Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

Resumo

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura em HNM usando tBHP, protocolos padronizados para análise de marcadores-chave de senescência, incluindo paragem do crescimento, atividade SA-β-galactosidase e fatores SASP.

Resumo

Fatores de estresse ambiental, incluindo radiação UV, poluição do ar ou fumaça de cigarro, impulsionam o envelhecimento extrínseco da pele. A exposição a esses fatores extrínsecos de envelhecimento promove o acúmulo de células senescentes, o que contribui para a formação de rugas e distúrbios de pigmentação. Os melanócitos, que fornecem proteção UV primária, apresentam atividade reduzida com a idade. Melanócitos senescentes se acumulam na pele envelhecida e contribuem para sua aparência de envelhecimento; No entanto, existem poucos modelos para estudar a senescência dos melanócitos, e este trabalho visa desenvolver um modelo reprodutível para pesquisas futuras. Neste estudo, apresentamos um modelo de senescência de melanócitos neonatais humanos (HNM) usando tert-butil hidroperóxido (tBHP), um indutor de estresse oxidativo bem caracterizado. O tBHP interrompe a homeostase redox ao esgotar as defesas antioxidantes celulares e promover a superprodução de radicais, resultando em danos ao DNA e à proteína. Caracterizamos o fenótipo de senescência dos melanócitos tratados com tBHP por meio da análise de marcadores de senescência estabelecidos, incluindo potencial de crescimento restrito, mudanças morfológicas e atividade SA-β-Galactosidase. Esse modelo oferece uma ferramenta valiosa para investigar a senescência prematura induzida por estresse em melanócitos, oferecendo insights sobre seu papel no envelhecimento extrínseco da pele e nos distúrbios de pigmentação.

Introdução

O envelhecimento da pele é composto por dois fatores distintos: envelhecimento intrínseco e externo ^1,2. O envelhecimento intrínseco é causado por processos cronológicos naturais e fatores genéticos, enquanto o envelhecimento extrínseco resulta da exposição cumulativa a fatores de estresse ambiental, principalmente radiação ultravioleta, mas também poluição do ar, fumaça de cigarro e agentes químicos, que aceleram o processo de envelhecimento além das taxas cronológicas^{normais 3,4}. Exposições ambientais geram estresse oxidativo que sobrecarga as defesas antioxidantes celulares, resultando em danos ao DNA, oxidação de proteínas e peroxidação lipídica. Essas alterações moleculares desencadeiam respostas persistentes de dano ao DNA e disfunção celular, promovendo, em última análise, a senescência^{prematura 5,6}. Essa senescência induzida pelo estresse contribui para as características clínicas da pele envelhecida, incluindo rugas, pigmentação irregular, redução da elasticidade e função da barreira^{comprometida.}

Os melanócitos residem na epiderme basal e servem como a principal defesa da pele contra danos induzidos por UV, sintetizando melanina e transferindo-a para os queratinócitos ao redor. Paradoxalmente, esse papel protetor os torna particularmente vulneráveis ao estresse oxidativo e à senescência prematura durante o envelhecimento externo ^8,9. O próprio processo de melanogênese gera espécies reativas substanciais de oxigênio como subprodutos das reações tirosinas-catalizadas, criando uma carga oxidativa inerente que é ainda mais amplificada por exposições ambientais como radiação UV e^{poluição 10,11}. Como resultado, o estresse ambiental crônico pode induzir danos oxidativos, disfunção mitocondrial e, por fim, senescência^{celular 12}. Apesar de sua importância, permanecem questões-chave sobre as vias moleculares que regem a senescência dos melanócitos e como o estresse oxidativo inicia esse processo. Além disso, a influência dos melanócitos senescentes no microambiente cutâneo ao redor como motor das alterações cutâneas relacionadas à idade, especialmente por meio da liberação de fatores SASP, permanece insuficientemente^{compreendida 13,14}.

Embora os melanócitos sejam particularmente suscetíveis à senescência induzida por estresse oxidativo, modelos experimentais para estudar esse processo permanecem^{limitados 15,16}. A maioria das pesquisas sobre senescência continua a se basear em modelos de senescência replicativos ou induzidos por estresse em fibroblastos, mas essas abordagens não capturam a biologia distinta dos melanócitos nem seu potencial de influenciar o envelhecimento da pele por meio de intercomunicação com células vizinhas e seu próprio perfil SASP¹⁷. Essa lacuna destaca a necessidade de modelos de senescência específicos para melanócitos que reflitam com mais precisão suas respostas fisiológicas aos estressores^{ambientais 18,19} e sua contribuição para o envelhecimento da pele humana.

