Artigo de método

Marcagem Metabólica do Transcriptoma Nascente em Xenopus : Embriogênese Precoce

DOI:

10.3791/70591

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27 de março de 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

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Fornecemos métodos detalhados para marcar metabolicamente e purificar transcritos nascentes para análise do transcriptoma em embriões iniciais de Xenopus usando 5-etinil-uridina (5-EU).

Resumo

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A embriogênese precoce requer nova transcrição de genes zigóticos a partir do genoma zigótico inicialmente dormente após a fertilização. Um grande desafio tem sido detectar com precisão os novos transcritos e determinar seu tempo de expressão durante a ativação do genoma zigótico (ZGA). Aqui, fornecemos procedimentos detalhados para a marcação metabólica dos transcritos nascentes por 5-etinil-uridina (5-EU) em embriões iniciais de Xenopus laevis . Após a fertilização, o 5-EU é microinjetado nos embriões da fase 1-celular para marcar metabolicamente os RNAs recém-transcritos durante a ZGA. Os EU-RNAs nascentes são posteriormente purificados após biotinilação por meio de reações mediadas por química de cliques, e o transcriptoma nascente é determinado por meio de sequenciamento de próxima geração. Importante destacar que esse método possui alta sensibilidade e especificidade, permitindo a caracterização de genes pouco ativados. Assim, essa abordagem fornece uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica da transcrição gênica durante o desenvolvimento inicial, podendo ser generalizada para outros sistemas ou tecidos embrionários.

Introdução

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Após a fertilização, o embrião fica sob o controle dos fatores maternos depositados no óvulo, enquanto o genoma zigótico permanece transcricionalmente silencioso por um período; Ele é ativado para transcrever centenas a milhares de genes que são essenciais para o desenvolvimento subsequente, incluindo a especificação do destino celular e a formação da camadagerminativa 1,2,3,4,5,6. Esse fenômeno da ativação do genoma zigótico (ZGA) durante a transição materna-zigótica (MZT) é altamente conservado em todas as espécies de metazoários, embora o momento da ZGA varie entre asespécies 1, 2, 3, 4, 5, 6. Compreender como o ZGA é regulado não é apenas importante para nossa compreensão dos princípios fundamentais do desenvolvimento precoce, mas também oferece potencial para desenvolver estratégias inovadoras para diagnosticar e tratar distúrbios do desenvolvimento e aumentar a saúde reprodutiva.

Um grande desafio no estudo do ZGA tem sido detectar com precisão novos transcritos e determinar seu momento de início durante a ativação do genoma zigótico (ZGA). Devido à predominância de transcritos maternos nos embriõesiniciais 7, os altos níveis desses transcritos podem mascarar a detecção de novos transcritos durante o ZGA, especialmente para aqueles genes pouco ativados, usando RNA-seq convencional em massa. Para superar esse desafio, desenvolvemos um método para medir o transcriptoma nascente usando marcação metabólica dos transcritos nascentes com 5-etinil-uridina (5-EU), seguida pela biotinilação dos EU-RNAs nascentes via química de clique e sua purificação para sequenciamento (EU-RNA-seq)8,9,10. Em comparação com outros métodos de perfilagem de transcritos nascentes, como aqueles que utilizam 4-tiouridina (4sU)11,12, a marcação 5-EU é altamente específica via química por cliques, pode ser usada tanto para imagem quanto para sequenciamento, e não requer conversão química. Além disso, o emergente EU-RNA-seq é altamente sensível e detecta centenas de genes, cuja ativação não pode ser detectada pelo RNA-seq8 convencional em massa. Essa abordagem também nos permitiu determinar com precisão o início da ativação genética zigótica individual e perfilar os distintos padrões espaço-temporais do ZGA durante a embriogêneseinicial 8.

