Eletroestimulação auricular combinada com decocção Sunshi Dingtong aliviam a dismenorreia primária com estagnação do qi e estase sanguínea em ratos

Resumo

A eletroestimulação auricular transcutânea combinada com a decocção Sunshi Dingtong aliviou a lesão patológica uterina e as alterações relacionadas à inflamação em um modelo de rato de dismenorreia primária com estagnação do qi e estase sanguínea, acompanhada por alteração na expressão de mRNA de PPAR-γ2 e COX-2.

Resumo

Dismenorreia primária com estagnação do qi e padrão de estase sanguínea está associada à inflamação e dor uterinas, e as terapias farmacológicas atuais podem causar efeitos adversos. Este estudo avaliou os efeitos terapêuticos combinados da eletroestimulação pontual auricular transcutânea (TEAP) e da decocção Sunshi Dingtong (SDD) em um modelo de rato de estagnação do qi e estase sanguínea primária da dismenorreia. Trinta e seis fêmeas de ratos Sprague–Dawley foram alocadas aleatoriamente para os grupos em branco, modelo, SDD, TEAP, TEAP mais SDD e ibuprofeno. O modelo foi induzido usando sensibilização com benzoato de estradiol, estimulação combinada de espina por epinefrina cloridrato e administração de ocitocina. Os ratos receberam soro fisiológico, SDD, ibuprofeno ou TEAP em pontos auriculares definidos por sete dias. A morfologia uterina foi examinada por coloração por hematoxilina e eosina. Os níveis uterinos de IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α e PGE2 foram medidos por ELISA, e a expressão de mRNA de PPAR-γ2 e COX-2 no útero foi quantificada por PCR em tempo real. Ratos-modelo apresentaram degeneração epitelial uterina, infiltração de neutrófilos, aumento da expressão de mRNA de IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α e COX-2, além de diminuição da expressão de mRNA de PGE2 e PPAR-γ2. O TEAP ou SDD sozinho reverteu parcialmente essas mudanças patológicas e moleculares, enquanto a combinação de TEAP com SDD produziu melhorias mais pronunciadas, com efeitos comparáveis aos observados no grupo do ibuprofeno. Esses achados sugerem que o TEAP combinado com SDD alivia lesão patológica uterina e alterações relacionadas à inflamação na estagnação do qi e estase sanguínea (QSBSPD) em ratos com dismenorreia primária (QSBSPD), e que esses efeitos estão associados à regulação da expressão de mRNA PPAR-γ2 e COX-2.

Introdução

A dismenorreia primária (DP), também chamada de dor menstrual funcional, é caracterizada pela ocorrência de dismenorreia sem qualquer patologia orgânica identificável nos órgãos^{reprodutivos 1}. Pacientes do sexo feminino que apresentam dismenorreia grave frequentemente se veem incapazes de realizar tarefas diárias, o que impacta significativamente sua qualidade de vida e exige intervenção farmacológica para alívio dos^{sintomas 2}. A literatura existente indica que está associada a vários fatores, incluindo prostaglandinas (PGs), estrogênio, progesterona, vasopressina, ocitocina (OT), o sistema imunológico, efeitos neuroendócrinos e alterações nos níveis de cálcio^{dos microelementos 3}. Simultaneamente, fatores inflamatórios, como fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-6 (IL-6), podem induzir a síntese ou secreção de PGs. Esse processo leva à hipercontração dos músculos uterinos, resultando subsequentemente em dor isquêmica e DP⁴. Atualmente, o manejo da DP na medicina contemporânea é principalmente categorizado em tratamento geral, tratamento farmacológico e intervenção cirúrgica. Entre as opções farmacológicas, anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), como o ibuprofeno, são frequentemente utilizados. No entanto, o uso de AINEs está correlacionado a efeitos colaterais gastrointestinais significativos, e o uso prolongado ou intenso pode resultar em complicações como úlceras pépticas e sangramento gastrointestinal^{superior 5}. Portanto, identificar e desenvolver estratégias mais seguras e eficazes para o tratamento da DP é imprescindível e necessário.