Apesar da disponibilidade de abordagens de senescência induzida por estresse, sua implementação em melanócitos humanos primários continua sendo tecnicamente desafiadora e frequentemente associada a uma variabilidade substancial. Melanócitos são particularmente sensíveis ao estresse oxidativo, resultando em uma janela experimental estreita entre indução eficaz da senescência e citotoxicidade excessiva. Além disso, diferenças dependentes do doador nas preparações celulares primárias contribuem ainda mais para desfechos inconsistentes entre os estudos. Esses desafios são frequentemente subnotificados, e os protocolos muitas vezes são insuficientemente padronizados, limitando a reprodutibilidade. O protocolo atual preenche essa lacuna fornecendo um regime de tratamento otimizado e reprodutível, esquema de dosagem definido e leituras padronizadas para indução e avaliação confiáveis da senescência em melanócitos humanos primários.

O tert-butilo hidroperóxido (tBHP) é um indutor bem caracterizado do estresse oxidativo que promove a senescência ao gerar espécies reativas de oxigênio e esgotar as defesas antioxidantes celulares. Tem sido amplamente utilizado para induzir senescência em fibroblastos dérmicos, onde desencadeia marcadores de senescência enquanto mantém a viabilidade celular^20,21. Como o tBHP produz estresse oxidativo sustentado por meio de vias bioquímicas definidas, ele oferece um sistema reproduzível e acessível para estudar a senescência induzida por estresse oxidativo e investigar os mecanismos moleculares que ligam o dano oxidativo aos processos^{de envelhecimento 22,23}. Em contraste com modelos baseados em UV, a tBHP é particularmente vantajosa quando é necessária uma indução controlada e reprodutível do estresse oxidativo, independente dos parâmetros de irradiação e sem a necessidade de equipamentos especializados.

O HNM fornece um modelo relevante para estudar os mecanismos extrínsecos^{de envelhecimento 24}. Como células primárias derivadas do prepúcio, elas mantêm intactas vias de resposta ao estresse e evitam artefatos associados à modificação genética ou^{imortalização 25}. Melanócitos neonatais fornecem um modelo experimental ideal, pois apresentam danos basais mínimos, permitindo uma avaliação clara das vias de senescência induzidas por fatores de estresse^{ambiental 26,27}.

Este estudo emprega estresse oxidativo induzido por tBHP em melanócitos neonatais humanos primários, superando limitações de modelos celulares não melanocíticos e imortalizados comumente usados em pesquisas de senescência. Ele fornece uma plataforma padronizada para examinar mecanismos específicos de senescência de melanócitos e caracterizar o fenótipo senescente com marcadores estabelecidos. No geral, esse protocolo fornece um modelo reproduzível e fisiologicamente relevante para estudar a senescência induzida por estresse oxidativo em melanócitos.

Protocolo

Esse protocolo foi otimizado para pesquisas em melanócitos neonatais humanos primários (HNM) para estudar os mecanismos da senescência prematura induzida por estresse pelo tBHP (Figura 1). Os melanócitos foram derivados do prepúcio caucasiano neonatal (fototipo de pigmentação clara) e obtidos de uma fonte comercial. De acordo com a documentação do fornecedor, tecidos humanos são coletados de doadores plenamente informados e que forneceram consentimento, em conformidade com os marcos éticos e legais estabelecidos, incluindo a Declaração de Helsinque e as regulamentações aplicáveis de proteção de dados. As células foram fornecidas em forma desidentificada. Não foi necessária aprovação ética adicional para seu uso neste estudo. Todos os experimentos foram realizados usando a mesma linhagem de melanócitos para garantir consistência. Note que, ao usar diferentes linhas celulares primárias, as condições da cultura, assim como as concentrações e procedimentos de manuseio, podem precisar ser ajustados ainda mais.

1. Preparativos

NOTA: Para iniciar o tratamento com tBHP, os melanócitos devem ser descongelados com pelo menos três dias de antecedência para permitir recuperação e confluência suficientes. A fase de tratamento dura 4 dias, com o dia de semeadura designado como Dia 0. Detalhes de todos os materiais utilizados neste estudo estão disponíveis na Tabela de Materiais.

1. Para preparar o meio de cultivo, combine o meio basal dos melanócitos com os fatores de crescimento correspondentes. Inflame a tampa de cada frasco antes de adicionar seu conteúdo ao meio para minimizar a contaminação. Adicione 1% (v/v) de PenStrep ao meio preparado e armazene a 4 °C até o uso.
2. Antes da semeadura, prepare a solução inibidora de tripsina diluindo o inibidor de tripsina de soja no DPBS. Filtre a solução através de uma membrana de 0,22 μm, aliquota e armazene a −20 °C. Uma vez descongelado, pode ser usado por até 10 dias.

