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Artigo de método

Visualizando a Ativação do Genoma Zigótico em Células Individuais de Embriões Iniciais

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DOI:

10.3791/70592

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3 de abril de 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

Descrevemos métodos para visualizar a transcrição nascente durante a ativação do genoma zigótico em células individuais no início da embriogênese.

Resumo

A embriogênese precoce requer a transição materno-zigótico (MZT) que requer a ativação do genoma zigótico (ZGA). Durante a ZGA, centenas a milhares de genes são transcritos, o que é essencial para vários processos no desenvolvimento inicial do embrião, incluindo a manutenção da sobrevivência embrionária, especificação do destino celular e formação da camada germinativa. Um dos principais desafios no estudo do ZGA foi visualizar diretamente o ZGA em células individuais de embriões iniciais. Aqui, descrevemos um método para visualizar diretamente a ZGA em células individuais de embriões iniciais por meio da marcação metabólica de transcritos nascentes usando uridina 5-etinil (5-EU), seguido pela conjugação dos ARNs EUs nascentes com fluoróforos via química de clique e visualização deles em embriões de montagem inteira por microscopia confocal, usando Xenopus laevis como modelo. Esse método nos permitiu rastrear o ZGA unicelular em embriões de montagem completa e revelar o início heterogêneo do ZGA no espaço e no tempo durante o início da embriogênese. Pode ser usado em outros sistemas ou tecidos embrionários para estudar a transcrição gênica e a regulação genômica em nível de célula única.

Introdução

Durante o desenvolvimento inicial, o embrião passa pela transição materna para zigótica (MZT), que gradualmente muda o controle do desenvolvimento dos fatores maternos para os genes zigóticos. O MZT requer a ativação do genoma zigótico inicialmente dormente, um processo chamado ativação do genoma zigótico (ZGA); os genes expressos durante o ZGA são necessários para especificação precoce do destino celular, gastrulação e formaçãodo eixo 1,2. Importante ressaltar que o ZGA é conservado em todos os metazoários, e o tempo do ZGA é rigidamente controlado, embora varie entre as espécies 3,4. A desregulação da ZGA pode levar a consequências graves, que vão desde defeitos do desenvolvimento até morte embrionária, como aborto espontâneo. Portanto, estudar os mecanismos da ZGA não é apenas importante para entender os fundamentos da regulação gênica, mas também tem implicações clínicas significativas.

Um grande desafio no estudo do ZGA tem sido visualizar diretamente o ZGA em grande escala em embriões iniciais e investigar seus mecanismos no nível de célula única. Superamos esse desafio desenvolvendo um método que utiliza marcação metabólica de transcritos nascentes durante a ZGA com 5-etinil uridina (5-EU), seguida pela conjugação dos EU-RNAs nascentes com fluoróforos via química de clique e visualização em embriões de montagem inteira por microscopia confocal, usando Xenopus laevis como modelo. O grande embrião de Xenopus (~1,2 mm de diâmetro) contém um gradiente de tamanho celular, e o ZGA em grande escala ocorre ao redor dos estágios médios da blastula (com início por volta do estágio 7 e pico por volta do estágio 9), tornando-o um modelo ideal para estudar padrões do ZGA5. Ao usar a marcação 5-EU em embriões iniciais de Xenopus, conseguimos visualizar e quantificar diretamente o ZGA em grande escala em células individuais de embriões precoces inteiros, o que nos levou a descobrir um novo padrão espaço-temporal de ZGA regulado principalmente pelo tamanho celular 5,6.

Aqui descrevemos os detalhes dessa abordagem, adaptada de trabalhos anteriores com otimizações 5,7, incluindo fixação de embriões após marcação metabólica de transcritos nascentes com 5-EU, conjugação de EU-RNAs nascentes com um fluoróforo via reaçãode clique 8, e imunocoloração para marcadores subcelulares, seguida da liberação dos embriões para imagem confocal. Esse método pode ser aplicado a outros sistemas embrionários, incluindo peixe-zebra 9,10, ou usado em sequenciamento para perfilar o transcriptomanascente 11, apoiando sua aplicação geral e ampla em vários tipos de amostras e análises. No geral, esse método oferece um novo e importante meio de estudar mecanismos reguladores do genoma em células individuais.