Evidências crescentes sugerem que a dismenorreia primária está frequentemente associada a um padrão excessivo na medicina tradicional chinesa, entre os quais estagnação do qi e estase sanguínea são comumente observadas^{clinicamente.} Nesse padrão, a deterioração do movimento do qi e da circulação sanguínea são consideradas contribuindo para a estase uterina, contração excessiva do útero e dor. Estratégias terapêuticas que regulam o qi, ativam a circulação sanguínea, aquecem os meridianos e aliviam a dor são, portanto, comumente usadas para essa condição. A terapia pontual auricular é uma intervenção não farmacológica importante na medicina tradicional chinesa. É simples de aplicar e tem sido usado para aliviar a dor modulando vias analgésicas neuroendócrinas^{e endógenas 7}. A decocção Sunshi Dingtong (SDD), uma fórmula baseada em experiência clínica desenvolvida pelo Departamento de Ginecologia do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Fuzhou, tem sido usada para dismenorreia caracterizada por estagnação do qi e estase sanguínea. A fórmula é baseada no princípio terapêutico de regular o qi e o sangue, promover a circulação sanguínea, aquecer os meridianos e aliviar a dor menstrual. A SDD contém Shixiao San, que consiste em pólen tifo (Puhuang) e fezes Trogopterori (Wulingzhi), juntamente com Rhizoma Cyperi (Xiangfu), Mirra (Moyao), Ramulus cinnamomi (Guizhi), Radix et Rhizoma Clematidis Chinensis (Weilingxian), Herba Salivae Chinensis (Shijianchuan), Rhizoma Corydalis Yanhusuo (Yanhusuo), Radix Angelicae Sinensis (Danggui), Herba Artemisiae Anomalae (Liujinu) e Fructus foeniculi (Xiaohuixiang). No entanto, a eficácia experimental da SDD, especialmente quando combinada com eletroestimulação pontual auricular transcutânea, não foi avaliada sistematicamente em um modelo animal controlado de estagnação do qi e dismenorreia primária em estase sanguínea.

Os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs), pertencentes à família dos receptores de hormônios nucleares, são receptores ativados por ligantes integrais para a regulação de inúmeros processos metabólicos intracelulares. Existem três subtipos distintos de PPARs, conhecidos como PPAR-α, PPAR-β/δ e PPAR-γ⁸. Descobertas recentes indicam que o PPAR-γ2 é expresso em uma ampla variedade de tecidos e apresenta uma associação significativa com processos^{inflamatórios 9}. De acordo com o relatório, o PPAR-γ suprime a expressão de IL-6, ciclooxigenase-2 (COX-2), endotelina-1, sintase de óxido nítrico, metaloproteinase matricial-9, gelatinase e adesão por meio da inativação do fator nuclear κB, da proteína ativada 1, do transdutor de sinal e ativador das vias de sinalização da transcrição, inibindo assim a resposta^{inflamatória 10}. Além disso, Huang et ^al.11 indicam que COX-2 e PPAR-γ2 podem servir como alvos críticos implicados na fisiopatologia dos distúrbios de estagnação do qi e estase sanguínea (QSBS).

Portanto, este estudo investigou os efeitos terapêuticos da eletroestimulação pontual auricular transcutânea (TEAP), SDD, e sua aplicação combinada em um modelo de rato de estagnação do qi e estase sanguínea primária da dismenorreia. Ao integrar histopatologia uterina, perfil de mediadores inflamatórios, medição de prostaglandinas e análise de mRNA relacionada a PPAR-γ2/COX-2, este estudo teve como objetivo avaliar se a terapia combinada baseada na medicina tradicional chinesa interna e externa poderia proporcionar proteção aprimorada contra a inflamação uterina associada à dismenorreia. A novidade deste trabalho está na avaliação experimental do TEAP combinada com uma fórmula SDD baseada em experiência clínica em um modelo controlado de dismenorreia primária de estagnação do qi e estase sanguínea (QSBSPD) e na exploração de sua potencial associação com o eixo regulatório inflamatório PPAR-γ2/COX-2.