2. Descongelamento celular (Dia -3)

ATENÇÃO: Todos os materiais em contato com células humanas devem ser considerados biologicamente contaminados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Para avaliar a senescência, utilizamos ensaios complementares que avaliam a parada do crescimento, a atividade do SA-β-gal e marcadores moleculares adicionais. Aqui, apresentamos os protocolos desses ensaios e os resultados esperados ao trabalhar com esses indicadores de senescência.

1. Pipete 20 mL do soro tampão fosfatado Dulbecco (grau de cultivo celular) em um tubo cônico de 50 mL em temperatura ambiente. Mantenha o frasco contendo células no gelo até descongelar.
2. Flameje a tampa antes de abrir o frasco contendo as células, desrosqueie e flameje novamente as laterais para evitar possível contaminação.
3. Transfira 500 μL de DPBS para o frasco contendo as células. Descongele suavemente as células pipetando para cima e para baixo, depois transfira todo o conteúdo para o tubo.
4. Centrifuge a 100 × g por 5 minutos em temperatura ambiente. O pellet resultante deve parecer bege a marrom (ou mais escuro, dependendo da etnia do doador).
5. Prepare um frasco T75 com 14 mL de meio melanócito.
6. Inflame uma pipeta Pasteur de vidro (chame a cada vez ao manipular melanócitos), aspire cuidadosamente o DPBS e ressuspenda o pellet em 1 mL de substrato.
7. Transfira para o frasco previamente preparado.
8. Incube a 37 °C, 5% de CO₂, e observe diariamente ao microscópio. Troque o médio pelo menos a cada 48 horas.
   NOTA: Cada frasco criopreservado contém aproximadamente 1 × 10⁶ melanócitos humanos primários. Todos os experimentos foram realizados usando células na passagem 9.

3. Semeadura de células (Dia 0)

1. Garanta a confluência de 80–90% das células no dia da semeadura.
2. Aspire o meio do frasco e lave duas vezes com DPBS.
3. Desprenda as células adicionando 2 mL de solução de tripsina-EDTA e incubando por 5 minutos a 37 °C, 5% de CO₂.
4. Bata suavemente no frasco e observe ao microscópio para confirmar o descolamento completo da célula (incube por mais tempo, se necessário).
5. Interrompa a reação adicionando 1,5 vezes o volume do inibidor de tripsina.
6. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e dilua com DPBS até um volume final de 10 mL.
7. Centrifuge a suspensão da célula a 100 × g por 5 minutos.
8. Aspire o sobrenadante e resuspenda até o volume desejado no meio.
9. Para placas tratadas com tBHP, seme 6 ×^{10 5} células por recipiente de 10 cm. Para placas de controle, seme 4 × 10⁵ células por placa.
   NOTA: Para placas tratadas com tBHP, seme uma densidade celular maior para garantir que células suficientes estejam disponíveis para os experimentos, pois sua taxa de crescimento diminuirá progressivamente durante o tratamento. Se for semeada células em coverslips para experimentos de microscopia, os coverslips devem ser revestidos com 0,1 mg/mL de poli-D-lisina e completamente secos antes da semeadura celular.
10. Incube durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂. Troque o médio a cada 48 horas para as placas de controle.

4. tratamento com tBHP (Dia 1–4)