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Protocolo

O trabalho com animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Sul.

1. Preparação antes de iniciar o protocolo

NOTA: Antes de iniciar o protocolo, prepare as seguintes soluções usando água livre de RNase.

  1. Prepare 1× soro com Tris-buffer (TBS), pH 7,6: 50 mM Tris-HCl e 150 mM NaCl. Ajuste o pH para 7,6. Armazene em temperatura ambiente. Use o buffer em até dois meses.
  2. Prepare 1× soro com Tris-Buffer com Tween 20 (TBST), pH 7,6: adicione Triton X-100 em concentração final de 0,1% (vol/vol) a 1× de sopa (pH 7,6) preparado com água livre de RNase. Armazene em temperatura ambiente. Use o buffer dentro de um mês.
  3. Prepare 4% de paraformaldeído (PFA)/1× MEM: misture 1 frasco (10 mL) de estoque de 16% de PFA e 4 mL de 10× de MEM (1000 mM 3- (N-morfolino)ácido propanosulfônico [MOPS] pH 7,4, 20 mM de EGTA e 10 mM deMgSO 4). Adicione água sem RNase a 40 mL. Aliquota e armazene a -20 °C. Use a solução em até 6 meses.
  4. Prepare metanol 70%, 50% e 25% em 0,5× SSC: misture metanol e 0,5× SSC em 3:1, 1:1 e 1:3, respectivamente. Use a solução em até seis meses.
  5. Prepare a solução de branqueamento: Misture para atingir uma concentração final de 2% (vol/vol)H2O2, 5% (vol/vol) formamida e 0,5× SSC em água livre de RNase. Prepare essa solução de forma fresca antes do uso.
  6. Prepare a solução bloqueante: Adicione uma concentração final de 10% (volume/volume) soro de cabra e 0,2% (peso por volume) de BSA em 1× TBST. Armazene a -20 °C. Use a solução em até 6 meses.
  7. Prepare o reagente de limpeza BABB: Misture 1 parte de álcool benzílico (BA) e 2 partes de benzoato benzílico (BB). Armazene em temperatura ambiente. Use a solução em até 6 meses.

2. Fixação dos embriões microinjetados com 5-EU

  1. Para microinjetar 5-etinil-uridina (5-EU) em embriões de 1-célula, siga os procedimentos descritosanteriormente 11. Deixe os embriões se desenvolverem até os estágios desejados de ZGA, por exemplo, o Estágio 9, quando o ZGA está ocorrendo ativamente na maioria das células do embrião.
  2. Para fixar os embriões microinjetados com 5-EU, adicione primeiro cerca de 1,8 mL de PFA/1× MEM a 4% em um frasco de vidro cintilante de 2 mL. Depois, use uma pipeta plástica de transferência para transferir ~20 embriões para o frasco de vidro. Minimize a quantidade de meio de cultura adicionada ao frasco de vidro.
  3. Encha o frasco de vidro até o topo com um adicional de 4% de PFA/1× MEM. Feche o frasco com a tamponha; Nenhuma bolha de ar deve ficar para o local.
  4. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire o embrião em baixa velocidade (por exemplo, 10 rpm) por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente.
  5. Use uma pipeta para remover cuidadosamente o fixador. Encha o frasco de vidro com 100% de metanol. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 5 minutos.
  6. Remova cuidadosamente o metanol e adicione metanol novo. Repita a rotação e a desidratação pelo menos duas vezes para que os embriões fiquem completamente desidratados.
  7. Armazene os embriões em metanol a -20 °C.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Deixe os embriões permanecerem no metanol por pelo menos 2 dias antes de prosseguir com os seguintes passos. Os embriões podem ser usados em até 2 meses.

