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Artigo de método

Estabelecimento de um modelo murino de fibrose renal via lesão unilateral por isquemia-reperfusão e nefrectomia contralateral retardada

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DOI:

10.3791/70598

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22 de maio de 2026

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Guangzhou Chest Hospital, Institute of Tuberculosis, Guangzhou Medical University, 2Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 3Department of Transplantation, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para estabelecer um modelo camundongo de fibrose renal usando lesão unilateral por isquemia-reperfusão seguida de nefrectomia contralateral retardada. Essa estratégia possibilita estudos longitudinais da transição de AKI para DRC e avaliação precisa da função renal residual no desfecho final.

Resumo

A lesão por isquemia renal-reperfusão (IRI) contribui para a lesão renal aguda (AK) e é um dos principais fatores que impulsionam a progressão da doença renal crônica (DRC). Um modelo animal reproduzível é necessário para facilitar a avaliação dos mecanismos de reparo e fibrose desadaptativos. Aqui é relatado um modelo padrão de fibrose renal estabelecido por lesão unilateral de isquemia-reperfusão (uIRI) seguida de nefrectomia contralateral (CNx). Essa estratégia garante a sobrevivência a longo prazo dos animais durante a progressão da doença, permitindo a avaliação precisa da função renal residual do rim lesionado no momento da colheita. Os machos C57BL/6 camundongos foram submetidos a isquemia quente por 28 minutos a 37 °C, e uma CNx foi realizada 24 horas antes de cada desfecho do estudo. Os camundongos foram sacrificados para avaliações histológicas e imunohistoquímicas nos seguintes períodos: 2 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a IRI. Nos dias pós-operatórios 2 e 5, os rins apresentaram principalmente necrose tubular, especialmente na junção corticotelar, sem evidência de fibrose intersticial. A partir de uma semana após a cirurgia, essas características patológicas foram substituídas por infiltração celular inflamatória e atrofia tubular precoce; A fibrose intersticial também apareceu e atingiu seu pico de gravidade na segunda semana. Durante a terceira e quarta semanas após a cirurgia, os rins apresentaram atrofia tubular ampla compatível com atrofia por desuso. Notavelmente, a fibrose intersticial foi reduzida em comparação com a segunda semana, indicando progressão para a fase de cicatrização hipocelular e silenciosa. Esse modelo reproduz efetivamente os cenários clínicos da transição de AKI para DRC e fornece uma plataforma confiável para explorar mecanismos fibróticos e triagem de intervenções terapêuticas.

Introdução

A lesão por isquemia-reperfusão renal (IRI) é um dos fatores críticos que levam à lesão renal aguda (AK) no contextoclínico 1. Etiologias comuns incluem transplante renal (envolvendo isquemia fria e quente seguida de reperfusão do rim doador), cirurgias cardiovasculares ou renais que requerem oclusão vascular temporária e estados de hipoperfusão sistêmica causados por trauma grave, hemorragia grave ousepse 2.

A fisiopatologia do IRI envolve um processo bifásico complexo. Inicialmente, durante a fase isquêmica, a interrupção do fornecimento de oxigênio e nutrientes leva a desordem metabólica, depleção de ATP e perturbação do citoesqueleto nas células epiteliais tubulares renais (TECs)3. Subsequentemente, a restauração do fluxo sanguíneo durante a reperfusão, embora necessária para salvar o tecido isquêmico, desencadeia um "insulto secundário" mais complexo. 4 Essa fase da lesão é impulsionada por uma cascata de eventos, incluindo estresse oxidativo causado pela explosão de espécies reativas de oxigênio (ROS), disfunção endotelial, infiltração massiva de células inflamatórias (como neutrófilos e macrófagos) e ativação do sistema complementar3. Essas cascatas complexas agravam coletivamente a apoptose e a necrose dos TECs, constituindo a principal apresentação patológica da AKA.

Notavelmente, a IRI não se limita a danos agudos e reversíveis. Evidências substanciais indicam que o reparo incompleto ou maladaptativo após IRI renal é um mecanismo central que impulsiona a transição para uma patologia crônica de longo prazo. Em condições fisiológicas, o rim inicia um programa de reparo após a INA, que elimina efetivamente as células danificadas e promove a proliferação e diferenciação dos TEC sobreviventes para restaurar a estrutura e a função dos túbulos danificados. No entanto, após uma infração severa ou repetitiva da IRI, esse processo de reparo pode se desregular, levando eventualmente à atrofia tubular, fibrose intersticial renal e acelerando o desenvolvimento e progressão da doença renal crônica (DRC)5,6.

