Fabricação e Aplicação Cirúrgica de Hidrogéis Enriquecidos de Gelatina–Riboflavina com Foto-Cruzamento para Reparo de Feridas Corneanas em Coelhos

Resumo

Um protocolo reprodutível é apresentado para a preparação, enriquecimento e aplicação de um hidrogel in situ de luz azul e reticulável gelatina–riboflavina para reparo de feridas estromais corneanas em coelhos, incluindo etapas procedimentais para manuseio cirúrgico, tarsórrafia parcial e cuidados pós-operatórios.

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para fabricar, suplementar e aplicar cirurgicamente um hidrogel de gelatina cruzável com luz azul e reticulação in situ para reparo de feridas estromais corneanas em coelhos. O precursor do hidrogel é composto por gelatina a 5% (p/v) e fosfato de riboflavina a 0,01% (p/v), preparado em condições estéreis e protegidos pela luz, filtrado por estéril e aquecido antes do uso para alcançar viscosidade injetável. A incorporação opcional de extrato de membrana amniótica humana ou soro autólogo de coelho é detalhada. A gelificação sob demanda é desencadeada na superfície ocular usando luz azul em λ = 420–480 nm, totalizando 2 min. O método in vivo inclui uma queratectomia estromal anterior reprodutível (diâmetro de trefina 6,5 mm; profundidade aproximadamente 187 μm), seguida de preenchimento com hidrogel, ativação de luz e tarsórrafia lateral parcial para estabilizar o tratamento, favorecer a cicatrização da ferida e padronizar o cuidado pós-operatório. Desfechos representativos in vitro evidenciam comportamento viscoelástico semelhante a gel com afinamento por cisalhamento e recuperação rápida, e alta transmitância óptica (> 90%) acima de 500 nm, indicando adequação para uso corneano. In vivo, tratamentos à base de hidrogel apoiam o fechamento progressivo do epitelial, boa tolerância ocular (baixos escores de Draize em 3 e 7 dias) e perda dependente do tempo do hidrogel visível, consistente com biodegradação e substituição tecidual. Passos críticos e pontos de pausa são destacados para garantir a reprodutibilidade, incluindo controle de temperatura durante a dissolução e filtragem, proteção contra a luz e posicionamento da lâmpada durante a reticulação. O protocolo permite estabilização com hidrogel ativada pela luz e sem sutura, colocada com precisão, compatível com a adição de múltiplos suplementos bioativos. Ele oferece uma plataforma prática para avaliação pré-clínica de biomateriais oftálmicos de próxima geração e facilita a tradução de terapias com hidrogel fotocruzável para reparo de feridas corneanas.

Introdução

A córnea é uma estrutura transparente e avascular que representa aproximadamente dois terços do poder refrativo do olho, tornando sua integridade estrutural e funcional essencial para^{a visão 1}. Devido à sua exposição direta ao ambiente externo, a córnea é altamente suscetível a traumas, infecções, lesões químicas e complicações pós-cirúrgicas ^2,3. A falha em restaurar rápida e eficazmente a integridade epitelial pode levar a defeitos epiteliais persistentes (PEDs) e úlceras crônicas na córnea, resultando, em última análise, em derretimento estromal, perfuração, cicatrizes e perda visual irreversível ^4,5. Terapias convencionais — incluindo lubrificantes, profilaxia antibiótica e colírios soróquicos autólogos — frequentemente oferecem apenas benefício parcial e não promovem adequadamente a reparação estromalical em defeitos moderados a^{graves 6,7,8}.

Para enfrentar essas limitações, as terapias baseadas em biomateriais surgiram como alternativas promissoras devido à sua capacidade de proteger a ferida, apoiar o reparo epitelial e restaurar tecido estromal^. Os hidrogéis são particularmente atraentes devido à sua biocompatibilidade, transparência óptica, comportamento mecânico ajustável e capacidade de incorporar agentes terapêuticos. Tanto hidrogéis naturais quanto sintéticos, incluindo^gelatina 15,16,17, colágeno ^18,19,^{quitosano 20,21}, polietilenoglicol (PEG)^22,23 e ácido hialurônico^18,24, demonstraram potencial para promover a cicatrização de feridas corneanas. Entre eles, os hidrogéis à base de gelatina são especialmente valiosos devido à sua composição derivada de colágeno e aos motivos intrínsecos de adesão celular.