3. Conjugação de RNAs nascentes com um fluoróforo por meio de reação por clique

  1. Para reidratar os embriões, primeiro remova o metanol do frasco de vidro, depois adicione 2 mL de metanol 75% em 0,5× SSC e feche o frasco com a tampo. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 5 minutos.
  2. Remova o líquido do frasco de vidro após a rotação. Repita o passo acima sequencialmente usando 50% de metanol em 0,5× SSC, 25% de metanol em 0,5× SSC e 0,5× SSC. Para reidratar completamente os embriões, repita a lavagem final com 0,5× SSC pelo menos duas vezes.
  3. Adicione 2 mL de solução de branqueamento recém-preparada (2% deH2O2 e 5% de formamida em 0,5× SSC) ao frasco de vidro. Coloque o frasco de vidro sobre um pedaço de papel alumínio e depois coloque-o sob uma luz LED a uma distância que não superaqueça as amostras.
  4. Descolora os embriões sob a luz até que todos os pigmentos fiquem brancos, o que normalmente leva de 5 a 6 horas. Note que, devido à degradação deH2O2 emO2, ela gera pequenas bolhas de ar que podem fazer os embriões flutuarem. Verifique os embriões periodicamente (por exemplo, a cada 30 minutos) e gire suavemente o frasco de vidro para que os embriões fiquem na solução branqueante.
  5. Remova cuidadosamente o buffer de branqueamento. Adicione 2 mL de 0,5× SSC para enxaguar rapidamente os embriões. Repita o enxágue rápido mais uma vez, se necessário.
  6. Adicione 2 mL de 1× TBST no frasco de vidro. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 1 hora. Remova o líquido do frasco de vidro após a rotação.
  7. Repita o passo acima pelo menos 5 vezes. Note que a lavagem completa dos embriões é fundamental para as etapas seguintes.
  8. Adicione 2 mL de 1× colheres de sopa no frasco de vidro. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 5 minutos. Remova o líquido do frasco de vidro após a rotação.
  9. Repita o passo acima mais uma vez.
  10. Prepare a mistura para a reação de clique em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionando os seguintes reagentes para atingir concentrações finais de 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de CuSO4, 25 μM tetrametilrodamina (TAMRA)-azida e 100 mM de ácido ascórbico. Adicione ácido ascórbico por último à reação. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.
  11. Adicione uma mistura de reação de 200 μL aos embriões no frasco de vidro. Certifique-se de que o volume da mistura de reação seja suficiente para submergir todos os embriões no frasco. Incube por 12 horas em temperatura ambiente, no escuro.
  12. Remova cuidadosamente a mistura de reação de clique. Note que é possível observar fluorescência inespecífica nos embriões. Enxágue rapidamente os embriões duas vezes com 1× TBST, depois lave-os com 1× TBST por pelo menos 5 vezes, trocando a solução a cada 1 hora, conforme descrito acima.
  13. Continue lavando os embriões trocando 1× TBST a cada 2 horas e deixe-os durante a noite a 4 °C em um rotador. Pare de lavar quando a fluorescência não específica for quase imperceptível. Note que, como os resíduos da reação de clique podem ser prejudiciais à imunocoloração posterior, certifique-se de que os embriões sejam cuidadosamente lavados por 1–2 dias antes de prosseguir para as próximas etapas.