Portanto, elucidar os mecanismos da transição de AKI para DRC e desenvolver intervenções terapêuticas são necessidades urgentes. Modelos de roedores, especialmente modelos de camundongo, tornaram-se essenciais e indispensáveis in vivo. ferramentas para estudar fibrose pós-IRI devido ao seu fundo genético bem definido e à semelhança com a progressão da doença humana. No entanto, existe uma heterogeneidade significativa nas metodologias atuais de IRI (por exemplo, duração da isquemia, controle de temperatura, lesão unilateral vs. bilateral), o que leva a baixa reprodutibilidade e comparabilidade limitada entre estudos7.

Para enfrentar esses desafios, o presente estudo detalha um protocolo padronizado para um modelo modificado de lesão unilateral de isquemia-reperfusão (uIRI). Além disso, esse protocolo inclui uma nefrectomia contralateral (CNx) realizada 24 horas antes do desfecho do estudo. Essa estratégia supera a alta mortalidade associada à isquemia bilateral, ao mesmo tempo em que possibilita a avaliação precisa da função renal residual e da progressão fibrótica no rim lesionado. Este modelo recapitula com precisão a transição dinâmica de AKI para DRC, fornecendo uma plataforma robusta in vivo. para exploração mecanicista e triagem terapêutica.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Regulamento para a Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (Aprovação nº JENNIO-IACUC-2025-A053). Todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as diretrizes institucionais, aderindo integralmente aos princípios das 3R. A linha do tempo do estudo, incluindo os pontos de sacrifício e a coleta de amostras, está resumida na Figura 1.

1. Preparação de animais e instrumentos

  1. Use camundongos machos C57BL/6 (8 semanas de idade, pesando 20–25 g) alojados em instalações específicas livres de patógenos (SPF) para o estudo.
  2. Divida os camundongos aleatoriamente em grupo uIRI e grupo Sham. Para cada um dos seis pontos de tempo designados (2 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas), alocar n = 4 camundongos por grupo.
    NOTA: Os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, com acesso livre a comida e água. Eles foram aclimatados ao ambiente de laboratório por pelo menos uma semana antes da experimentação.
  3. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos via .Autoclav a vapor de alta pressão antes do uso.
  4. Mantenha a temperatura corporal central estritamente entre 37,0 °C ± 0,5 °C usando um sistema de monitoramento homeotérmico equipado com uma sonda retal para monitoramento contínuo da temperatura. Insira a sonda lubrificada no reto imediatamente após a indução da anestesia e mantenha-a no lugar durante todo o procedimento.
  5. Anestesiar camundongos usando um sistema de anestesia gasosa para pequenos animais com isoflurano (5% para indução, 1,5% para manutenção, com fluxo de oxigênio de 1,0 L/min por meio de um vaporizador calibrado).
    NOTA: Confirme anestesia profunda pela ausência de reflexo de retirada do pedal. Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados somente após o camundongo atingir um estado de anestesia profunda.
  6. Raspe o pelo da região dorsal esquerda do flanco.

