Protocolo de Empilhamento de Foco para Fotografia de Insetos em Alta Resolução

Summary

O objetivo é oferecer um método acessível e padronizado de empilhamento de foco para fotografia de insetos, utilizando equipamentos acessíveis para criar imagens nítidas e de alta resolução para taxonomia, pesquisa em biodiversidade, estudos ecológicos e divulgação pública.

Abstract

Aqui, apresentamos um protocolo para adquirir imagens de alta resolução e profundidade de campo estendida de espécimes de insetos por meio de empilhamento fotográfico de foco usando um sistema modular de imagem digital. O método fornece um fluxo de trabalho padronizado que liga equipamentos, montagem, calibração, aquisição de imagens e pós-processamento. Usando uma câmera mirrorless full frame (61 MP) acoplada a objetivos de microscópio e iluminação estroboscópica sincronizada, o protocolo alcança escalas de pixels de 0,76 m a 0,19 m e produz compósitos livres de artefatos por meio de incrementos de foco submicrométricos (0,2 m). O procedimento pode capturar e processar aproximadamente 20 imagens finais por semana sob condições de laboratório rotineiras. Comparado às soluções de empilhamento existentes, essa configuração híbrida de baixo custo (< 30% do custo dos sistemas comerciais) maximiza a acessibilidade enquanto mantém a qualidade de imagem limitada por difração. Aplicações representativas incluem a produção de placas de identificação calibradas por cores para taxonomia, digitalização da biodiversidade e divulgação. A estrutura padronizada do protocolo facilita a reprodutibilidade entre laboratórios e estações de campo, apoiando campanhas de imagem de insetos em grande escala tanto em ambientes com recursos limitados quanto institucionais.

Introduction

Os insetos representam o grupo mais diverso de organismos da Terra e desempenham papéis críticos no funcionamento do^{ecossistema 1}. No entanto, avaliações globais indicam quedas alarmantes em sua abundância e diversidade em^{todo o mundo 2,3}. Imagens precisas da morfologia dos insetos são essenciais para taxonomia, monitoramento ecológico e conservação, especialmente em regiões tropicais ricas em biodiversidade, onde muitos táxons permanecem não descritos⁴. No entanto, a macrofotografia convencional permanece limitada pela profundidade de campo limitada, o que impede que uma única imagem englobe estruturas tridimensionais totalmente nítidas, como antenas ou^{asas 5}.

Os esforços para fotografar insetos para fins científicos remontam a mais de um século, com descrições metodológicas iniciais enfatizando as dificuldades inerentes de capturar detalhes morfológicos^{finos 6}. A macrofotografia convencional, embora amplamente utilizada, permanece limitada pela profundidade de campo rasa alcançada em alta^{ampliação 7,8}. Essa limitação dificulta a documentação de estruturas tridimensionais, como antenas, pernas ou asas, resultando em imagens que não possuem a resolução necessária para identificação precisa ou análise morfológica.

Avanços na fotografia digital e no processamento de imagens permitiram avanços significativos. O empilhamento de foco, onde múltiplas imagens tiradas em diferentes planos focais são fundidas para produzir um composto totalmente nítido, emergiu como uma abordagem particularmente^{eficaz 9}. Seu valor para a entomologia, ao comparar configurações comerciais com soluções semiautomáticas de baixo custo, destaca seu potencial para digitalização em larga escala^{da abordagem 9} do tipo de amostra. Trabalhos posteriores exploraram o uso de câmeras compactas e acessíveis, equipadas com funções de empilhamento de foco, mostrando que a abordagem pode ser estendida além de instituições bem financiadas para apoiar projetos de digitalização^{mais amplos 10}.