Protocolo

Declaração ética

Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética de Animais do Laboratório de Biotecnologia Fujian Ambry, número de aprovação: IACUC FJABR2024031202). Realize todos os experimentos com animais de acordo com o protocolo institucional aprovado de cuidado e uso animal.

SDD e preparação de ibuprofeno

A SDD é composta por Shixiao San (9 g), Xiangfu (9 g), Moyao (6 g), Guizhi (9 g), Weilingxian (12 g), Shijianchuan (20 g), Yanhusuo (12 g), Danggui (9 g), Liujinu (15 g) e Xiaohuixiang (5 g). Shixiao San é composto por Puhuang (4,5 g) e Wulingzhi (4,5 g). Todos os componentes herbais eram usados como grânulos concentrados e estão listados na Tabela de Materiais. Prepare a SDD dissolvendo 106 g de grânulos concentrados em 200 mL de água fervente para obter uma concentração final de 0,53 g/mL equivalente a um medicamento bruto. Misture bem até que os grânulos estejam completamente dissolvidos, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e administre por gavage intragástrico a 2,5 mL/kg por administração. Prepare a suspensão de ibuprofeno de acordo com a concentração necessária para a penetração intragástrica. Administrar ibuprofeno a 0,02 g/kg como tratamento controle positivo.

Animais e agrupamento

Use 36 ratas Sprague-Dawley adultas saudáveis de grau específico livre de patógenos, com idades entre 2 e 3 meses e pesando 200 ± 20 g, sem histórico de gravidez ou acasalamento. Mantenha os ratos sob um ciclo de 12 h/12 horas claro/escuro a 22 ± 2 °C e umidade relativa de 50%–70%, com acesso livre à comida padrão e água potável. Após 1 semana de aclimatação, separe aleatoriamente os ratos em seis grupos (n = 6 por grupo): branco, modelo, SDD, TEAP, SDD + TEAP e grupos ibuprofeno.

Preparação e administração do modelo QSBSPD

Neste experimento, foi utilizado o modelo amplamente aceito de dismenorreia induzida por OT. Resumidamente, os ciclos estrois dos ratos foram avaliados por meio de esfregologia vaginal. Os ratos foram considerados elegíveis para inclusão no estudo se a duração do ciclo estro fosse determinada como de 4 a 5 dias.

Com exceção do grupo em branco, os ratos dos grupos experimentais receberam injeção subcutânea diária de estradiol, benzoato e cloridrato de epinefrina, por 10 dias. Após a injeção de cloridrato de epinefrina na dosagem de 0,9 mg/kg diário, os ratos foram expostos a várias estimulações combinadas (A: Estimulação acústica: ratos foram expostos a estímulos acústicos (90 dB, 1 kHz) por 5 min/time, 3–4 vezes ao dia, com um intervalo de 2 horas entre cada vez. B: Estimulação da luz: ratos foram expostos a estímulos de luz intermitente por 5 min/time, 3–4 vezes ao dia, com um intervalo de 2 horas entre cada vez. C: Estimulação elétrica: ratos foram submetidos a estimulação elétrica (pulsos bifásicos de onda quadrada) a 30–35 V, com corrente alternada aplicada por 0,3 s a cada 2 s. Essa estimulação era administrada por 5 minutos a cada 2 horas, 2 a 4 vezes ao dia. D: Contenção: ratos eram colocados em uma gaiola de contenção construída de arame farpado, medindo aproximadamente 25 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro. Uma vez dentro da gaiola, as pontas eram presas para imobilizar os ratos e restringir seus movimentos por 2 horas, uma vez ao dia). Além disso, nos dias 1 e 10, os ratos receberam injeção subcutânea com 5,0 mg/kg/dia de benzoato de estradiol, e nos dias 2–9, receberam 2,5 mg/kg/dia.

