Um sistema In Vitro para Aplicar Força de Tração a Células-Tronco Esqueléticas Usando um Sistema de Tensão e Tensão Celular Cíclica

Resumo

Células-tronco periósteas do esqueleto (SSCs) do camundongo foram isoladas por FACS e cultivadas in vitro. Foi estabelecido um sistema experimental controlável para aplicar estimulação mecânica tensível cíclica aos SSCs, resultando em diminuição da expressão dos genes associados à senescência celular, especificamente p16 e p21.

Resumo

O osso é um órgão mecanosensível importante que responde continuamente a sinais físicos no corpo. Embora a estimulação mecânica desempenhe papéis importantes no desenvolvimento esquelético, homeostase e reparo de lesões, as respostas específicas das células-tronco esqueléticas (SSCs) ao estresse mecânico permanecem incompletamente compreendidas. Para responder a essa questão, estabelecemos um modelo in vitro para isolar os SSCs periosteis de camundongos e aplicar estimulação mecânica. As células periosteais de camundongos foram inicialmente obtidas por digestão enzimática, e os SSCs foram subsequentemente isolados por separação celular ativada por fluorescência (FACS) com base em marcadores superficiais estabelecidos. Após a fixação em cultura, os SSCs foram submetidos a estimulação mecânica tensível usando um sistema cíclico de tensão-tensão celular. Esse sistema permite a aplicação reprodutível da força de tração a células cultivadas e fornece uma plataforma para analisar as respostas do SSC à entrada mecânica. Usando essa abordagem, descobrimos que a expressão dos genes associados à senescência celular p16 e p21 foi marcadamente reduzida nos SSCs após estimulação mecânica. Esses achados sugerem que a estimulação à tração pode influenciar mudanças relacionadas à senescência nos SSCs sob condições in vitro . No geral, esse protocolo fornece uma plataforma útil e adequada para estudar o comportamento do SSC sob estimulação mecânica e para investigar como os sinais mecânicos afetam a função do SSC.

Introdução

Como o maior e mais importante órgão de suporte do corpo humano, o sistema esquelético não apenas fornece locais de fixação e proteção para outros órgãos, mas também serve como base para a função motora. Portanto, o sistema esquelético está constantemente exposto a diversos estímulos mecânicos tanto internos quanto externos. Sinais de estimulação mecânica são igualmente cruciais para o desenvolvimento ósseo e para a manutenção funcional. Já em 1893, foi proposto que existe uma certa correlação positiva entre a densidade óssea e a força mecânica que os ossos suportam, que é a lei¹ de Wolff. Nos últimos anos, alguns estudos demonstraram a importância do sistema esquelético suportando forças mecânicas para o desenvolvimento normal dos^ossos 2,3,4,5. A resposta do sistema esquelético à força mecânica depende em parte dos componentes celulares do^{osso 6}. Os osteócitos representam de 85% a 90% dos componentes celulares do sistema esquelético. Devido à sua ampla distribuição e morfologia celular dendrítica única, os osteócitos são atualmente o tipo de célula esquelética mais estudado em termos de resposta mecânica ^7,8. Além da capacidade amplamente reconhecida dos osteócitos de responder à força mecânica, as células precursoras esqueléticas também desempenham um papel indispensável nela. Foi constatado que a resposta das células precursoras periósticas a sinais mecânicos regulava sua transformação do destino, influenciando assim a reparação de danos^{teciduais 9}.

Células-tronco esqueléticas (SSCs) são um tipo de células-tronco específicas de tecidados com capacidade de autorrenovação, que podem se diferenciar em tipos maduros de células ósseas necessárias para o crescimento, manutenção e reparo ósseo. Em 2015, foram identificados¹⁰ genes marcadores de superfície para SSCs de camundongo. Posteriormente, vários estudos também demonstraram que os SSCs desempenham um papel muito importante em diversos aspectos, como desenvolvimento ósseo, manutenção da homeostase e reparo de lesões^ósseas. Devido à característica do sistema esquelético responder a forças mecânicas, podemos considerar os sinais de força mecânica como um fator indispensável na regulação da função das células-tronco esqueléticas. Para estudar as mudanças comportamentais dos SSCs sob estimulação mecânica, precisamos estabelecer um sistema experimental adequado para aplicar força mecânica in vitro.

Os principais métodos de estimulação mecânica in vitro para células incluem tensão de cisalhamento do fluido, tensão de compressão, força de tração, pressão hidrostática, rigidez da matriz e topologia da matriz ^6,13. Com base nos genes marcadores de superfície dos SSCs de camundongo, obtivemos SSCs periosteais de camundongos por meio de ordenação por citometria de fluxo, já que os SSCs envolvidos no reparo de fraturas se originam principalmente do^{periósteo 14}. Subsequentemente, uma força de tração apropriada foi aplicada aos SSCs periosteais por meio de um sistema de tensão e tensão de célula cíclica. Após a estimulação da força de tração, podem ser obtidas amostras celulares e podem ser realizadas análises multi-ômicas, incluindo sequenciamento do transcriptoma, sequenciamento de proteoma e ATAC-seq. Portanto, estabelecer esse protocolo fornece uma base sólida para estudar as respostas dos SSC à estimulação mecânica.