Aqui descrevemos os procedimentos detalhados para preparar amostras para o EU-RNA-seq para perfilar o transcriptoma nascente usando embriões precoces de Xenopus laevis como modelo. Esse protocolo é adaptado de um métodoanterior 10,13 com pequenas otimizações nos procedimentos, incluindo a microinjeção de 5-EU nos embriões do estágio 1-celular, biotinilação de EU-RNAs nascentes via reação por clique e sua purificação para sequenciamento (Figura 1). Para garantir a reprodutibilidade, dependendo dos estágios dos embriões iniciais com abundância variável de transcritos nascentes, deve ser usado de 1 a 10 μg de RNA total como entrada, embora uma quantidade menor ainda possa ser utilizada. Esse protocolo pode ser aplicado em outros sistemas embrionários, como Drosophila14 epeixe-zebra 15, e outros tecidos13. Esse método é uma ferramenta poderosa para nosso entendimento da transcrição gênica e dos mecanismos regulatórios em vários processos biológicos, incluindo a revelação de princípios inovadores da embriogênese precoce.

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Protocolo

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O trabalho com animais descrito neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Sul. A segurança laboratorial e o descarte de resíduos devem seguir as regulamentações institucionais.

1. Preparação de Reagentes e Buffers

  1. Solução de 20x MMR (Marc's Modified Ringer): misture 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 e 40 mMCaCl 2. Ajuste o pH para 7,8 com NaOH. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente.
  2. Ficoll 3% (w/v)/0,5x MMR: Adicione lentamente 1,5 g de Ficoll 400 em 50 mL de 0,5x MMR enquanto mexe suavemente com uma barra magnética até que o Ficoll fique completamente dissolvido. Autoclave e mantenha a 4 °C até o uso.
  3. Solução de estoque de 5-etinil uridina (5-EU): Para fazer a solução de 50 mM, adicione 372,8 μL de tampão (note que qualquer tampão compatível com microinjeção pode ser usado, por exemplo, 1x colher de sopa, pH 7,6) no frasco de 5 mg. Misture bem e faça alíquotas de 2 μL. Armazene a -80 °C.

2. Microinjeção de 5-EU em embriões de 1-célula

  1. Para obter embriões de Xenopus , siga protocolos padrão para realizar fertilização in vitro (FIV) (por exemplo, veja Sive et al., 2007)16. O embrião deve estar em 0,1x MMR, pronto para uso.
  2. Adicione 1 mL de Ficoll 3%/MMR 0,5x em uma câmara de microinjeção feita de uma lâmina de vidro padrão (25 mm x 75 mm). Use uma pipeta plástica de transferência para transferir 20 embriões (ou mais, se necessário) para o centro da câmara de microinjeção.
  3. Use uma pinça fina para cortar cuidadosamente a ponta muito fina da agulha de vidro e colar a agulha verticalmente (com a ponta voltada para baixo) contra a argila de modelar na parede da bancada. Use a pipeta P2 com a ponta do microcarregador para adicionar 0,5 μL de 50 mM 5-EU a partir do topo da agulha de vidro.
  4. Monte a agulha em um micromanipulador. Use a pipeta P10 para adicionar 10 μL de óleo de halocarbonetos em um micrômetro de palco e coloque sob um estereoscópio.
  5. Para calibrar o volume de injeção, primeiro use o pé para pressionar a almofada no chão ligada ao microinjetor e injete uma gota no óleo de halocarbonetos no micrômetro. Dependendo do tamanho da gotícula, ajuste a pressão e o tempo de injeção no microinjetor para determinar o volume de injeção como 10 nL, ou seja, 0,27 mm de diâmetro no micrômetro.
  6. Use uma pinça em uma mão para ajudar a segurar o embrião, use a outra mão para segurar o micromanipulador e injete 10 nL de 50 mM EU nos embriões na fase de 1-célula. A concentração final de 5-EU no embrião é de ~0,5 mM.
  7. Após a microinjeção, use uma pipeta plástica de transferência para transferir os embriões da câmara de injeção para uma nova placa de vidro contendo 3% de Ficoll/0,5x MMR. Mantenha os embriões injetados em Ficoll por ~1 hora.
  8. Remova cuidadosamente a solução de Ficoll e substitua o meio por MMR 0,1x. Mantenha os embriões em 0,1x de MMR até uso adicional. Monitore constantemente o desenvolvimento dos embriões e remova quaisquer embriões anormais, se necessário.
  9. Quando os embriões atingem os estágios desejados de desenvolvimento, utilize-se uma pipeta plástica de transferência para transferir 10 embriões em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer meio residual no tubo e congele rapidamente os embriões em nitrogênio líquido.
    Nota: Para garantir rigor e reprodutibilidade, colete apenas os embriões normais com base em sua aparência em comparação com o controle. Remova e exclua quaisquer embriões anormais da análise posterior. Se necessário, também colete o mesmo número de embriões sem microinjeção que os controles negativos.
  10. Armazene os embriões em um freezer a -80 °C até novo uso.