1. Prepare uma solução de trabalho de 10 mM a partir de material tBHP (diluído em DPBS ou mídia).
   NOTA: o tBHP é sensível à luz: cubra o recipiente ao trabalhar com ele. A solução de trabalho pode ser usada por até uma semana quando armazenada corretamente a 4 °C. Cronograma de tratamento: O dia 1 (o dia após a semeadura) marca o início da exposição ao tBHP. Os melanócitos são tratados duas vezes ao dia, com pelo menos um intervalo de 4 horas entre as aplicações. Esse regime é repetido do dia 1 ao dia 4, totalizando 4 dias de tratamento. A concentração selecionada de tBHP e o esquema de tratamento foram adaptados de trabalhos anteriores em fibroblastos dérmicos, onde concentrações mais baixas foram suficientes para induzir senescência. Nos melanócitos primários, entretanto, concentrações mais altas eram necessárias para alcançar indução robusta de senescência, e 100 μM tBHP foi identificado como ideal com base em experimentos de titulação que equilibravam indução de senescência e viabilidade celular
2. Adicione 100 μM tBHP às células por 1 h por tratamento (Para iniciar, adicione o volume apropriado de solução de trabalho, garantindo a pipete no meio líquido).
3. Mova a placa para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir o tBHP uniformemente pelo meio.
   NOTA: Evite movimentos circulares, pois isso pode causar uma distribuição desigual do tBHP pelo meio.
4. Incube por exatamente 1 hora a 37 °C com 5% de CO₂.
5. Para encerrar o tratamento com tBHP, aspire o meio.
6. Lave as placas duas vezes com DPBS pré-aquecido (37 °C).
7. Adicione o volume apropriado de meio fresco aos pratos.
8. Permita que as células se recuperem na incubadora por pelo menos 4 horas antes de iniciar o tratamento subsequente.
9. Repita esse procedimento no mesmo dia para o segundo tratamento e continue nos dias restantes. Mantenha as células em cultura após o término do tratamento até o dia 9 para avaliar os marcadores de senescência.
10. Monitore as placas de controle e a passagem se confluente.

5. Análise da curva de crescimento

1. Conte as células e controles tratados com tBHP seguindo o protocolo de semeadura.
2. Resemeie a mesma densidade inicial ou todas as células caso você conte menos do que as células 6 × 10⁵ para placas tBHP.
3. Realize a contagem celular nos dias 4, 9 e 15 de cultura.
4. Calcule a curva de crescimento usando a seguinte fórmula:
   lg (contagem) - log (semente) / 0,301 + c PDL
   Contagem: número de células obtidas ao final da passagem.
   Semente: Número de células inicialmente placadas no início da passagem.
   cPDL: nível cumulativo de duplicação populacional mantido de passagens anteriores.

6. Atividade SA-β-galactosidase

1. No nono dia, lave as células duas vezes em PBS antes de fixar com 2% de formaldeído e 0,4% de glutaraldeído.
2. Lave as células duas vezes com PBS.
3. Incubar células fixas com solução de coloração com pH de 6,0 (150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl, 5 mM ferricianeto de potássio, 5 mM de ferrocianeto de potássio, 40 mM de ácido cítrico, 12 mM de fosfato de sódio e 1 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo (X-gal).
4. Após 18 horas de incubação a 37 °C, na ausência de CO₂, lave as células duas vezes com PBS.
5. Imagem usando microscopia óptica.
6. Quantifique o número de células tingidas de azul ao microscópio contando o número de células azuis e dividindo pelo número total de células em um campo. Expresse os resultados como uma porcentagem de células positivas.

7. Coloração por imunofluorescência

ATENÇÃO: Resíduos contendo formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído devem ser tratados como resíduos químicos perigosos e descartados de acordo com as regulamentações institucionais de segurança.

1. Use células cultivadas em mantos pré-revestidos com 0,1 mg/mL de poli-D-lisina.
2. No nono dia, lave as células duas vezes e depois fixe com paraformaldeído a 4% por 15 minutos.
3. Lave as células duas vezes com PBS.
4. Permeabilize usando 0,3% de Triton-X e 0,1% de citrato de sódio no PBS.
5. Bloqueie com 1% de BSA em PBS-T por 30 minutos em temperatura ambiente.
6. Incubar células com anticorpos primários γH2AX para detectar resposta permanente de dano ao DNA durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
7. No dia seguinte, lave duas vezes com PBS.
8. Aplique um anticorpo secundário por 1 h em temperatura ambiente.
9. Colorir núcleos com DAPI, se desejado.
10. Lave duas vezes com PBS-T, seguida de duas lavagens com PBS e duas vezes com ddH_2O.
11. Monte os cobertores e deixe-os secar completamente antes de fazer a imagem.
12. Analise a intensidade média de fluorescência e/ou focos γH2AX usando o software ImageJ.

8. Isolamento de RNA e RT-qPCR

ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é altamente tóxico e deve ser manuseado em uma exaustão exausteira. Resíduos contendo β-mercaptoetanol devem ser descartados como resíduos químicos perigosos.

