redução no tamanho do produto PCR, que deve corresponder ao comprimento do fragmento do tipo selvagem menos o comprimento específico do segmento do gene deletado.

2. Construção do pKV2-LLtnp para mutagênese de Tn5 em P. brasiliense

1. Amplifique a fita cassete transposase Tnp de pMCS2-LLtnp⁸ usando o par de primers Tnp-F/Tnp-R, e amplifique a espinha dorsal oriγR6K Tn5 a partir de pKV2 usando o par de primers ori-F/ori-R. Purifique todos os produtos de PCR usando um kit de purificação de DNA.
2. Monte a fita cassete Tnp purificada e a espinha dorsal oriγR6K Tn5 usando um kit de montagem de DNA. Transformar a mistura de montagem em células λpir quimicamente competentes de E. coli S17-1 por choque térmico, recuperar em meio LB e placar sobre ágar LB suplementado com kanamicina (LB + kan).
3. Valide clones positivos por PCR em colônia usando pares de primers ori-F/ori-R e Tnp-F/Tnp-R.
4. Prepare células competentes para E. coli RHO3 inoculando uma única colônia em meio LB e incubando durante a noite. Dilua a cultura 1:100 em meio fresco LB e cresça até um OD₆₀₀ de 0,6.
5. Resfrie a cultura no gelo e lave as células três vezes com 0,1 M CaCl₂ pré-resfriado. Resuspenda o pellet final em 500 μL de glicerol pré-resfriado a 20% e armazene a −80 °C.
6. Transformar 10 μL do plasmídeo recombinante validado (pKV2-LLtnp) em 100 μL de células competentes em RHO3 por choque térmico (taxa de transformação esperada > 10⁶ cfu/μg). Incube no gelo por 30 minutos, faça choque térmico a 42 °C por 45 segundos, depois esfrie no gelo por 2 minutos.
7. Adicione 500 μL de LB de meio e incube a 37 °C por 1 hora com agitação. Placar sobre ágar LB contendo kanamicina e DAP (LB + kan + DAP) e incubar a 37 °C durante a noite.
8. Valide transformantes RHO3 positivos por PCR de colônia usando Tnp-F/Tnp-R.

3. Construção da biblioteca de mutantes transposões Tn5 em P. brasiliense

1. Cultive P. brasiliense ΔrecA em meio LB a 28 °C e cultive RHO3/pKV2-LLtnp em meio LB suplementado com kanamicina e DAP (LB + kan + DAP) a 37 °C. Permita que ambas as cepas atinjam um OD₆₀₀ de 1.
2. Misture 100 μL de P. brasiliense ΔrecA com 100 μL de RHO3/pKV2-LLtnp, centrifuge a mistura, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet lavado em 10 μL de meio LB.
3. Coloque a mistura ressuspensa sobre uma placa de ágar LB suplementada com DAP e incube a 28 °C por 8 horas para permitir a conjugação.
4. Recupere a mistura de conjugação enxaguando a superfície da placa com 1 mL de meio LB estéril. Centrifuge brevemente, descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com médio LB para remover DAP.
5. Ressuspenda o pellet lavado em meio de 300 μL LB e faça 10 diluições seriadas em ágar LB suplementado com kanamicina e glicose (LB + kan + glicose; sem DAP) para selecionar transconjugantes.
6. Incube as placas a 28 °C por 48 horas. Escolha cinco colônias e valide cada uma por PCR de colônia usando pares de primers ori-F/ori-R e Tnp-F/Tnp-R para confirmar a introdução bem-sucedida do transposon Tn5. Sequencie todas as cinco colônias para verificar a inserção de Tn5 no genoma.
   NOTA: Antes da construção formal da biblioteca mutante, seis colônias individuais foram selecionadas aleatoriamente da placa de conjugação. Foram realizados ensaios de resgate plasmídico para determinar os locais de inserção, usando duas enzimas de restrição diferentes separadamente como dois grupos controle paralelos. Um total de 36 leituras sequenciadas foram obtidas. Um único evento de inserção de Tn5 foi validado apenas quando os seis locais de inserção de cada colônia individual eram idênticos.
7. Estime a capacidade da biblioteca mutante repetindo a etapa de conjugação e contando o número das colônias. Garantir que o tamanho total da biblioteca ultrapasse 12.000 colônias para alcançar cobertura genômica suficiente para triagem posterior.
   NOTA: Se for observada uma baixa frequência de mutagênese, o uso de uma variante hiperativa da transposase Tn5, como o mutante E54K/M56A/L372P, deve ser considerado para aumentar a eficiência da transposição.
8. Transfira colônias mutantes individuais obtidas na etapa 6 para placas de 96 poços contendo 200 μL LB + kan por poço. Incube as placas durante a noite a 28 °C com agitação a 200 rpm.
9. Adicione 133 μL de glicerol estéril de 50% a cada poço para alcançar uma concentração final de aproximadamente 20%. Selar e armazenar as placas de 96 poços a −80 °C para preservação a longo prazo.