Hidrogéis foto-reticuláveis oferecem uma vantagem adicional ao permitir solidificação sob demanda diretamente na superfície ocular, possibilitando colocação precisa e melhorando a estabilidade mecânica sem suturas. A reticulação mediada por riboflavina, originalmente desenvolvida para tratamento com ceratocone, foi recentemente adaptada para fotopolimerização hidrogel devido à sua excelente biocompatibilidade, segurança oftálmica e capacidade de gerar espécies reativas de oxigênio que induzem reticulação sob luz visível ou UV^25,26. A luz azul (≈445 nm) é particularmente vantajosa para aplicações corneanas, possibilitando reticulação eficiente enquanto evita riscos associados à UV 27,28,29.

Este artigo apresenta a fabricação, enriquecimento e aplicação cirúrgica de um hidrogel fotocruzável composto por 5% (v/v) de gelatina e 0,01% (p/v) fosfato de riboflavina (RFP). Um protocolo detalhado é fornecido para a preparação in vitro de hidrogel, incluindo incorporação opcional de extrato de membrana amniótica humana (HAMe) ou soro autólogo (AS), bem como aplicação in vivo em um modelo de queratectomia estromal de coelho. Sabe-se que o HAMe exerce efeitos anti-inflamatórios, anti-fibróticos e pró-regenerativos na superfície ocular 30,31,32,33,34,35, enquanto o soro autólogo fornece concentrações semelhantes a lágrimas de vitamina A, EGF, fibronectina e outros fatores de crescimento essenciais para a regeneração ^epitelial 36,37,38. Juntos, esses elementos apoiam a re-epitelialização, reduzem a inflamação e potencialmente previnem a degradação estromal^.

Embora a abordagem descrita ofereça fotopolimerização controlada e bioatividade personalizável, sua aplicabilidade atualmente é limitada a defeitos superficiais e médios estromais e requer exposição em linha de visão à luz azul, o que pode restringir o uso em tecidos opacos ou profundamente infiltrados. Ao integrar preparação e enriquecimento de hidrogel, manuseio oftálmico e cuidados pós-operatórios, incluindo tarsorrafia lateral parcial, este artigo oferece uma abordagem reprodutível que apoia o reparo corneano, facilita a tradução de tecnologias de hidrogel ativadas por luz para a prática clínica e contribui para o desenvolvimento de plataformas padronizadas para pesquisa regenerativa corneana.

Protocolo

Placentas humanas foram obtidas de doadores com consentimento informado, de acordo com a Declaração de Helsinque e com aprovação do Comitê de Ética do Hospital Universitário de Cruces (número de aprovação CEIC E15/03). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade do País Basco (UPV/EHU) (número de aprovação CEEA M20/2023/038) e em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual. Todos os procedimentos foram realizados na instalação de animais UPV/EHU (SGIker), mantendo a técnica estéril durante todo o processo (gabinete de biossegurança Classe II ao manuseio de biológicos).