Protocolo

Os experimentos com camundongos neste protocolo foram todos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular de Xangai, Academia Chinesa de Ciências (SIBCB-S350-2312-41).

1. Isolamento de células periósteas em camundongos

1. Coloque camundongos de 4 a 6 semanas em uma caixa de eutanásia com CO₂ e exponha-os continuamente ao CO₂ por 3 minutos até a respiração parar.
2. Desinfete a superfície do corpo dos camundongos com álcool 75%. Use tesouras oftálmicas para separar os membros posteriores. Depois, utilize pinças pontiagudas e tesouras oftálmicas para remover os músculos esqueléticos dos membros posteriores, garantindo que as regiões articulares do fêmur e da tíbia permaneçam intactas.
3. Preserve os ossos isolados em PBS refrigerado e depois cubra ambas as extremidades dos ossos com agarose de baixa fusão (5-10% em tampão TAE).
4. Digere os fêmures e tíbias em meio essencial alfa (α-MEM) contendo 1 mg/mL de colagênase, 2 mg/mL dispase II e 0,1 mg/mL de DNase I a 37°C e 0,3 × g por 30 minutos duas vezes. Colete as células digeridas no meio de cultivo (α-MEM + 10% soro fetal bovino (FBS)).
5. Filtre a suspensão da célula por um filtro de 40 μm e depois centrifuge a 500 × g por 5 minutos para remover o sobrenadante.
6. Ressuspenda o precipitado celular com o buffer de lise de glóbulos vermelhos por 2 minutos e termine a reação com buffer de citometria de fluxo (PBS + FBS 2%).
7. Centrifuge as células a 500 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante. Resuspenda as células com buffer de citometria de fluxo a 1 × 10⁷ células/mL para separação celular.

2. Classificação celular ativada por fluorescência

1. Tinga a suspensão celular com os seguintes anticorpos da seguinte forma: Anti-mouse conjugado PerCP/Cy5.5 CD45, Anti-mouse conjugado PerCP/Cy5.5 CD31, Anti-mouse conjugado PerCP/Cy5.5 Ter119, anti-mouse conjugado com FITC 6C3/Ly-51, Anti-mouse conjugado Brilliant Violet 605 CD90.2, Anti-mouse conjugado PE/Cy7 CD105, Anti-mouse conjugado com APC CD200.
2. Dilua os anticorpos acima na proporção de 1:500 e incube-os no gelo por 30 minutos, protegidos da luz.
3. Lave as células com um tampão de citometria de fluxo e realize a separação celular com um classificador de células ativado por fluorescência para obter CD45^- CD31^- Ter119^- CD90.2^- 6C3^- CD105^- CD200⁺ . Colete os SSCs separados com o meio de cultivo. Analise os dados adquiridos com o software FlowJo v10.8.1.
4. Expanda os SSCs separados em placas de cultura com meio de expansão em uma incubadora_{de células 2} de CO2 a 5%. Uma passagem podia ser realizada antes da estimulação mecânica.
   NOTA: Aproximadamente 1 ×^{10 5} SSCs periosteais podem ser obtidos de cada par de camundongos de 6 semanas.

3. Estimulação mecânica dos SSCs

1. Dilua o colágeno tipo I da cauda de rato em ácido acético esterilizado 0,02 M até uma concentração final de 0,15 mg/mL. Essa solução pode ser reutilizada 3 vezes e deve ser mantida a 4 °C.
2. Adicione 1,5 mL de colágeno diluído do tipo I de rato cauda a cada poço da placa de cultura de fundo flexível de 6 poços. Depois de revestir as placas por 1 hora em temperatura ambiente, aspire o excesso de colágeno e lave as placas uma vez com PBS para uso posterior.
3. NOTA: Para uso imediato, a placa deve ser enxaguada com PBS para remover qualquer ácido residual. Antes do armazenamento a 4 °C, a placa deve ser completamente seca com a tampa removida.
4. Digere os SSCs periosteis de camundongos cultivados, centrifuge a 500 × g por 5 minutos, ressuspenda o precipitado celular no meio de cultivo para alcançar uma densidade celular de 1 × 10⁵ células/mL, adicione 2 mL de suspensão celular a cada poço da placa de cultura de fundo flexível de 6 poços e coloque na incubadora celular.
5. 24 horas após a semeadura das células, coloque a placa de cultura com fundo flexível na placa base esticada e mantenha outra placa de cultura com fundo flexível como grupo controle sem estimulação mecânica.
6. Defina os parâmetros no software FX-6000 Versão 1.0 da seguinte forma: resistência de estiramento 8%, frequência 0,1 Hz, forma de onda como onda quadrada, ciclo de trabalho da forma de onda 80% e duração de estiramento por 12 horas.
   NOTA: Existem quatro posições na base esticada para posicionar uma placa de cultura com fundo flexível de 6 poços. Se as células necessárias para o experimento forem inferiores a 4, as posições vazias devem ser preenchidas com novas placas de cultura de fundo flexível de 6 poços. Após aplicar a estimulação mecânica adequada, os SSCs podem passar por testes funcionais, como diferenciação ou proliferação celular, ou amostras podem ser extraídas para sequenciamento multi-ômico.

4. PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)

1. Após a estimulação mecânica das células, descarta-se o meio de cultura, lava-se as células uma vez com PBS, extraia RNA total com o reagente TRIzol e realizava a transcrição reversa do RNA.
   NOTA: Após a extração de RNA ser concluída, ele pode ser armazenado a -80 °C. O cDNA obtido pela transcrição reversa também pode ser armazenado a -20 °C para testes subsequentes.
2. Realize o RT-qPCR com um sistema de PCR em tempo real. Os conjuntos de primers usados foram os seguintes:
   Hprt: atacante 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
   Hprt: reverso 5'-AGGGCATATCCAACAAACTT-3',
   p16: ataque 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
   p16: reverso 5'-GCACCGTTAGTTGAGCAGAAGAG-3',
   p21: Frente 5'-GCCTGGTTCCTTCCACTTCTT-3',
   p21: reverso 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Os efeitos do tratamento de curto prazo do estresse mecânico

1. Defina os parâmetros no software FX-6000 Versão 1.0 da seguinte forma: força de estiramento 8%, frequência 0,1 Hz, forma de onda como onda quadrada, ciclo de funcionamento da forma de onda 80%. As células são lisadas com o tampão de lise RIPA I (com coquetel inibidor de fosfatase e coquetel inibidor de protease) aos 10 minutos e 60 minutos após a estimulação mecânica por tensão.
2. Realize o Western blot com Erk e anticorpos p-Erk.

Resultados

Após a implementação desse protocolo, a força de tração foi aplicada com sucesso aos SSCs periostais de camundongos. Primeiramente, os SSCs foram obtidos do periósteo de camundongos por citometria de fluxo. Os resultados da citometria de fluxo mostraram que a proporção de SSCs no periósteo representava quase 30% do Lin^- (CD45^-, CD31^-, Ter119^-) CD90,2-6C3^- (Figura 1), que era muito maior do que a da medula óssea. Da...

Discussão

Nos últimos anos, genes marcadores de células-tronco esqueléticas de diferentes partes dos ossos foram continuamente^descobertos 11,12,17. No entanto, pesquisas sobre a regulação direta da função dos SSCs ainda precisam ser aprofundadas, especialmente no aspecto da regulação da estimulação mecânica da força. Até agora, a pesquisa sobre os efeitos regulatórios mecânicos das células-tronco esquelét...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
α-MEM	Corning	10-022-CV	Isolação de células periosteal
APC anti-mouse CD200	BioLegend	123809	Classificação de SSCs
BioFlex 6-Well Culture Plate	Flexcell	BF-3001A	Cultura celular
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2	BioLegend	140317	Classificação de SSCs
Colagenase	Sigma	C0130	Isolação de células periosteal
Dispase II	Sigma	D4693	Isolação de células periosteal
DNase I	Sigma	DN25	Isolação de células periosteal
Soro Bovine Fetal	Gibco	A5356701	Classificação de SSCs
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51	BioLegend	108305	Classificação de SSCs
Flexcell Tension System	Flexcell	Flexercell FX-6000	Tensão celular
Flow Cytometry Sorter	BD	BD FACSAria Fusion	Classificação de SSCs
MesenCult Expansion Kit (Mouse)	Stem cell	05513	Cultura celular
PE/Cy7 anti-mouse CD105	BioLegend	120409	Classificação de SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD31	BioLegend	102522	Classificação de SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD45	BioLegend	103132	Classificação de SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119	BioLegend	116228	Classificação de SSCs
PrimeScript RT Reagent Kit	TaKaRa	RR037A	RT-qPCR
Colágeno tipo I de cauda de rato	Corning	354236	Cultura celular
sistema de PCR em tempo real	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 1 Plus	RT-qPCR
buffer de lise de glóbulos vermelhos	Beyotime	C3702	Isolação de células periosteal
TRIzol	Sigma	T9424	RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail II	MCE	HY-K0022	WesterBlot
RIPA Lysis Buffer I	Sangon Biotech	NO. C500005	WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail	MCE	HY-K0010	WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody	Cell Signaling Technology	9102	WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Anticorpo Monoclonal de Coelho	Cell Signaling Technology	4370	WesterBlot