3. Extração e Medição de Concentração de RNA Total

NOTA: Use um kit de extração de RNA total baseado em membrana de sílica para isolar RNAs totais de embriões iniciais e um kit de quantificação de RNA de alta sensibilidade baseado em fluorescência para determinar as concentrações de RNAs. Siga as instruções fornecidas pelo kit, e os passos a seguir são levemente modificados em relação ao manual. Todas as soluções e reagentes usados nas etapas seguintes devem ser livres de RNase.

  1. Coloque as amostras do freezer a -80 °C no gelo.
  2. Adicione 700 μL do Buffer RLT do kit de extração de RNA em cada tubo. Use uma pipeta P1000 para subir e descer por pelo menos 15 vezes ou até que todos os embriões estejam dissolvidos.
  3. Deixe as amostras no gelo por 20 minutos. Misture suavemente novamente, pipeteando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para homogeneizar completamente os embriões.
  4. Adicione 700 μL de etanol a 70% aos embriões homogeneizados. Pipete para cima e para baixo para misturar bem e transfira os 700 μL da mistura para uma coluna de spin.
  5. Centrifuge a coluna a 10.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo contínuo. Repita a centrífuga até que o restante da mistura esteja completo.
  6. Adicione 350 μL do Buffer RW1 e centrifuge a coluna a 10.000 x g por 1 min. Descarte o flowthrough.
  7. Adicione cuidadosamente 80 μL de DNase I ao centro da membrana na coluna. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente.
  8. Adicione 350 μL de Buffer RW1 e centrifuge a coluna a 10.000 x g por 1 minuto. Descarte o flowthrough.
  9. Adicione 500 μL de RPE tampão e centrifuge a coluna a 10.000 x g por 1 min. Descarte o flowthrough. Repita a lavagem mais uma vez.
  10. Seque a coluna centrifugando-a novamente a 10.000 x g por 2 minutos.
  11. Transfira a coluna para um novo tubo livre de RNase. Adicione cuidadosamente 35 μL deH2Olivre de RNase ao centro da membrana na coluna.
  12. Centrifuge a coluna a 10.000 x g por 1 min. Colete o RNA eluído e mantenha no gelo.
  13. Para medir a concentração de RNA, prepare-se primeiro a solução de trabalho usando o kit de quantificação de RNA, diluindo o reagente de RNA (corante) a 1:200 no buffer de RNA. Calcule o volume total da solução de trabalho dependendo do número total de padrões e prepare 200 μL para cada padrão ou amostra.
  14. Monte uma tira de 8 tubos de 0,2 mL. Para diluir cada padrão, adicione 10 μL a 190 μL da solução de trabalho. Para diluir cada amostra, adicione 1 μL a 199 μL da solução de trabalho. Misture bem.
  15. Coloque a tira de 8 tubos em um fluorômetro. Selecione o ensaio de RNA, calibre com os padrões e leia as concentrações das amostras.