1. Síntese de hidrogel

1. Soluções precursoras de gelatina–riboflavina (5% e 10% em v/v)
   NOTA: Trabalhe sob luz fraca ou use frascos âmbar ou embalagens enroladas em papel alumínio para proteger a solução da exposição à luz. Realize todas as etapas em condições estéreis em um exaustor de fluxo laminar quando o hidrogel for destinado a uso biológico.
   1. Pese as quantidades necessárias de gelatina e fosfato de riboflavina (RFP): para 10 mL de precursor RFP de 5% (p/v) + 0,01% (p/v), pesar 500 mg de gelatina e 1 mg de RFP. Para 30 mL de estoque RFP de 10% (p/v) + 0,02% (p/v) de RFP, pesar 3 g de gelatina e 6 mg de RFP.
   2. Adicione a gelatina e o RFP ao volume correspondente de água desionizada (≈90% do volume final). Mexa suavemente até que o pó esteja totalmente disperso.
   3. Ajuste o pH para 7,0 usando 1 M de NaOH, adicionando a base gota a gota enquanto monitora o pH. Registre o volume de NaOH usado e o volume final ajustado. Após o ajuste do pH, leve as soluções ao volume final com água desionizada.
   4. Dissolva e homogeneize a solução a 80 °C sob agitação magnética a 200 rpm por 30 minutos.
      NOTA: Manuseie soluções quentes (>70–80 °C) usando luvas resistentes ao calor.
   5. Deixe as soluções esfriarem até 30–40 °C e filtre-as através de filtros de membrana hidrofílica de poliétersulfona (PES) de 0,22 μm para embalagens âmbar estéreis.
      NOTA: Aqueça suavemente as soluções viscosas (≈ 40–50 °C) antes da filtração, se necessário; evite superaquecimento.
   6. Rotule as garrafas com a composição, data e iniciais do operador. Armazene as soluções de hidrogel filtradas a 4 °C até o uso, garantindo que o período de armazenamento não exceda 2 semanas a partir do preparo.
2. Gelatina hidrogéis suplementada (volume final: 10 mL)
   1. Prepare soro autólogo (EA) ou extrato de membrana amniótica humana (HAMe) seguindo os procedimentos descritos nas seções 4 e 5. Mantenha os extratos estéreis e refrigerados até o uso.
   2. Para cada 10 mL de hidrogel enriquecido, misture 5 mL do estoque de 10% (p/v) de gelatina + 0,02% (p/v) de RFP, e 5 mL do extrato biológico correspondente (AS ou HAMe).
      NOTA: Aqueça suavemente as soluções viscosas (≈ 40–50 °C) antes da filtração, se necessário; evite superaquecimento.
   3. Filtre a solução morna através de um filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm para frascos estéreis de âmbar.
   4. Rotule e armazene os hidrogéis a 4 °C até o uso. Certifique-se de que o período de armazenamento não exceda 2 semanas a partir do preparo.
      NOTA: Descarte todos os resíduos conforme as regulamentações institucionais de biossegurança.

2. Aplicação in vitro de hidrogel

1. Prepare as formulações de hidrogel conforme descrito na Seção 1 e mantenha-as a 32 °C antes da aplicação para manter a viscosidade adequada.
2. Usando técnica estéril, pipeteie o volume necessário de hidrogel para o poço, mofo, prato ou substrato (Figura 1A).
3. Posicione a lâmpada de cura Led-C 2 cm acima da superfície do hidrogel. Inicie a reticulação in situ expondo o hidrogel à luz azul (λ = 420–480 nm) e a uma saída de luz de 850-1000 mW/^cm2 , por uma duração total de 2 min. Entregue a iluminação como seis pulsos de 20 s, inserindo pausas de 5 a 10 s entre os pulsos para evitar aquecimento local (Figura 1B).
4. Confirme a gelificação completa visualmente e tocando suavemente a superfície com um instrumento estéril para garantir a formação de um hidrogel sólido e manipulável (Figura 1C,D).
5. Use o hidrogel reticulado imediatamente ou armazene a 4 °C em condições estéreis adequadas à aplicação a jusante.
   NOTA: Mantenha a técnica asséptica durante todo o procedimento. Evite a exposição direta da pele ou dos olhos à irradiação de luz azul.

3. Aquisição da membrana amniótica humana (HAM)

NOTA: Use apenas placentas de doadores soronegativos que tenham fornecido consentimento informado e atendam aos requisitos institucionais e éticos.