O empilhamento de foco — combinando imagens sequenciais tiradas em diferentes planos focais para produzir um composto de foco estendido — tornou-se uma solução^{prática 6}. Estudos comparativos^{iniciais mostraram}que até mesmo sistemas semiautomáticos de baixo custo podem alcançar o desempenho de microscópios comerciais, mas ainda falta um protocolo padronizado e reprodutível adequado para laboratórios com recursos limitados. Métodos alternativos de imagem 3D, como o DISC3D⁸ , fornecem modelos precisos, mas exigem hardware especializado e softwares complexos de reconstrução, limitando sua acessibilidade.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para espécimes de insetos que equilibra qualidade da imagem, custo e portabilidade. O sistema integra componentes ópticos e mecânicos amplamente disponíveis com rigorosos passos de calibração de cores e pós-processamento. Sua adequação vai desde a digitalização em museus até estações de campo semi-permanentes, permitindo que pesquisadores produzam imagens reprodutíveis sem depender de equipamentos proprietários ou microscópios automatizados de alto custo. Isso
O estudo preenche uma lacuna metodológica ao oferecer um fluxo de trabalho validado e aberto
alinhado com ênfase na transparência e reprodutibilidade.

Protocol

1. Configuração de equipamentos

1. Projete um sistema modular de imagem que integre componentes ópticos de alto nível com equipamentos acessíveis e amplamente disponíveis (Arquivo Suplementar 1)
2. Combine mecânica de precisão, iluminação controlada e óptica avançada para alcançar empilhamento de foco de alta resolução, mantendo flexibilidade para diferentes tamanhos e morfologias de insetos.
3. Use os seguintes componentes principais.
   1. Câmera
      1. Use uma câmera digital full-frame de alta resolução com forte alcance dinâmico para capturar estruturas morfológicas finas em detalhes.
      2. Monte a câmera em um trilho de foco altamente especializado (Arquivo Suplementar 1)
   2. Óptica
      1. Use objetivos de microscópio corrigidos ao infinito com ampliações como 5X, 7,5X, 10X e 20X (Arquivo Suplementar 1), montados em um sistema de tubos.
      2. Complemente o conjunto de objetivos com uma lente ultra-macro para espécimes maiores.
      3. Incluir tubos de lente com diferentes níveis de ampliação conforme necessário (Arquivo Suplementar 1)
   3. Iluminação
      1. Instale duas unidades de flash de estúdio na posição vertical traseira para fornecer iluminação consistente e potente.
      2. Posicione duas unidades de flash de alta velocidade na frente em um ângulo para permitir curta duração de flash e tempo de reciclagem rápido.
      3. Monte as luzes em suportes ajustáveis para alcançar uma iluminação uniforme e sem sombras (Arquivo Suplementar 1).
      4. Coloque um difusor na frente da lente para suavizar a luz e reduzir sombras fortes (Arquivo Suplementar 1).
   4. Sistema de apoio
      1. Monte uma mesa antivibração para minimizar a vibração durante a captura da imagem.
      2. Use um suporte de tripé e um fundo preto não refletivo para reduzir vibrações e reflexos.
      3. Adicione um trilho macro especializado para estabilizar a câmera no sistema de empilhamento (Arquivo Suplementar 1).
      4. Use um dispositivo de posicionamento rotativo de três eixos (Arquivo Suplementar 1) para alinhar e posicionar o sujeito com precisão.
      5. Use um estágio de ajuste micrométrico de precisão para fazer ajustes macro finos em escala milhométrica.
   5. Sistema de foco
      1. Opere um rack de foco controlado por motores em passos através de uma unidade de controle dedicada e cabo de rede.
      2. Ajuste os incrementos de movimento até 0,2 μm para garantir amostragem precisa em profundidade para o empilhamento de foco.
      3. Use um túnel preto cilíndrico para controlar a direção da luz e reduzir reflexões ao fotografar sujeitos muito pequenos (Arquivo Suplementar 1).
      4. Use um gatilho para sincronizar o disparo do flash com precisão com o obturador da câmera (Arquivo Suplementar 1).
   6. Computação e acessórios
      1. Use um laptop de alto desempenho com pelo menos 128 GB de RAM para processamento de imagem.
      2. Use um leitor rápido de cartão de memória, um tablet gráfico e um mouse de alta precisão para acelerar o pós-processamento.
      3. Carregue dois cartões de memória de alta capacidade para garantir armazenamento suficiente para operações de campo.
4. Montar o sistema a partir de componentes provenientes de vários fabricantes para criar um setup híbrido personalizado otimizado para imagem de insetos.