4. Imunocoloração de embriões com marcadores subcelulares (opcional)

  1. Para bloquear os embriões, remova o 1× TBST do frasco de vidro na etapa final de lavagem acima e adicione 200 μL da solução bloqueante (10% soro de cabra/0,2% BSA/1× TBST). Embrulhe o frasco de vidro com um pedaço de papel alumínio para proteger os embriões da luz. Coloque o frasco de vidro sobre um nutator e agite suavemente os embriões por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 °C).
  2. Dilua o anticorpo primário (por exemplo, anticorpo anti-H3) a 1:1.000 em 200 μL de soro de cabra 10% / 1× TBST. Adicione o anticorpo diluído ao frasco de vidro e envolva o frasco com um pedaço de papel alumínio. Incube os embriões durante a noite a 4 °C em um nutator em baixa velocidade.
  3. Remova cuidadosamente o anticorpo do frasco de vidro. Enxágue rapidamente os embriões duas vezes, adicionando 2 mL de 1× TBST no frasco de vidro e removendo-o.
  4. Adicione 2 mL de 1× TBST ao frasco de vidro, depois envolva com um pedaço de papel alumínio. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 1 hora. Remova o líquido do frasco de vidro após a rotação.
  5. Repita o passo acima pelo menos 5 vezes.
  6. Dilua o anticorpo secundário (por exemplo, anticorpo do coelho Alex Fluor 488) em 1:1.000 em 200 μL de soro de cabra 10% / 1× TBST. Se for necessário colorir por DNA, dilua o corante de DNA (por exemplo, TO-PRO-3) junto com o anticorpo secundário.
  7. Adicione o anticorpo diluído ao frasco de vidro e envolva com papel alumínio. Incube os embriões durante a noite a 4 °C em um nutator em baixa velocidade.
  8. Remova cuidadosamente o anticorpo do frasco de vidro. Enxágue rapidamente os embriões duas vezes, adicionando 2 mL de 1× TBST no frasco de vidro e removendo-o.
  9. Adicione 2 mL de 1× TBST ao frasco de vidro, depois envolva com um pedaço de papel alumínio. Coloque o frasco de vidro em um rotador e gire os embriões em baixa velocidade por 1 hora.
  10. Repita o passo acima pelo menos 5 vezes.

5. Limpeza de embriões antes da imagem confocal

  1. Para desidratar os embriões, remova cuidadosamente o tampão do frasco de vidro após a lavagem final e adicione 2 mL de metanol 100%. Envolva o frasco de vidro em papel alumínio, coloque-o em um rotador e deixe os embriões girarem em baixa velocidade por 5 minutos. Remova o líquido do frasco de vidro após a rotação.
  2. Repita o passo acima pelo menos 5 vezes.
  3. Para desidratar completamente os embriões, repita a etapa acima pelo menos 5 vezes usando 2 mL de metanol 100% anidro.
  4. Remova cuidadosamente o máximo de metanol possível do frasco de vidro.
  5. Use uma pipeta de vidro para adicionar lentamente 500 μL do reagente de limpeza BABB no frasco de vidro. Os embriões vão flutuar no BABB e esperar 10 minutos até que todos estejam no fundo do frasco de vidro. Note que os embriões ficarão quase invisíveis, e remova cuidadosamente o BABB sem danificá-los.
  6. Repita o passo acima pelo menos mais 2 vezes, ou até que nenhuma linha de schlieren seja visível. Para eliminar completamente os embriões, mantenha-os em BABB por 1 a 2 dias antes da imagem.
  7. Faça câmaras de imagem cortando um pequeno quadrado (por exemplo, ~5 mm × 5 mm) da fita VHB com espessura de ~ 1,1-1,2 mm (semelhante ao tamanho do embrião) e tamanho de ~10 mm × 10 mm, seguido de sua colagem em um vidro de cobertura de 24 mm × 40 mm.
  8. Transfira cuidadosamente os embriões limpos para a câmara e depois cubra-os com outro copo de cobertura. Os embriões ficarão dentro do sanduíche de copos de cobertura para que ambos os lados possam ser fotografados.
  9. Realize imagens sob microscópio confocal.