4. Biotinilação e Purificação de ARN Emergente do EU-RNA

NOTA: Um kit de captura de RNA nascente baseado em química de clique é usado para biotinilar e puxar para baixo os EU-RNAs nascentes. Siga as instruções fornecidas pelo kit e os passos a seguir são levemente modificados. RNAs de embriões não injetados, assim como EU-RNAs sem biotinilação, podem servir como controles de fundo para a especificidade de pulldown.

  1. Biotinilação e Limpeza de RNA
    1. Para cada amostra, misture os seguintes componentes em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL para realizar uma reação de clique de 50 μL: RNA total (1–10 μg), 1x tampão EU, 2 mM CuSO4, 0,25 mM biotida azida, 10 mM aditivo 1 e 12 mM aditivo 2.
    2. Incube a mistura de reação em temperatura ambiente por 30 minutos em um nutator.
    3. Em cada reação acima, adicione 1 μL de glicogênio, 50 μL de acetato de amônio 7,5 M e 700 μL de etanol 100% resfriado. Pipete para cima e para baixo 5 vezes para misturar bem.
    4. Coloque o tubo em um freezer a -80 °C e guarde durante a noite.
    5. Centrifuge o tubo a 13.000 x g por 20 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola.
    6. Adicione 700 μL de etanol a 75% e misture delicadamente para resuspender o pellet. Centrifuge o tubo a 13.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola. Repita a lavagem mais uma vez.
    7. Seque o pellet ao ar livre por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em 10 μL de H2O livre de RNase.
  2. Purificação de ARNs EUA
    1. Para retirar os EU-RNAs nascentes, para cada amostra, dispense 5 μL de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Adicione 9 μL de Wash Buffer 2. Misture bem e coloque o tubo em um suporte magnético. Deixe agir por 2 minutos. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem mais duas vezes. Resuspenda as esferas em 5 μL de Wash Buffer 2.
    3. Prepare a seguinte mistura mestra em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (15 μL para cada amostra): 12,5 μL de tampão de ligação a RNA (Componente G), 0,2 μL de RNase OUT diluída 1:10 e 2,3 μL de H2O livre de RNase. Adicione 15 μL da mistura a cada tubo contendo a amostra de RNA.
    4. Incube por 5 minutos em um bloco térmico a 69 °C. Coloque o tubo no gelo.
    5. Adicione 5 μL das esferas pré-lavadas acima em cada tubo contendo a amostra de RNA. Incube por 30 minutos em um nutator em temperatura ambiente.
    6. Adicione 50 μL de Wash Buffer 1. Misture bem e coloque o tubo em um suporte magnético. Deixe agir por 2 minutos. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem mais 4 vezes.
      Nota: O sobrenadante após a primeira lavagem, que presumivelmente contém apenas os transcritos maternos, pode ser coletado para medir o transcriptoma materno.
    7. Adicione 50 μL de Wash Buffer 2. Misture bem e coloque o tubo em um suporte magnético. Deixe agir por 2 minutos. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem mais 4 vezes.
    8. Resuspenda as esferas em 5 μL de Wash Buffer 2. As contas, que contêm os ARNs EU-emergentes, estão prontas para síntese direta de cDNA e preparação de bibliotecas.
      Nota: Antes de prosseguir para a preparação da biblioteca, o enriquecimento de transcritos nascentes pode ser avaliado medindo a expressão de genes individuais conhecidos usando reação em cadeia transcrição-polimerase reversa (RT-PCR).