1. Elegibilidade e consentimento do doador
   1. Confirme que cada doador foi avaliado e testou negativo para HIV tipos 1 e 2, hepatite B e C, e sífilis.
   2. Obtenha consentimento informado por escrito de cada doador antes da cirurgia.
   3. Obtenha placentas humanas imediatamente após cesarianas eletivas de doadores saudáveis.
2. Coleta e processamento inicial
   1. Recolha cada placenta em um recipiente estéril de aço inoxidável imediatamente após o parto.
   2. Na sala de cirurgia, enxágue extensivamente a placenta com solução salina estéril para remover coágulos sanguíneos. Identifique o amnion—a membrana mais interna e transparente que revestem a cavidade amniótica—e separe-a cuidadosamente do córion, descascando suavemente em direção à borda placentária usando pinças estériles.
      NOTA: Manuseie as membranas com cuidado para evitar rasgos.
   3. Após a separação completa, fixe peças estéreis do filtro de nitrocelulose na superfície estromal do HAM para facilitar a manipulação e padronizar sua divisão. Divida o HAM em três regiões definidas (Figura 2A,B): amnion distal: seção de 10 cm de largura, amnion medial: seção de 10 cm de largura, amnion proximal: seção que se estende até a borda placentária.
3. Transporte
   1. Coloque cada fragmento de HAM em um frasco estéril, mergulhando-o no Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 1,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 50 μg/mL de neomicina.
   2. Rotule claramente cada frasco com o código do doador, data e a região de origem (distal, medial ou proximal).
   3. Transporte as amostras imediatamente para o laboratório sob condições limpas e assépticas refrigeradas (4 °C).
      NOTA: Transporte as membranas em embalagem tripla e selada, conforme a ONU 3373 (Substância Biológica, Categoria B), de acordo com as regulamentações institucionais de biossegurança que regem tecidos humanos.
4. Processamento laboratorial
   NOTA: Realize todas as etapas subsequentes em um gabinete de segurança biológica Classe II sob condições estéreis.
   1. Corte cada fragmento distal, medial e proximal de HAM em quadrados de 4,0–4,5 × 4,0–4,5 cm usando tesoura estéril.
   2. Imerga os fragmentos em DMEM já mencionado com suplemento antibiótico e escove suavemente com pinças estéreis para remover resíduos sanguíneos. Lave em DMEM contendo 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina por 2 x 5 minutos.
   3. Lave em DMEM sem antibióticos por 2 x 5 minutos.
   4. Lave esses fragmentos selecionados em soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS).
   5. Transfira cada fragmento para um tubo estéril de 5 mL sem qualquer meio de cultura. Congele as amostras diretamente a –80 °C até novo uso.

4. Preparação do extrato de membrana amniótica humana (HAMe)

NOTA: Realize todas as etapas sob condições assépticas e frias para minimizar a degradação e contaminação de proteínas.

1. Retire os tubos contendo fragmentos de membrana amniótica humana (HAM) armazenados a −80 °C. Imerga os tubos em nitrogênio líquido por 5 minutos para endurecer o tecido.
2. Transfira cada fragmento congelado para um almofariz pré-resfriado (−80 °C) e esmague-o cuidadosamente com um pilão até obter um pó macio e homogêneo.
3. Pese imediatamente a amostra em pó em uma placa de equilíbrio para minimizar o descongelamento. Transfira o pó pesado para um tubo de 5 mL e ressuspenda-o em 3 mL de PBS suplementado com um coquetel inibidor de protease de 5 μL/mg.
   NOTA: Mantenha todos os tubos no gelo durante o processamento para preservar a integridade da proteína.
4. Sonice cada amostra por 20 minutos a 90% de amplitude usando o sonicador e a sonda de 1,5 mm de diâmetro, aplicando ciclos de 15 s ligado / 15 segundos desligado para evitar superaquecimento.
5. Centrifuge os lisados a 3.000 × g por 10 minutos a 4 °C. Colete cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
6. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm usando condições estéreis. Aliquota o HAMe filtrado em microtubos de 0,2 mL. Armazene as alíquotas a −80 °C até novo uso.
   NOTA: Certifique-se de que o período de armazenamento não exceda 6 meses a partir do momento da preparação.