A partir do 5º dia da injeção de benzoato de estradiol, os ratos receberam administração intragástrica de diferentes medicamentos por 7 dias, duas vezes ao dia, às 10h e às 16h, exceto o grupo do ibuprofeno, que recebeu uma dose diária às 10h. Nos grupos em branco, modelo e TEAP, os ratos receberam 2,5 mL/kg de soro fisiológico normal. Nos grupos SDD e TEAP+SDD, os ratos receberam 2,5 mL/kg de SDD (preparados como 106 g de droga bruta dissolvida em 200 mL de água, 0,53 g/mL); Essa dose foi convertida a partir da dose clínica diária adulta de 106 g com base na equivalência da área de superfície corporal, resultando em uma dose equivalente a rato. No grupo do ibuprofeno, os ratos receberam 0,02 g/kg de suspensão de ibuprofeno. Nos grupos TEAP e TEAP+SDD, os ratos receberam estimulação com TEAP a partir do 5º dia após a injeção de benzoato de estradiol. Fixe os eletrodos nos pontos auriculares bilaterais Jiaogan, Shenmen, Neishengzhiji e Neifenmi, conforme definido de acordo com um padrão previamente relatado para localização de pontos de acupuntura^{em ratos 12}. Esses pontos estão situados na cavidade cômica bilateral do ouvido, inervados pelo nervo vago. Os eletrodos eram conectados a um instrumento eletrônico de terapia por agulha, que emitia uma onda contínua por 20 minutos (frequência: 20 Hz; intensidade: 1 mA), uma vez ao dia. Os ratos do grupo TEAP+SDD passaram por TEAP após o primeiro ciclo de SDD todos os dias. A estimulação final do TEAP foi realizada antes da injeção intraperitoneal de OT.

Às 24 horas após a última injeção de benzoato de estradiol, ou seja, no 11º dia, 1 hora após a última administração intragástrica, exceto nos grupos em branco e TEAP, os ratos dos outros grupos receberam 2 U de OT por rato com injeção intraperitoneal. Os ratos do grupo TEAP passaram por injeção intraperitoneal de OT na dosagem de 2 U por rato após a estimulação final do TEAP. Os ratos do grupo em branco não receberam injeção de OT. Esse protocolo estabeleceu com sucesso um modelo rat do QSBSPD. A seleção geral dos animais, preparação do modelo, cronograma de administração de medicamentos, parâmetros de estimulação do TEAP e localizações dos pontos auriculares são resumidos na Figura 1.

Coloração de Wright-Giemsa

O ciclo estro foi determinado pela coloração de Wright-Giemsa em manchas vaginais. Um cotoneto estéril foi umedecido com solução de cloreto de sódio 0,9% e inserido suavemente entre 0,5 e 1,0 cm no canal vaginal. O swab foi rodado 1 a 2 vezes para coletar células esfoliadas vaginais, e a amostra foi espalhada uniformemente sobre uma lâmina de vidro limpa em uma direção. A mancha foi seca ao ar em temperatura ambiente. A solução de coloração Wright-Giemsa foi adicionada para cobrir a mancha e incubada por 5 minutos. Um volume igual de soro salino tamponado com fosfato foi então adicionado à solução de coloração, e a coloração continuou por mais 5 minutos. A lâmina foi delicadamente enxaguada três vezes com água ultrapura, seca ao ar e examinada ao microscópio óptico. O estágio do ciclo estroso foi identificado de acordo com os tipos celulares dominantes, incluindo células epiteliais nucleadas, células epiteliais cornificadas e leucócitos.

Coleta de amostras

Os ratos foram colocados em uma caixa de indução de anestesia com concentração de isoflurano ajustada entre 3% e 5%. Após os ratos perder a consciência, foram transferidos para a mesa de cirurgia e mantidos sob anestesia com uma máscara. A concentração foi reduzida de 1,5% a 2,5%. O pelo abdominal do rato foi aparado com tesoura e posteriormente desinfetado com aplicação tópica de álcool. Foi feita uma incisão de 2–3 cm ao longo da linha abdominal mediana. Um lado do útero, junto com seus ligamentos, foi exteriorizado, e o tecido adiposo aderido à superfície uterina foi excisado. O tecido uterino foi então cuidadosamente isolado. Se o rato ainda estiver vivo após a amostragem, eutanasie-o usando asfixia por CO₂.