2. Calibração de cor

1. Reduza imprecisões de luz dispersa e cor cercando o sistema de câmeras com paredes pintadas de preto.
2. Use um iluminante padronizado de luz diurna a 6500 K para imitar a luz do dia e manter condições de imagem consistentes.
3. Realize a calibração da câmera.
   1. Calibre a câmera usando uma tabela de referência de cores padronizada.
   2. Fotografe a tabela de referência de cores sob a mesma iluminação com equilíbrio de luz do dia usada para os espécimes de insetos.
   3. Gerar um perfil de cor personalizado usando um software de calibração de cores.
   4. Aplique o perfil de cor personalizado durante o pós-processamento para corrigir variações de lentes e iluminação.
4. Realize a calibração do monitor.
   1. Calibre o monitor usando um dispositivo de gerenciamento de cor.
   2. Calibre o monitor de edição com um colorímetro e um software de perfil.
   3. Ajuste a calibração do monitor para gamma 2.2 e ponto branco D65 para corresponder às condições de imagem.
5. Mantenha esse fluxo de trabalho de calibração dupla para preservar a precisão das cores desde a captura até a saída final.

3. Empilhamento

1. Monte cada espécime em suportes ajustáveis para garantir uma posição estável.
2. Adquira imagens usando o rack de foco motorizado.
3. Ajuste o tamanho dos passos entre 0,2 e 2 μm de acordo com o tamanho da amostra e a profundidade de campo necessária.
4. Capture entre 50 e 2.000 imagens em toda a faixa focal de cada espécime.
5. Sincronize a iluminação com a exposição da câmera para minimizar o desfoque de movimento.
6. Armazene arquivos de imagem brutos em cartões de memória e transfira-os para o computador de processamento imediatamente após a aquisição.

4. Software

1. Transfira os arquivos brutos para um software de gerenciamento de imagens para a organização inicial.
2. Selecione todas as imagens e aplique o perfil de cor específico da câmera para preservar a precisão das cores.
3. Exporte as imagens como arquivos TIFF de alta resolução.
4. Processe os arquivos TIFF em um software de concentração.
5. Teste os métodos de empilhamento disponíveis de acordo com a complexidade da amostra.
   1. Use um método de média baseado em contraste ao trabalhar com sujeitos simples e uniformes.
   2. Use um método baseado em mapa de profundidade quando precisar do melhor equilíbrio entre nitidez e redução de artefatos (Arquivo Suplementar 1).
   3. Use um método baseado em pirâmide quando precisar capturar detalhes finos e bordas complexas enquanto monitora artefatos de halo.
6. Aplique o fluxo de trabalho híbrido.
   1. Processe primeiro a pilha original de imagens com o método baseado em mapa de profundidade para criar um composto intermediário com forte nitidez geral e fidelidade de cor.
   2. Guarde a primeira saída intermediária.
   3. Reprocesse a pilha original com o método baseado em pirâmide para criar um segundo composto enfatizando o detalhe das arestas.
   4. Guarde a segunda saída intermediária.
   5. Carregue ambas as saídas intermediárias como uma nova pilha no software de empilhamento de foco.
   6. Aplique novamente o método baseado em mapa de profundidade para fundi-los em um composto final que combine as forças de ambos os métodos enquanto minimiza artefatos.
7. Refinar a imagem empilhada em um software de edição de imagem.
   1. Remova o fundo, corrija artefatos e verifique a calibração das cores.
   2. Faça ajustes sutis de contraste e brilho para melhorar a visibilidade morfológica.
   3. Registre cada etapa de pós-processamento para garantir a reprodutibilidade.
   4. Use um tablet gráfico para melhorar a precisão durante a edição avançada.
8. Use as seguintes ferramentas durante a edição avançada.
   1. Use uma ferramenta de seleção à mão livre para selecionar áreas irregulares para edições direcionadas.
   2. Use uma ferramenta de escurecimento para reduzir seletivamente regiões superexpostas ou irregulares.
   3. Use uma ferramenta de navegação para mover e reposicionar a imagem durante a edição detalhada.
   4. Use um pincel de cicatrização ou correção para remover manchas, marcas de poeira e pequenas imperfeições.
9. Produzir uma imagem totalmente nítida e de qualidade de publicação, mantendo a eficiência em ambientes com recursos limitados.
   (Coloque o Arquivo Suplementar 1 aqui)