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Resultados

Embriões de Xenopus laevis no estágio 1-celular foram microinjetados com 5-EU, e embriões no estágio 9 foram fixados quando o ZGA em grande escala ocorreu em todo o embrião. Os embriões foram processados seguindo o protocolo descrito acima. RNAs nascentes em embriões foram marcados com TAMRA-azida por reação de clique, a histona H3 foi marcada usando anticorpos anti-histonas H3, e o DNA foi marcado com TO-PRO-3. Os embriões foram analisados sob o microscópio confocal usando o ob...

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Discussão

ZGA representa uma das transições mais críticas durante os estágios iniciais do desenvolvimentoembrionário 2,3. Aqui descrevemos procedimentos detalhados para preparar amostras para visualizar diretamente o ZGA em embriões de Xenopus precoce de montagem inteira, incluindo fixação de embriões microinjetados com 5-EU, conjugação de RNAs nascentes com um fluoróforo via reação por clique, imunocoloração de marcadores subcelu...

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Divulgações

O autor declara não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao laboratório Matthew Good da Universidade da Pensilvânia pelo treinamento. Esse trabalho foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (R03HD105802).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
16% Paraformaldeído (PFA)EMS15710-SPara fazer a solução fixativa
20 e vezes; SSCMediatechMT46-020-CMPara fazer a solução de branqueamento
Misturador nutador 3DVWR76595-802Para nutação de embriões
Frascos rosqueados de 9 mm (2 mL)VWR46610-722Para processamento de embriões
Anticorpo anti-Histona H3Abcamab1791Para imunocoloração
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA7506Para fazer a reação de clique
Álcool benzílicoSigma-Aldrich305197Para limpar embriões
Benzoato de benzo-benzo-mecanaACROS Organics105860010Para limpar embriões
Albumina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059Para fazer a solução de bloqueio
Tampas para frascos rosqueados de 9 mm (2 mL)VWR46610-712Para processamento de embriões
Vidro coberto (24 mm e vezes 40 mm)VWR48393-060Para fabricar câmara de imagem
CuSO4Sigma-Aldrich61230Para fazer a reação de clique
Etilenebídeo (oxietilennitrilo)ácido tetraacético (EGTA)Thermo Fisher ScientificAC409915000Para fazer a solução fixativa
Fiji ImageJNIHPara processamento de imagem
FormamidaThermo Fisher ScientificAC181090010Para fazer a solução de branqueamento
Pipetas Pasteur de vidroVWR14673-010Para transferir o BABB
Anticorpo secundário anti-coelho Alex Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27034Para imunocoloração
Soro de cabraAbcamab7481Para fazer a solução de bloqueio
Peróxido de hidrogênioSigma-AldrichH1009Para fazer a solução de branqueamento
Sulfato de magnésio (MgSO4)Thermo Fisher ScientificM65-500Para fazer a solução fixativa
MetanolThermo Fisher ScientificA4524Para desidratar embriões
Metanol, anidroSigma-Aldrich322415Para desidratar embriões
MOPSThermo Fisher ScientificAC172631000Para fazer a solução fixativa
Misturador nutador multimodoVWR76595-812Para nutação de embriões
Pipeta de transferência plásticaThermo Fisher Scientific13-711-9AMPara transferir embriões
Lâmina de barbearThermo Fisher Scientific18-100-970Para cortar fitas
Água livre de RNaseThermo Fisher ScientificBP561-1Para criar soluções livres de Rnase
Roto-Mini PLUS (rotador)VWR470313-912Para roar embriões
Tetrametilrodamina (TAMRA)-azidaAbcamab146486Para fazer a reação de clique
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Para coloração de DNA
Triton X-100Sigma-Aldrich10789704001Para fazer o buffer de lavagem
Base Trizma (Base Tris)Sigma-AldrichT1503Para fazer o tampão Tris
Fitas VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)VWR76524-608Para fabricar câmara de imagem
Microscópio confocal Zeiss LSM 700ZeissPara imagem confocal

Referências

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  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
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  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

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