4. Ensaios de patogenicidade de alta produtividade por inoculação com tubérculo de batata e vaso

1. Prepare tubérculos de batata (cv. Favorita) enxaguando com água estéril, imergindo brevemente em etanol 75% e secando ao ar em uma bancada limpa. Fatie os tubérculos em seções de ~8 mm de espessura e coloque as fatias em placas de Petri estéreis de 90 mm. Prepare pelo menos três fatias para réplicas biológicas.
2. Inocule 1 μL de cada cepa mutante em fatias de batata usando uma pipeta multicanal, seguindo a disposição das placas da biblioteca mutante de 96 poços. Inclua P. brasiliense ΔrecA como controle positivo e LB + kan como controle negativo.
3. Incube as fatias de batata inoculadas a 28 °C por 7–8 horas. Mutantes registrados apresentando maceração visivelmente reduzida ou áreas de lesão menores em comparação com o controle ΔrecA . Quantifique a área da lesão medindo seu comprimento e largura. Designe esses como candidatos principais à triagem.
   NOTA: Certifique-se de que os valores de OD₆₀₀ das culturas e controles mutantes sejam normalizados para 0,8 antes da inoculação.
4. Para triagem secundária, inocule 5 μL de cada cepa candidata em fatias de batata fresca (6 cepas por fatia, espaçamento igual). Prepare três réplicas biológicas para cada cepa. Incubar a 28 °C por 7–8 horas e registrar o tamanho das lesões para confirmar a atenuação.
5. Isole cepas que mostrem redução consistente da virulência ao riscá-las em placas LB + Kan. Incube as placas a 28 °C durante a noite e armazene mutantes validados de virulência reduzida a 4 °C para análise subsequente.
6. Para validação de plantas inteiras, inocule os caules da batata com 150 μL de suspensões bacterianas normalizadas para 1 x 10⁸ CFU/mL. Injete suspensões na região do caule basal usando uma seringa estéril. Observe o desenvolvimento da doença após 48 horas. Realize réplicas biológicas em três plantas individuais.
7. Pontuar a gravidade da doença usando a escala de classificação da doença blackleg ("uma escala ordinal de 6 pontos: 0, 1, 3, 5, 7, 9") e calcular o Índice de Doença como:
   1. Grau 0: Sem sintomas de doença em toda a planta.
   2. Grau 1: Lesões no caule cobrem no máximo 1/3 da circunferência do caule e/ou folhas individuais estão murchas.
   3. Grau 3: Lesões no caule cobrem no máximo metade da circunferência do caule e/ou menos da metade das folhas apresentam leve murchamento, e/ou algumas folhas inferiores apresentam lesões.
   4. Grau 5: Lesões no caule cobrem mais de metade da circunferência do caule e/ou mais da metade das folhas apresentam murchamento leve.
   5. Grau 7: Lesões no caule circundam toda a circunferência do caule e/ou mais de 2/3 das folhas estão murchas.
   6. 9º ano: Todas as folhas da planta estão murchas ou mortas.
      
8. Prepare estoques de armazenamento de longo prazo de mutantes atenuados confirmados misturando culturas com volume igual de glicerol estéril de 50% até uma concentração final de 25%, e armazene a -80 °C.