5. Extração de soro autólogo derivado do sangue de coelhos

NOTA: Realize todos os procedimentos para ensaios in vivo em coelhos brancos da Nova Zelândia (≈2 kg) sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal da instituição correspondente e em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Anestesiar localmente o coelho com lidocaína (tópica ou subcutânea) no local da venpunctura.
2. Colete sangue da artéria central do ouvido em tubos de coleta de 4,5 mL contendo um separador de gel polimérico (Figuras 3A,B). Deixe o sangue coagular por 2 horas na RT sem agitação (Figura 3C).
3. Centrifuge as amostras a 1.000 × g por 15 minutos em RT. Colete o sobrenadante (soro), que constitui o soro autólogo do coelho (AS) (Figura 3D).
4. Filtre o soro através de um filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm. Coloque aliquota em tubos estéreis de 0,2 mL e armazene a −80 °C até o uso.
   NOTA: Certifique-se de que o período de armazenamento não exceda 6 meses a partir do momento da preparação.

6. Procedimento cirúrgico in vivo

NOTA: Realize todos os procedimentos experimentais de acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa Animal da instituição correspondente e cumpra os Princípios da Declaração de Helsinque e a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual.

1. Preparação pré-operatória
   NOTA: Utilize coelhos brancos da Nova Zelândia (≈2 kg) como modelo animal.
   1. Antes da cirurgia, administre anestesia geral por injeção intramuscular na coxa dos animais usando: cetamina a 1 mL/kg (50 mg/mL) e xilazina a 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Confirme a ausência do reflexo corneano e dos pés antes de prosseguir.
   2. Coloque o animal em posição de decúbito lateral sobre uma plataforma cirúrgica estéril e desinfete a região periocular com solução de povidona-iodo. Coloque um espéculo de pálpebra sobre o olho operador para manter a exposição contínua da superfície ocular durante o procedimento.
2. Ceratectomia estromal anterior
   1. Centralize uma tráfina a vácuo de 6,5 mm de diâmetro na córnea do coelho (Figura 4A). Aplique sucção para estabilizar o dispositivo e gire a tráfina em três quartos de volta, alcançando uma profundidade estromálica aproximada de 187 μm.
   2. Realize uma queratectomia estromal anterior na área trephina usando uma lâmina crescente, removendo as camadas epitelial e estromala anterior até obter um leito liso da ferida (Figura 4B).
3. Aplicação in vivo de hidrogel
   1. Preencha o defeito corneano com 50 μL da formulação correspondente de hidrogel, pré-aquecida a 32 °C para garantir a viscosidade ideal (Figura 4C).
   2. Inicie a reticulação in situ iluminando a superfície corneal com luz azul (λ= 420–480 nm) por 2 min. Administre seis pulsos de 20 s com pausas de 5 a 10 s entre os pulsos para limitar o aquecimento local (Figura 4D).
4. Tarsorrafia parcial lateral
   1. Identifique o terço nasal das margens superior e inferior das pálpebras para permitir a exposição medial para observação e tratamento.
   2. Coloque o primeiro ponto (use 1–2 pontos dependendo do comprimento e estabilidade da pálpebra necessário) (Figura 4E).
      1. Segure a margem lateral superior da pálpebra com uma pinça. Passe a agulha pela linha cinza / margem da pálpebra do lado da pele até o lado conjuntival, dando uma mordida em espessura total, mas evitando penetrações profundas na placa tarsal, se possível.
      2. Passe a agulha pelo ponto correspondente da margem inferior da pálpebra, do lado conjuntival até o lado da pele, para criar a aposição das margens da pálpebra.
      3. Amarre o ponto com um nó de cirurgião seguro e dois nós quadrados, deixando o nó na superfície da pele posicionado levemente para o lado externo da borda da pálpebra, em vez de diretamente sobre ela.
      4. Coloque um segundo ponto aproximadamente 3–4 mm medialmente ao primeiro, se for necessária estabilidade adicional, usando o mesmo ponto em forma de U de espessura total ou um ponto interrompido simples.
      5. Corte as pontas dos pontos para 3–4 mm para reduzir a irritação, deixando comprimento suficiente para remoção posterior.