Coloração por hematoxilina e eosina (HE)

Os tecidos uterinos foram fixados, embutidos na parafina e seccionados com uma espessura de 5 μm. As seções foram desenceradas em xileno duas vezes por 10 minutos cada. As seções foram então reidratadas sequencialmente em etanol absoluto duas vezes por 5 minutos cada, seguidas por etanol 95%, 90%, 80% e 70% por 5 minutos cada. As seções foram enxaguadas em água ultrapura. A coloração com hematoxilina foi realizada por 5 minutos, e as seções foram enxaguadas com água até que não restasse mais o corante. As seções foram imersas em soro salino tamponado com fosfato por 5 minutos para azulamento. As seções foram então tingidas com eosina por 1 minuto e enxaguadas com água. Posteriormente, as seções foram desidratadas em etanol 95% por 10 minutos e etanol absoluto por 10 minutos, limpas em xileno por 10 minutos e montadas com resina neutra. Imagens representativas foram obtidas usando um microscópio óptico ou scanner digital de lâminas.

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)

Tecidos uterinos frescos foram enxaguados com solução salina pré-resfriada e protegida com fosfato para remover o sangue residual. Cada amostra de tecido foi pesada, cortada em pequenos pedaços e homogeneizada em soro salino pré-resfriado com fosfato tamponado, com uma proporção tecido-tampão de 1:9. O homogenado foi centrifugado a 5000 × g por 5–10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado para análise subsequente. Os níveis de IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α e PGE2 foram medidos usando kits ELISA de ratos, conforme as instruções do fabricante. Todos os reagentes e tiras de microplacas eram equilibrados à temperatura ambiente antes do uso. Padrões ou amostras (50 μL) eram adicionados aos poços designados. Anticorpo de detecção conjugado com peroxidase de raiz-forte (100 μL) foi adicionado a cada poço, exceto aos poços em branco, e a placa foi selada e incubada a 37 °C por 60 minutos. O líquido era descartado, e cada poço era lavado cinco vezes com tampão de lavagem diluído. Posteriormente, 50 μL do substrato A e 50 μL do substrato B foram adicionados a cada poço, seguidos por incubação a 37 °C no escuro por 15 minutos. A solução de parada (50 μL) era então adicionada a cada poço, e a densidade óptica era medida em 450 nm em 15 minutos. As concentrações amostrais foram calculadas a partir das curvas padrão.

PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

O RNA total foi extraído dos tecidos uterinos usando um reagente de extração total de RNA, conforme as instruções do fabricante. Brevemente, o tecido foi moído em nitrogênio líquido e 1 mL de reagente de extração de RNA foi adicionado. O lisado foi incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. Clorofórmio (200 μL) foi então adicionado, e a mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos, incubada em temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada a 12.000 × g por 12 minutos a 4 °C. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo, misturada suavemente com um volume igual de isopropanol, e incubada a −20 °C por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C, o sobrenadante foi descartado e o pellet de RNA foi lavado com etanol a 75%. A pastilha foi seca ao ar e dissolvida em água livre de RNase. A concentração e pureza do RNA foram determinadas usando um espectrofotômetro de microvolume. O DNA genômico foi removido e o cDNA foi sintetizado de acordo com as instruções do reagente de transcrição reversa. Para a remoção genômica de DNA, o RNA total foi incubado com o reagente de remoção genômica de DNA a 42 °C por 5 minutos e depois colocado no gelo. A transcrição reversa foi realizada a 50 °C por 15 minutos, seguida por 75 °C por 5 minutos para terminar a reação.