2. Procedimento cirúrgico

  1. Modelo uIRI (Dia 0)
    1. Posicione o camundongo no decúbito lateral direito para expor o flanco esquerdo.
    2. Faça uma incisão longitudinal cutânea de 1 cm a 1,5 cm na parte esquerda das costas, seguida de uma incisão muscular para entrar no espaço retroperitoneal.
    3. Empurre suavemente o rim esquerdo para fora usando um cotonete estéril umedecido com soro fisiológico.
      NOTA: O rim deve ser movido apenas manipulando a almofada de gordura peri-renal ou usando cotonetes estéreis. O fórceps nunca deve tocar a superfície dos rins.
    4. Dissecar cuidadosamente o pedículo renal usando pinças de ponta fina para isolar a artéria e a veia renal do tecido conjuntivo ao redor.
    5. Pinça o pedículo renal esquerdo usando um micro-clipe vascular não traumático para induzir isquemia.
      NOTA: A dissecção do pedículo renal deve ser realizada de forma limpa e completa. O procedimento deve explicitamente excluir o ureter da aplicação da pinça. O clampamento ureteral inadvertido induziria uma lesão híbrida IRI/Obstrução Ureteral Unilateral (UUO), podendo introduzir um componente obstrutivo permanente.
    6. Comece um temporizador imediatamente após o clamp. A duração da isquemia é estritamente definida para 28 minutos.
    7. Verifique a isquemia visualmente: a cor do rim deve mudar de vermelho vivo para roxo escuro em segundos.
    8. Cubra o rim com gaze estéril embebida em soro salino morno.
    9. Após 28 minutos, remova a pinça para iniciar a reperfusão.
    10. Confirme a reperfusão visualmente: a cor dos rins deve voltar ao rosa/vermelho em poucos minutos.
    11. Leve o rim de volta à cavidade abdominal.
    12. Feche a camada muscular com pontos absorvíveis 5-0 e a incisão cutânea com pontos de nylon 5-0.
  2. Operação simulada (Dia 0)
    1. Realize as mesmas etapas de anestesia, incisão e exteriorização renal descritas no passo 2.1.
    2. Dissecar o pedículo renal, mas não clampear os vasos.
    3. Mantenha o rim exteriorizado pelo mesmo tempo (28 min) antes de retorná-lo à cavidade abdominal e fechar a incisão.
  3. Cirurgia CNx
    NOTA: Realize o CNx 24 horas antes do ponto final de coleta da amostra programada para cada grupo específico para avaliar a função residual do rim lesionado.
    Para o grupo de 2 dias: Realize CNx no primeiro dia pós-IRI.
    Para o grupo de 5 dias: Realize CNx no quarto dia pós-IRI.
    Para o grupo de 1 semana: Realize CNx no 6º dia pós-IRI.
    Para o grupo de 2 semanas: Realize CNx no 13º dia pós-IRI.
    Para o grupo de 3 semanas: Realize CNx no dia 20 pós-IRI.
    Para o grupo de 4 semanas: Realize CNx no dia 27 pós-IRI.
    1. Anestesie o camundongo conforme descrito no passo 1.5. Depois, raspe e desinfete o flanco dorsal direito.
    2. Faça uma pequena incisão lateral do lado direito para expor o rim direito.
    3. Exteriorize o rim direito e dissece suavemente o pediculo renal.
    4. Liga firmemente o pedículo renal (artéria, veia e ureter) usando um ponto de seda 4-0 não absorvível.
    5. Retire o rim direito distal à ligadura.
      NOTA: Certifique-se de que não haja sangramento ativo no coto.
    6. Retorne o coto pedicular à cavidade abdominal e feche a incisão conforme descrito no passo 2.1.12.
    7. Deixe o mouse se recuperar em uma bolsa térmica.

3. Cuidados pós-operatórios e monitoramento

  1. Mantenha os ratos na almofada térmica até que recuperem totalmente a consciência e a mobilidade.
  2. Devolva os ratos a gaiolas limpas com comida e água facilmente acessíveis.
  3. Monitore diariamente o estado de saúde dos camundongos.
    1. Verifique a mortalidade diariamente.
    2. Monitore mudanças na tosa, sinais de desconforto ou dor, e postura.
    3. Inspecione as incisões em busca de sinais de infecção, inflamação ou deiscência.

4. Avaliações pós-operatórias

  1. Coleta de amostras
    NOTA: Os camundongos foram sacrificados em momentos designados: 2 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a IRI para avaliar a progressão da lesão e fibrose.
    1. Anestesie os camundongos com isoflurano a 3%.
    2. Colete amostras de sangue para análise bioquímica sérica (se necessário).
    3. Eutanasie os camundongos por luxação cervical.
    4. Colhe rapidamente o rim esquerdo (lesionado).
    5. Dividir o tecido renal: fixar uma porção em paraformaldeído comercial a 4% para análise histológica e congelar o tecido restante em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C para análise molecular.
  2. Processamento e seccionamento de tecidos
    1. Desidrate, limpe e embutida os tecidos fixos em cera de parafina, seguindo rigorosamente o protocolo de processamento de tecidos descrito por Feldman eWolfe 8.
    2. Seccione os blocos de parafina com espessura de 4 μm usando um micrótomo rotativo.
    3. Monte as seções de tecido em lâminas de vidro e assá-las a 60 °C por 2 horas para garantir a adesão do tecido.
  3. Coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E)
    1. Desparafinize as lâminas de tecido em xileno e reidrate-as através de uma série descendente de etanol graduado até água destilada.
    2. Realize coloração H&E para avaliar danos morfológicos. Execute as etapas de tingimento e lavagem exatamente conforme detalhado no protocolo padronizado de Feldman eWolfe 8.
    3. Desidrate, limpe e faça o coverslip das lâminas tingidas usando um meio de montagem resinoso.
  4. Coloração Tricroma de Masson
    1. Desparafinize e reidrate as seções do tecido em água destilada.
    2. Aplique os corantes mordente, nuclear, citoplasmático e de colágeno sequencialmente para avaliar a deposição de colágeno e a fibrose renal. Siga os tempos exatos de incubação dos reagentes e os passos de lavagem descritos pelo Islã eKumar 9.
    3. Enxágue, desidrate, limpe e faça coverslip nas lâminas para avaliação microscópica.
  5. Imunohistoquímica (IHC)
    1. Desparafinize e reidrate as seções do tecido.
    2. Realize a recolha de epítopos induzida pelo calor usando um tampão de 10 mM de citrato de sódio contendo 0,05% Tween-20 (pH 6,0), conforme descrito por Magaki et al.10.
    3. Bloqueia a atividade endógena da peroxidase incubando as seções em 3% de peróxido de hidrogênio.
    4. Bloqueie os locais de ligação inespecíficos usando albumina sérica bovina a 5% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
    5. Incube as seções com o anticorpo primário anti-alfa-músculo liso actina (α-SMA) (diluição 1:400) durante a noite a 4 °C.
    6. Lave as lâminas e incube-as com o anticorpo secundário por 1 hora em temperatura ambiente.
    7. Visualize o antígeno-alvo usando DAB e contra-colora com hematoxilina, seguindo os procedimentos fornecidos por Magaki et al.10.
    8. Desidrate, limpe e faça coverslip nas lâminas para a imagem final.