      6. Confirme que a posição da pálpebra protege a córnea tratada, permitindo o acesso à conjuntiva/córnea medial e temporal para inspeção e tratamento com colírios. Certifique-se de que a tarsorrafia não esteja excessivamente apertada e que as pálpebras do animal não estejam isquêmicas (Figura 4F).
5. Monitoramento e cuidados pós-operatórios
   1. Administre buprenorfina a 0,05 mg/kg por injeção subcutânea antes da queratectomia e a cada 12 horas por 72 horas para administrar analgesia.
   2. Injete colírios de Tobramicina de 3 mg/mL duas vezes ao dia até o fechamento completo da ferida para evitar infecção.
   3. Aplique uma gota de lágrimas artificiais de ácido hialurônico (HA) 0,2% em todos os olhos, incluindo os controles, quatro vezes ao dia para manter a hidratação da córnea.
   4. Inspecione a tarsorrafia pelo menos duas vezes ao dia para sinais de soltura de sutura, infecção, necrose tecidular local ou tensão excessiva. Mantenha o animal sob observação para comportamento normal, alimentação e sinais de desconforto ocular.
   5. Após 72 horas após o procedimento, corte o nó de sutura e retire delicadamente cada ponto com pinças, tomando cuidado para não arrastar contaminantes pela superfície conjuntival.
   6. Inspecionar as margens das pálpebras para cicatrização adequada e a superfície da córnea para verificar a integridade epitelial. Continuar o tratamento ocular conforme necessário até que o fechamento epitelial seja observado.
   7. Monitore e registre a cicatrização ocular e os sinais clínicos do dia 3 ao dia 7, avaliando o fechamento epitelial, a opacidade e a neovascularização usando microscopia com lâmpada de fenda e coloração com fluoresceína.
      NOTA: Se surgir qualquer sinal de isquemia, deiscência da ferida ou irritação severa, remova o(s) sutura(s) imediatamente e trate de acordo com o tratamento.
6. Avaliação de irritação ocular aguda Draize
   1. Prenda o coelho suavemente usando uma toalha/cobertor. Examine primeiro a íris e a conjuntiva sob luz branca.
   2. Pontue vermelhidão conjuntival, quimiose (edema) e corrimento de acordo com a escala de Draize (ver Tabela 1 e Tabela 2).
   3. Registre todos os seis parâmetros de Draize na ficha técnica. Calcule o índice de irritação ocular (OII) como a soma das pontuações dos componentes; OII varia de 0 a 110, onde valores mais altos indicam irritação mais forte.
   4. Classifique cada olho de acordo com as categorias de Kay–Calandra com base no OII; registre a categoria no conjunto de dados.
7. Documentação fotográfica da cicatrização de feridas
   1. Infundir solução de fluoresceína (5 μL) no saco conjuntival inferior.
   2. Ilumine o olho com luz azul e avalie a opacidade da córnea (densidade e área) e a extensão da coloração com fluoresceína.
   3. Ajuste manual do balanço de branco da câmera, desative o zoom óptico e posicione-se aproximadamente 3 cm do olho para capturar todas as imagens usando parâmetros idênticos ao longo das sessões. Capture imagens após a instalação de fluoresceína com e sem iluminação de luz azul para delimitar defeitos epiteliais. Capture imagens no dia 0 (pré-tarsorrafia) e diariamente a partir do dia 3 (após a remoção da tarsorrafia) até o fechamento epitelial completo.
   4. Analise as imagens com o software ImageJ e quantifique a área das regiões tingidas com fluoresceína.
      NOTA: A documentação fotográfica dos dias 1 e 2 normalmente não é viável devido à tarsorrafia parcial. Indique que imagens dos dias 1 e 2 estão ausentes do conjunto de dados e relate quaisquer eventos adversos (por exemplo, abrasão corneana incidental).
8. Eutanásia e coleta de tecidos
   1. No dia 21 (após o período de avaliação de ambos os olhos), anestesiamos profundamente os animais usando cetamina (2 mL/kg) e xilazina (0,6 mL/kg) administradas intramuscularmente.
   2. Eutanasiar por injeção intravenosa de 10 mL de cloreto de potássio saturado (KCl) na veia marginal da orelha.
   3. Confirme a morte pelo início da rigidez cadavérica e ausência de reflexos vitais antes de prosseguir para a colheita de tecido.