5. Preparação e preparação

1. Montando a estação de trabalho de imagem
   1. Coloque uma mesa de amortecimento de vibração sobre uma superfície estável.
   2. Posicione um trilho de montagem da câmera no centro da mesa.
   3. Fixe o corpo da câmera digital no trilho usando um adaptador de placa rígida.
   4. Conecte a objetiva selecionada do microscópio (5×–20×) ou a lente macro via o adaptador de tubo apropriado.
   5. Instale duas fontes de luz traseiras e duas frontais equipadas com difusores para criar uma iluminação uniforme.
   6. Monte o suporte do sujeito (palco XYZ ou suporte rotativo) diretamente abaixo do eixo da lente.
      NOTA: PONTO DE PAUSA: O conjunto completo de hardware pode permanecer montado indefinidamente se for coberto para protegê-lo da poeira.
2. Verificação do alinhamento do sistema
   1. Certifique-se de que o eixo óptico seja perpendicular ao plano da amostra.
   2. Ajuste os níveis horizontal e vertical usando micrômetros de estágio até que as reflexões fiquem simétricas.
   3. Confirme que a iluminação é homogênea em todo o campo; Realinhe os difusores conforme necessário.

6. Calibração de cor

1. Ajustar a iluminação e o ambiente.
   1. Use luz difusa a ~6500 K (equivalente à luz do dia).
      1. Minimize reflexos ambientes cercando o setup com superfícies escuras e foscas.
   2. Calibração de cor
      1. Fotografe uma tabela de referência de cores com 24 patchs sob a luz de imagem.
      2. Gerar um perfil de câmera usando o software de calibração complementar.
      3. Aplique este perfil a todas as imagens raw subsequentes durante a conversão.
      4. Calibre o monitor de exibição para γ = 2,2 e ponto branco D65 para garantir uma renderização de cores consistente durante o fluxo de trabalho.

7. Montagem e foco do espécime

1. Preparação de espécimes.
   1. Fixe insetos secos ou preservados com etanol em uma base de montagem macia, como argila de modelar.
   2. Oriente o espécime de acordo com a vista desejada (dorsal, lateral, ventral ou frontal).
   3. Posicione o suporte centralizado sob o eixo óptico.
2. Ajuste do espaçamento entre a pilha de foco
   1. Defina o início e o fim da faixa focal com os planos mais próximos e mais distantes e nítidos.
   2. Programa movimento incremental entre 0,2 μm e 2 μm dependendo da ampliação.
   3. Sincronize o gatilho de captura para que a iluminação dispare simultaneamente com cada exposição da imagem.
   4. Capturar sequências de 50 a 2000 imagens de acordo com o tamanho e profundidade do espetáculo.
      NOTA: PONTO DE PAUSA: A captura pode ser pausada com segurança entre as sequências.

8. Processamento de Imagem

1. Converter e organizar imagens raw.
   1. Transfira arquivos para um computador local imediatamente após a aquisição.
   2. Agrupe cada pilha em uma pasta única usando numeração incremental.
   3. Aplique perfis de lente e correção de cor, depois exporte as imagens como arquivos TIFF de 16 bits.
   4. Empilhamento de imagens
   5. Abra a pilha TIFF no software de empilhamento de foco.
   6. Escolha um algoritmo de mapa de profundidade (equivalente ao "Método B") para o primeiro compósito.
   7. Opcionalmente, reempilhe usando um algoritmo de realce de bordas ("Método C") e mescla ambas as saídas para maximizar a nitidez enquanto reduz halos.
   8. Salve o composto final em um formato sem perdas.
2. Pós-processamento de imagens
   1. Abra o composto em um programa de edição de imagem.
   2. Remova artefatos de fundo e poeira usando ferramentas de seleção e cura.
   3. Ajuste o brilho e o contraste gerais para melhorar a visibilidade das características morfológicas.
   4. Documente cada ajuste para garantir a rastreabilidade.
      Nota: PONTO DE PAUSA: A etapa de limpeza pode ser retomada posteriormente sem perda de dados.