A PCR em tempo real foi realizada usando uma mistura de qPCR baseada em SYBR Green. Cada reação de 20 μL continha 2 μL de cDNA, 0,4 μL de primer direto, 0,4 μL de primer reverso, 10 μL de 2× mistura SYBR qPCR e 7,2 μL de água livre de nuclease. A qPCR foi executada usando o seguinte programa de ciclagem: 95 °C por 1 min; 40 ciclos de 95 °C por 20 s, 56 °C por 20 s e 72 °C por 38 s; seguido pela análise da curva de fusão. O GAPDH foi usado como controle interno, e a expressão relativa do mRNA foi calculada usando o método 2^−ΔΔCt . Cada amostra biológica foi medida em triplicado técnico. O valor médio de Ct dos triplicados técnicos foi usado para calcular a expressão de ΔCt e de mRNA relativa para cada réplica biológica. As sequências de espoletas são as seguintes: PPAR-γ2, 5′-CGGAAGCCCTTTGGTGACTT-3′ e 5′-CTCGATGGGCTTCACGTTCA-3′; COX-2, frente 5′-AACCAGGTGAACTTCGTCTATTAG-3′ e 5′-GGTCGTTTTTGATGTGTCACTGTA-3′; GAPDH, 5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′ e 5′-GGTGGTCCAGGGTCTCTTTACTC-3′.

Análise estatística

Os dados foram analisados usando software estatístico. Todos os dados quantitativos foram apresentados como a média ± desvio padrão. Para a análise qRT-PCR, os triplicados técnicos foram primeiro promediados para cada réplica biológica, e a análise estatística foi realizada usando os valores da réplica biológica. Comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância, seguidas por testes post hoc de Bonferroni, quando os dados atenderam às suposições de normalidade e homogeneidade da variância. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

Resultados

Triagem do ciclo estroso em ratos

Os resultados da coloração de Wright-Giemsa mostraram que as manchas vaginais no préoestro apresentavam predominantemente células epiteliais nucleadas, com uma pequena quantidade de queratinócitos. Os núcleos dessas células epiteliais pareciam levemente manchados, aumentados e apresentavam sinais de dissolução. No estro, os esfregamentos foram caracterizados por uma predominância de grandes células epiteliais ...