Resultados

Síntese e caracterização de hidrogel
O hidrogel foi sintetizado e avaliado in vitro para determinar suas propriedades reológicas e ópticas antes e após a fotocruzamento. A reologia de cisalhamento foi usada para caracterizar viscoelasticidade, escoamento e comportamento de fluxo. Varreduras de frequência mostraram que G′ permaneceu acima de G" em todas as frequências testadas, indicando comportamento semelhante a sólidos (Figura 5A

Discussão

O protocolo atual fornece um fluxo de trabalho reproduzível para a preparação, carregamento e aplicação de um hidrogel gelatina–riboflavina fotocruzável para cicatrização de feridas corneanas. Várias etapas in vitro são críticas para alcançar qualidade consistente do gel e merecem ênfase porque são as fontes mais frequentes de variabilidade. Primeiro, manter a solução precursora a 80 °C durante a agitação garante a dissolução completa da gelatina e do fosfato de riboflavina, pre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amphotericin B	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15290018	Final concentration: 1,25 μg/mL
Autologous serum, rabbit (AS)	Prepared in-house	-	Prepared from whole blood; filtered through 0,22 μm PES
Blue LED curing lamp	Woodpecker Medical Instrument Co	LED.C model	Wavelength: λ=420–480 nm; Distance: 1–2 cm; Light output: 850-1000 mW/cm2
Buprenorphine (Buprecare)	Ecuphar	578950	Dose: 0,05 mg/kg, subcutaneous injection every 12 h for 72 h
Camera	Panasonic	LUMIX TZ35	Camera equipped with Leica optics
Cimarec Digital Stirring Hotplate	Thermo Fisher Scientific	SP131320-33	220-240 V, Max temperature: 540 °C
Crescent microsurgical blade	BVI Medical	373807	-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11966025	-
Eppendorf tubes (0.2 mL)	Merck KGaA	30124707	Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Eppendorf tubes (5 mL)	Merck KGaA	30119606	Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Fluorescein solution	Novartis	Colorcusi Fluotest	2% Fluorescein solution, 5 µl eye drops
Gibco Neomycin	Merck KGaA	N1142	Final concentration: 50 μg/mL
Gelatin powder	Sigma Aldrich	G1890	Dissolved at 80 °C; pH adjusted to 7.0
Hyaluronic acid artificial tears (0.2%)	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
ImageJ image processing software	National Institute of Mental Health	-	Developed by Wayne Rasband at the Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)	Pfizer	631028.1
Lidocaine	Vet One	NDC 13985-222-04	Topical or subcutaneous injection
Penicillin–Streptomycin	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	Final concentration: 50 μg/mL
PES syringe filters, 0.22 μm0.22μm (Millex)	Merck KGaA	SLGP033RS	-
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	P8340	Added at 5 μL per mg tissue
Povidone-iodine solution	Meda pharma	7167204	Preoperative disinfection
Riboflavin phosphate (RFP)	Sigma Aldrich	R0630000	Concentrations: 0,01% w/v (final); 0,02% w/v (stock)
Sonicator	Bandelein electronic	Sonoplus GM mini20	-
Sonicator probe	Bandelein electronic	MS 1.5	1.5 mm dimater probe, 63 mm length.
Tarsorrhaphy sutures (non-absorbable)	Alcon	8065308001	1–2 sutures as needed
Tobramycin ophthalmic solution (3 mg/mL)	Novartis	Tobrex	Dosing: twice daily until closure
Hessburg-Barron trephine, 6.5 mm diameter	Jedmed	21-8265	-
Vacutainer blood collection tubes with polymer gel separator	BD (Becton, Dickinson and Company)	367704	-
Xylazine solution	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	Dose: 5 mg/kg intramuscular injection