9. Garantia de qualidade e armazenamento

1. Inspecione a imagem final com 100% de ampliação para verificar se não restam desalinhamentos de empilhamento ou mudanças de cor.
2. Registre todos os parâmetros de imagem (ampliação, tamanho do passo, exposição, versões do software) na folha de metadados.
3. Armazenar arquivos brutos, intermediários e finais em drives redundantes; Mantenha um diário de bordo digital.

Results

Validação da Qualidade e Resolução da Imagem

O sistema de empilhamento de foco produzia composições totalmente nítidas e de alto contraste em ampliações de 5× a 20×. As escalas de pixels calculadas variaram de 0,76 μm (5×) a 0,19 μm (20×) no espaço objeto, confirmando amostragem adequada para detalhes estruturais submicronicos da cutícula e dos apêndices dos insetos. Pilhas representativas de 800–2000 quadros demonstraram nitidez consistente n...

Discussion

O desempenho ideal do procedimento de empilhamento de foco depende de (i) isolamento completo da configuração contra vibrações, (ii) calibração precisa do trilho de foco em incrementos submicrônicos e (iii) calibração consistente da cor. Qualquer desvio desses parâmetros aumenta significativamente a formação de halos e mudanças de cor⁹. A combinação de estabilidade mecânica e iluminação padronizada representa o fator mais crítico da qualidade da imagem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela de suporte	Preferencialmente 3 pods	Base estável para todo o conjunto	150
Tabela antivibração	Costume	Minimiza vibrações durante a captura de imagens	3,200
Túnel preto cilíndrico	Costume	Controle a direção da luz	350
Reduz reflexões para pequenos sujeitos
Rack de foco Novoflex CASTEL-MICRO (macro rail)	Motor de passo– controlado, unidade de controle, cabo de rede, adaptador Euro AC	Foco de precisão submicrométrica (0,2 & micro; degraus m);	3,000
automatiza o movimento da câmera
Rotativo XYZ	Montagem ajustável	Alinhamento e posicionamento meticulosos dos sujeitos	500
Câmera	Sony Alpha 7R IV (61 MP full-frame)	Captura de imagem em alta resolução	3,000
Iluminação	2 vezes; Godox SK300II	Iluminação uniforme e sem sombras;	400
Iluminação	2 vezes; Godox QT600II	alta velocidade com curta duração de flash	1400
Suportes de flash	3 suportes ajustáveis	Posicionamento flexível das luzes	100
Modificador de luz	Difusor	Suaviza a luz e reduz sombras fortes	50
Contexto	“ Buraco negro" veludo	Elimina reflexos, fornece fundo uniforme	200
Objetivos do microscópio	Plano Mitutoyo Apo Infinity Corrigido: 5 e mais vezes;	Ampliação de alta qualidade para microestruturas	1,000
Plano Mitutoyo Apo Infinity Corrigido: 7,5 vezes;	2,000
Plano Mitutoyo Apo Infinity Corrigido: 10 e vezes;	1,400
Mitutoyo Plan Apo Infinity Corrigido: 20 e mais vezes;	5,000
Sistema de tubos de lente	Uso direto de câmera das lentes Mitutoyo M-Plan (2x, 5x, 7,5x, 10x, 20x)	Acoplamento de objetivos de microscópio à câmera	400
Adaptador	Montagem Sony E para baioneta universal A da NOVOFLEX	Conexão mecânica entre câmera e sistema óptico	300
Lente macro	Venus Optics Laowa 100 mm f/2.8 2 vezes; Ultra Macro APO (Montagem Sony E-mount)	Imagem de espetáculos maiores em alta ampliação	550
Gatilho	Gatilho de flash	Sincroniza o flash com o obturador da câmera	50
Computador	Laptop ASUS ou Alienware, ≥ 128 GB de RAM, processador de alto desempenho	Processamento e armazenamento de imagens	3,000
Mídia de armazenamento	2 vezes; SD 256 GB, leitor rápido de cartão SD	Armazenamento e transferência de imagens de alto volume seguro	200
Acessórios	Mouse gamer	Precisão durante a edição e navegação	50
Acessórios	Wacom One (tablet gráfico)	Controle fino durante a limpeza e edição da imagem	500
Custo total			26.800