Discussão

DP é a dor abdominal inferior que se manifesta antes e durante a menstruação, sem qualquer dano orgânico identificável nas regiões genital ou^{pélvica 1}. De acordo com a pesquisa, aproximadamente 45%–90% das mulheres globalmente apresentam dismenorreia, com 10% a 25% sofrendo de dismenorreia^{grave 13}. Portanto, é fundamental identificar intervenções mais seguras e eficazes para a DP e elucidar melhor seus mecanismos subjacentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.9% sodium chloride solution	Heilongjiang Qiqin Animal Health Products Co., Ltd.	240314A03	Tissue rinsing and sample preparation
1× phosphate-buffered saline (PBS)	Biosharp	BL601A	Tissue rinsing, ELISA homogenization, and staining procedures
Acoustic and light stimulation system	Custom-built in animal facility	Custom-built	Combined stress stimulation during QSBSPD model construction
Adhesive microscope slides	Jiangsu Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	80312-3161	Preparation of paraffin sections and vaginal smears
Automated digital slide scanner	Guangzhou Guangying Cell Technology Co., Ltd.	GCell-60	Digital imaging of HE-stained sections
Automatic tissue dehydrator	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-TS	Tissue dehydration before paraffin embedding
Biological microscope	Nikon	E200MV	Observation of vaginal smears and stained tissue sections
CO2 gas cylinder and euthanasia chamber	Fuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Animal Center	Institutional CO2 system	Animal euthanasia
Cold plate for embedding station	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL	Paraffin embedding
Cryogenic grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	TISS-24	Tissue homogenization
Danggui (Radix Angelicae Sinensis)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A1070343	SDD ingredient; concentrated granules
DEPC-treated water	Meilunbio	MA0018	qRT-PCR reagent
Electronic acupuncture treatment instrument	Suzhou Medical Appliance Factory Co., Ltd.	SDZ-II	TEAP stimulation and electrical stimulation
Electronic analytical balance	Sartorius Balance Beijing Co., Ltd.	BS 224S	Sample and reagent weighing
Eosin	Epredia	7111	HE staining
Epinephrine hydrochloride	TargetMol	119091	QSBSPD model construction
Estradiol benzoate	Sigma-Aldrich	E8515	QSBSPD model construction
Ethanol	Xilong Scientific Co., Ltd.	240403A1	Tissue processing and dehydration
Guizhi (Ramulus Cinnamomi)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2060533	SDD ingredient; concentrated granules
Hematoxylin	Epredia	7211	HE staining
Ibuprofen suspension	Shanghai Johnson & Johnson Pharmaceutical Co., Ltd.	H20000359	Positive control drug; 20 mg/mL
Liujinu (Herba Artemisiae Anomalae)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A210A413	SDD ingredient; concentrated granules
Low-speed mini centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.	WTL-4K	Sample preparation
Micro refrigerated centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R	RNA extraction and tissue homogenate preparation
Microplate reader	Guangdong Danli Technology Co., Ltd.	K3	ELISA absorbance measurement at 450 nm
Microscope cover slips	Jiangsu Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	80340-1630	Microscopy slide preparation
Mold incubator	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	W0704	Incubation during staining or assay procedures
Moyao (Myrrh)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	1107853	SDD ingredient; concentrated granules
Neutral balsam	Meilunbio	MB9899	Mounting of stained tissue sections
NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix	Novoprotein	E047-01A	Reverse transcription
NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus	Novoprotein	E096-01B	qRT-PCR amplification
Oxytocin injection	Anhui Fengyuan Pharmaceutical Co., Ltd.	220906-4	QSBSPD model induction
Paraffin wax	Hualing	20220918	Paraffin embedding
PCR system	Bio-Rad	PTC-100	PCR-related procedures
Puhuang (Pollen Typhae)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2092143	SDD ingredient; concentrated granules; component of Shixiao San
qRT-PCR primers for PPAR-γ2, COX-2, and GAPDH	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Custom synthesis	qRT-PCR primers
Rat IL-1β ELISA kit	Meimian Biotechnology	MM-0047R2	ELISA kit
Rat IL-6 ELISA kit	Meimian Biotechnology	MM-0190R2	ELISA kit
Rat PGE2 ELISA kit	Meimian Biotechnology	MM-0068R2	ELISA kit
Rat PGF2α ELISA kit	Meimian Biotechnology	MM-0230R2	ELISA kit
Rat restraint cage	Custom-built in animal facility	Custom-built	Restraint stress during QSBSPD model construction
Rat TNF-α ELISA kit	Meimian Biotechnology	MM-0180R2	ELISA kit
Real-time PCR system	Applied Biosystems	7300	qRT-PCR analysis
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	Total RNA extraction
Rotary microtome	Thermo Fisher Scientific	HM325	Paraffin sectioning
Shijianchuan (Herba Salviae Chinensis)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A3052113	SDD ingredient; concentrated granules
Sprague–Dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2019-0010	Animal model construction
Tissue embedding cassette	Jiangsu Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	23033	Paraffin sectioning consumable
Tissue embedding machine	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL	Paraffin embedding
Tissue flotation bath and slide warmer	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-P2	Paraffin section mounting
Ultra-low temperature freezer	Zhongke Meiling Cryogenics Co., Ltd.	DW-HL340	Sample storage
Ultramicro UV-Vis spectrophotometer	Beijing BioTeke Corporation	ND5000	RNA concentration and purity measurement
Ultrapure water system	Sichuan Delishi Technology Co., Ltd.	SP-D2-V-10LS	Preparation of ultrapure water
Weilingxian (Radix et Rhizoma Clematidis Chinensis)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2030543	SDD ingredient; concentrated granules
Wright-Giemsa stain	Solarbio	G3005	Estrous cycle screening
Wulingzhi (Faeces Trogopterori)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2082223	SDD ingredient