5. Identificação de locais de inserção de Tn5 por resgate de plasmídeos

1. Cultive o mutante Tn5 de interesse e extraia DNA genômico usando um kit de extração de DNA genômico bacteriano. Quantifique a concentração de DNA para garantir entrada suficiente para a digestão a jusante.
2. Digerir 1–2 μg de DNA genômico com EcoRI em uma reação de 100 μL contendo 10× tampão de reação e 5 μL de enzima, e incubar a mistura a 37 °C por pelo menos 3 horas. Verifique a conclusão da digestão usando um gel de agarose.
3. Precipite o DNA digerido adicionando 1/10 de volume de 3 M de acetato de sódio e 3 volumes de etanol absoluto. Misture bem e incube a -20 °C por 1 hora.
4. Centrifuge a 13.500 x g por 5 minutos e lave o pellet sequencialmente com etanol 75% e etanol absoluto. Seque o pellet ao ar e ressuspenda em 17 μL de água estéril.
5. Autoliga os fragmentos de DNA digeridos adicionando 2 μL de 10× tampão de ligase de DNA T4 e 1 μL de ligase de DNA T4. Inclua um controle negativo (sem ligase) para verificar a transformação de antecedentes. Incube a reação de ligadura a 4 °C durante a noite para promover a circularização dos fragmentos de restrição.
6. Transforme 10 μL da mistura de ligação em E. coli S17-1 λpir quimicamente competente usando transformação por choque térmico, conforme descrito anteriormente. Recuperar células em LB por 1 hora e colocar em ágar LB contendo kanamicina (LB + kan) para selecionar plasmídeos que transportam a fita Tn5.
7. Escolha cinco colônias aleatórias resistentes à canamicina e extraia DNA plasmídico usando um kit padrão de minipreparação para plasmídeos. Valide a estrutura do plasmídeo digerindo 500 ng de cada plasmídeo com HindIII e incubando a 37 °C por 5 horas. Analise padrões digestivos por eletroforese em gel de agarose.
8. Se os tamanhos das bandas de plasmídeo corresponderem aos padrões esperados de fragmentos, realize o sequenciamento Sanger usando o primer ME de 5' localizado nas extremidades do Tn5.
9. Identifique o local preciso de inserção do Tn5 alinhando a sequência flanqueante de 50-100 bp a jusante da região 5'-ME do Tn5 contra o genoma SM de P. brasiliense usando BLAST ou software de análise genômica.
10. Confirme que todas as cinco reações independentes de sequenciamento para cada mutante correspondem à mesma coordenada genômica (> 98% da identidade da sequência).
11. Se qualquer uma das cinco reações de sequenciamento mapear para uma coordenada genômica diferente, isso indica a presença de múltiplos sítios de inserção de Tn5 naquele mutante. Nesses casos, analisar colônias adicionais para determinar todas as posições de inserção. Alternativamente, realize o Southern blot ou sequenciamento do genoma completo para obter mapeamentos mais definitivos do sítio de inserção.
12. Designe mutantes com um único e consistente sítio de inserção em todas as reações de sequenciamento como mutantes Tn5 de inserção simples adequados para análises fenotípicas ou genéticas posteriores.

Resultados

Para superar a instabilidade causada pela mutação sucB em P. brasiliense, a toxina vmi480 do plasmídeo pLP12 foi empregada como marcador de contra-seleção, e o vetor de suicídio modificado pKV2 (Figura 1A) foi construído substituindo a fita cassete de resistência ao antibiótico e ajustando a configuração do local de clonagem. Para gerar um mutante de deleção recA sem marcadores, braços homólogos esquerdo e direito do gene recA com ~800 bp foram clonados em...

Discussão

A estratégia de manipulação genética desenvolvida neste estudo oferece uma opção para genômica funcional em P. brasiliense, um patógeno primário da podridão mole da^{batata 9,10}. Ao integrar um sistema de contra-seleção baseado em toxinas em uma espinha dorsal de plasmídeos suicidas, foi gerado um mutante ΔrecA sem marcadores. Essa abordagem oferece vantagens significativas em relação aos sistemas tradicionais bas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bacterial genomic DNA extraction kit	Extract bacterial genomic DNA	Tiangen	DP302-02
Diaminopimelic acid	0.3 mM in 1 L medium	Macklin	D836611-5g
DNA assembly kit	DNA assembly	Vazyme	C116-02
DNA purification kit	DNA purification	Tiangen	DP214-02
Kanamycin	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucose	0.2% (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	10% in 1 L medium	OXOID	LP0042B
Yeast Extract	5% in 1 L medium	OXOID	LP0021B
NaCl	10% in 1 L medium	Biofroxx	1249KG001
Agar	15% in 1 L medium	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	0.3% (w/v)	Aladdin	A106196-25g
Plasmid Miniprep kit	Extract plasmid	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA ligase	Linear DNA self-circularization	Yugong Biotech	EG15205
Centrifuge	RWD	M1324R
PCR Thermal Cycler	BIO-GENER	GET3XG
Digital camera	SONY	ILCE-7M4
Electrophoresis system	LY	DYY-6C
Water bath	JOANLAB	WB100-1F
Gel documentation system	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Shaking incubator	ZHICHU	ZQZY-AR8
Constant temperature incubator	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis spectrophotometer	HITACHI	U-3900
Electroporator	BIO-RAD	MicroPulser
Strains and plasmids
P. brasiliense SM	Potato pathogenic bacteria	Laboratory strain collection
E. coli S17-1 λpir	E. coli competent cells	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli competent cells	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli competent cells	Laboratory strain collection
pKV2	The modified suicide plasmid	Constructed in this study
pLP12	suicide plasmid	Laboratory strain collection
pMCS2-LLtnp	Provide the fragment carrying Tn5	Laboratory strain collection
pKV2-LLtnp	The modified plasmid carrying the Tn5 fragment.	Constructed in this study
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Customized
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Customized
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Customized
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Customized
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Customized
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Customized
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Customized
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Customized
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Customized
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Customized
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Customized