5. Análise estatística

  1. Apresente todos os dados quantitativos como média ± desvio padrão (DS).
    NOTA: Análises estatísticas e geração de grafos foram realizadas usando o software GraphPad Prism versão 10.0. As diferenças entre múltiplos grupos em comparação a um único grupo controle (Sham) foram analisadas usando uma Análise Ordinária de Variância Unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett. Um P-valor de < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P. < 0,0001). O NS indica que não há diferença significativa.

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Resultados

Durante todo o período experimental, a taxa geral de sobrevivência foi de 100% tanto para o grupo Sham quanto para o grupo uIRI (n = 4 por ponto temporal). Nenhuma mortalidade foi observada nem durante a cirurgia inicial de uIRI nem durante o subsequente procedimento de CNx atrasado. Esse resultado confirma o alto perfil de segurança e confiabilidade desse protocolo de dois estágios em comparação com modelos bilaterais de isquemia, que normalmente apresentam mortalidade significativa ind...

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Discussão

O presente estudo descreve um protocolo padronizado para estabelecer um modelo murino de fibrose intersticial renal usando uIRI, seguido por CNx realizado 24 horas antes do desfecho do estudo. A triagem histopatologica dinâmica revelou fases patológicas distintas: necrose tubular aguda caracterizada por pico de incidência nos dias 2–5, seguida por fibrogênese ativa e ativação dos miofibroblastos com pico entre 1–2 semanas, e, notavelmente, entre as semanas 3–4, o tecido transitou para um...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82373042), Equipe Conjunta de Inovação para Pesquisa Clínica e Básica (202409) e Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2022QH291 de ZR2025MS1199).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-&alfa;-SMAProteintech14395-1-APAnticorpo primário usado no IHC para detectar a expressão de +alfa-SMA e avaliar a ativação dos miofibroblastos
Kit de Ensaio de Nitrogênio Ureiano no Sangue (BUN)Instituto de Pesquisa em Biotecnologia Jiancheng de Nanjing Co., Ltd.C013-2-1Usado para quantificar os níveis séricos de BUN para avaliar a função renal residual
Kit de Ensaio de Creatinina (CRE)Instituto de Pesquisa em Biotecnologia Jiancheng de Nanjing Co., Ltd.C011-2-1Usado para quantificar os níveis séricos de creatinina para avaliar a função renal residual
Sistema de Anestesia GasosaNanjing Calvin Biotechnology Co., Ltd.KW-MZJ-4Equipado com isoflurano para anestesia geral
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc.N/AUsado para análise estatística e representação gráfica de dados (https://www.graphpad.com)
Sistema de Monitoramento HomeotérmicoCiência da CondutaCS-HS-0001Equipado com uma sonda retal para monitoramento e regulação contínua da temperatura corporal central em circuito fechado
ImageJ SoftwareInstitutos Nacionais de SaúdeN/ASoftware de código aberto usado para quantificação morfométrica de áreas fibróticas e sinal IHC
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd R510-22Agente anestésico inalante usado durante procedimentos cirúrgicos
Masson' s Kit de Tingimento TricromáticoBeyotimeC0189MPara quantificar a deposição de colágeno
Micro-clipe vascular não traumáticoROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TUsado para clampear o pedículo renal por 28 minutos
Paraformaldeído (4%)Beyotime Biotech IncP0099-100mlUsado para fixação rápida de amostras de tecido renal coletados
Buffer de citrato de sódio (10 mM, pH 6,0)Thermo Fisher Scientific Inc. 005000Usado para recuperação de epítopos induzida por calor antes da coloração imunohistoquímica
Microscópio cirúrgico estereotáxicoBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKUsado para realizar cirurgia IRI

Referências

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  8. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
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