5. Preparação e Sequenciamento de Bibliotecas de RNA

  1. Use kits comercialmente disponíveis para preparar as bibliotecas de cDNA e siga as instruções fornecidas pelo kit. Use o NEBNext Library Quant Kit para Illumina para quantificar as bibliotecas e agrupá-las.
  2. Agrupe as bibliotecas seguindo as instruções dos kits de sequenciamento de próxima geração comumente usados. Dilua as bibliotecas para ~1,8 pM antes de carregá-las no sequenciador de bancada para alcançar uma densidade ótima de cluster de ~200k/mm2 durante o sequenciamento. Sequencie as bibliotecas usando o sequenciamento de próxima geração comumente usado. Utilizou sequenciamento de extremidade pareada de 75 bp para ~20 milhões de leituras por amostra.
  3. Quantifique as leituras transcriptômicas alinhando as sequências à construção do genoma 9.2 do Xenopus laevis usando salmon17 e realize análise diferencial de expressão gênica usando DESeq218. Para visualizar os picos no navegador genômico, mapeie as sequências para o genoma usando o STAR19 e exiba no Visualizador de Genômica Integrativa (IGV)19.

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Resultados

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Embriões de Xenopus laevis (quatro réplicas biológicas) nos estágios de 5 a 9 horas após a fertilização (hpf) a 22 °C, que cobrem os estágios do Estágio 5 (com pouca ZGA em grande escala) ao Estágio 9 (com ZGA alto), foram processados seguindo o protocolo acimade 8. Os RNAs totais, os EU-RNAs nascentes purificados e os RNAs de fluxo contínuo foram usados para preparar as bibliotecas e foram sequenciados. Como mostrado na Figura 2

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Discussão

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Aqui fornecemos um protocolo detalhado para a marcação metabólica do transcriptoma nascente no início da embriogênese, incluindo a microinjeção do 5-EU em embriões unicelulares, extração total de RNAs e medição de suas concentrações, além da biotinilação e purificação dos EU-RNAs nascentes para preparação e sequenciamento da biblioteca (EU-RNA-Seq) (Figura 1). Devido à alta sensibilidade e especificidade da abordagem em comparação com o RNA-seq total, esse p...

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Divulgações

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O autor declara não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos ao laboratório Matthew Good da Universidade da Pensilvânia por fornecer o treinamento. Esse trabalho foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (R03HD105802).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
& micro; Microinjetor PUPMInstrumentos de Precisão MundialUPUMPPara microinjeção (microinjeção com pressão)
5-etinila uridinaThermo Fisher ScientificE10345Para microinjeção (marcação de traqnscripts nascentes)
Estereoscópios Zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Para microinjeção (visualização de embriões)
Acetato de amônioSigma-AldrichA2706Para precipitação de RNA
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA7506Para reação de clique
Capilares de Vidro BorosilicatoInstrumentos de Precisão MundialTW100-4Para microinjeção (fabricação de agulhas de vidro)
CentrífugaEppendorf5425RPara centrífuga
Kit de Captura de RNA Nascente Click-iTThermo Fisher ScientificC10365Para biotinilar e purificar RNA nascente
CuSO4Sigma-Aldrich61230Para reação de clique
DNase IRoche Diagnostics4716728001Para extração de RNA
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Para microinjeção (incubação de embriões)
Placa de Petri de vidro (60 mm)VWR75845-542Para fertilização
GlicogênioThermo Fisher ScientificAM9510Para precipitação de RNA
Óleo de Halocarbono 27Sigma-AldrichH8773Para microinjeção (calibração do volume de injeção)
L-cisteínaSigma-Aldrich168149Para embriões em desejolando
Pontas de microcarregadorCalibre ScientificEPE-5242956003Para microinjeção (carregando 5-EU na agulha de vidro)
NEBNext Library Quant Kit para IlluminaNEBE7630Para quantificação de bibliotecas
NSQ 500/550 Alta Saída KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Para sequenciamento
Fluorômetro Qubi FlexThermo Fisher ScientificP33327Para medir a concentração de RNA
Kit de Ligação de RNA HS de QubitThermo Fisher ScientificP32852Para medir a concentração de RNA
RNeasy Mini KitQiagen74104Para extração de RNA
Micrometro de estágioCiência de Ward470175-914Para microinjeção (calibração do volume de injeção)
RNA-seq universal com NuQuantNuGEN0364Para preparação da biblioteca

Referências

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