1. No nono dia, tripsinize as células usando 2 mL de tripsina-EDTA.
2. Pare a reação aplicando 1,5x a quantidade de inibidor de tripsina.
3. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 100 x g por 5 minutos.
4. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
5. Pellets de células de lisa sendo resuspendidos em tampão RLT de 350 μL contendo 1% β-mercaptoetanol.
6. Isole o RNA usando um kit de purificação de RNA baseado em coluna.
7. Determine a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (260 nm).
8. Para a síntese de cDNA, utilize-se 1 μg de RNA para transcrição reversa em um volume total de reação de 10 μL, usando uma mistura padrão de transcrição reversa (incluindo tampão RT, dNTPs, primers aleatórios, transcriptase reversa e inibidor de RNase), seguida por condições de ciclo térmico conforme as instruções do fabricante.
9. Realize RT-qPCR para fatores SASP
   NOTA: Os fatores SASP selecionados (IL-8, IL-6 e MMP-1) representam componentes bem estabelecidos do fenótipo secretor associado à senescência e foram escolhidos com base em sua relevância para a biologia da pele, incluindo sinalização inflamatória e remodelação da matriz extracelular
   IL-6 (Fwd: 5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTTTC 3')
   IL-8 (TRX: 5' ACCGGAAGGAACCATCCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACAGAG 3')
   MMP-1 (Fwd: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Rev: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3')
   GAPDH (Fwd: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
10. Analise a expressão relativa de mRNA usando o método ΔΔCt com normalização ao gene doméstico GAPDH.

9. Isolamento de proteínas e Western blot

1. No nono dia, colete lisados de proteína.
2. Aspire o médio e lave as placas duas vezes usando DPBS frio.
3. Lisar as células mecanicamente usando um raspador celular após adicionar 150 μL de tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS e 2 mM EDTA) suplementado com inibidores de protease e transferido para um tubo de 1,5 mL.
4. Realize três ciclos de congelamento e descongelamento, seguidos de uma incubação de 30 minutos no gelo.
5. Centrifuge a 9600 x g a 4 °C por 10 minutos.
6. Determine a concentração de proteína do sobrenadante usando o ensaio BCA.
7. Separe quantidades iguais (20 μg) de proteína em géis de poliacrilamida e transfira para membranas ativadas de PVDF.
8. Bloqueie membranas em leite desnatado 5% em TBS-T.
9. Incubar com anticorpos primários pRB e LaminB1 durante a noite a 4 °C.
10. No dia seguinte, lave as membranas 3 vezes em TBS-T.
11. Incubar em anticorpos secundários apropriados conjugados com HRP por 1 h em temperatura ambiente.
12. Detectar proteínas por quimioluminescência e realizar análise densitométrica.

Resultados

O tratamento com tBHP induz paragem do crescimento em melanócitos neonatais humanos.
O tratamento com tBHP inibe a proliferação de melanócitos em comparação com os controles não tratados (n = 3) (Figura 2A). No nono dia, as células tratadas atingem apenas 1,4 cPDL, enquanto os controles atingem 3,1 cPDL. Essa divergência aumenta com o tempo, com melanócitos tratados se aproximando de um platô de 1,9 cPDL ao dia 15, enquanto os controles c...

Discussão

Esse protocolo estabelece uma abordagem padronizada para induzir a senescência prematura induzida por estresse (SIPS) em melanócitos neonatais humanos usando tBHP, oferecendo um modelo robusto para estudar a senescência especificamente nesse tipo celular. Mudanças consistentes na proliferação, morfologia, atividade SA-β-gal, marcadores de dano ao DNA e componentes SASP apoiam o fenótipo induzido. Ao focar nos melanócitos, células que permanecem pouco estudadas em pesquisas sobre senescên...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.22 µm membrane filter	Merck	SLGVR33RS
1 M citric acid	Merck	K91567844	prepare in aq. dest.
1 M MgCl2	Merck	A649033	prepare in aq. dest.
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	prepare in aq. dest.
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	prepare in aq. dest.
37% formaldehyde	Sigma	252549
4% paraformaldehyde	CarlRoth	0335.3
5 M Sodium Chloride	Sigma	S3014	prepare in aq. dest.
50% glutaraldehyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovine serum albumin)	Sigma	A7030
Chemiluminescent substrate	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Coverslips for cell culture/microscopy	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Human neonatal melanocytes	CellSystems	FC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)	Abcam	AB16048	Dilution 1:1000 in 5% BSA
Mounting medium containing DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P4333
Polyacrylamide gradient gels	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Potassium ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium ferrocyanide	Sigma	P-9387
pRB antibody (rabbit)	CellSignalling	93085	Dilution 1:1000 in 5% BSA
Protease inhibitor cocktail	self prepared	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer	self prepared	N/A	containing: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT buffer	Qiagen	1015762	Included in RNeasy Mini Kit
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)	Sigma	70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)	Sigma	S4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX antibody (rabbit)	CellSignalling	2577S	Dilution 1:200