Artigo de método

Manipulação Física para Gerar Embriões Mini de Xenopus

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DOI:

10.3791/70602

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10 de abril de 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método de constrição física para produzir mini embriões a partir de embriões de célula única de Xenopus laevis .

Resumo

Uma característica definidora da embriogênese precoce é a rápida e exponencial diminuição do tamanho das células individuais, enquanto o volume total do embrião permanece constante. A razão nucleocitoplasmática (N:C) desempenha um papel fundamental na regulação das atividades celulares e moleculares essenciais para a embriogênese precoce. A manipulação física do tamanho do embrião, portanto, representa uma forma importante de investigar esses mecanismos de desenvolvimento. O grande tamanho (~ 1,2 mm de diâmetro) e a alta plasticidade do desenvolvimento dos embriões precoces de Xenopus laevis os tornam um modelo ideal para dissecação física e manipulação a fim de questionar os mecanismos regulatórios do desenvolvimento. Aqui, descrevemos uma abordagem para gerar mini embriões com volume citoplasmático alterado e razão N:C, contraindo embriões de Xenopus laevis de célula 1 com nós de cabelo. Os mini embriões resultantes demonstraram iniciar ativação precoce do genoma zigótico (ZGA), induzida diretamente pela redução do tamanho celular e pelo crescimento da razão N:C. Esses mini embriões, que podem ser generalizados para outros sistemas embrionários, fornecem, portanto, uma ferramenta única e poderosa para dissecar mecanismos mediados pelo tamanho do desenvolvimento embrional precoce.

Introdução

Uma das características mais marcantes da embriogênese precoce é a redução exponencial do tamanho individual das células dentro de um embrião, mantendo um volume constante. A síntese rápida de DNA e a redução do tamanho celular levam a um aumento na razão nucleocitoplasmática (razão N:C), que desempenha um papel importante na regulação de várias atividades características da transição mid-blastula (MBT) em sistemas embrionários modelo, incluindo transcrição gênica zigótica, elongação do ciclo celular e motilidadecelular 1,2,3,4 . Manipulações da razão N:C por meio da mudança da ploidia do DNA apoiam sua importância funcional na embriogênese inicial em vários sistemasmodelo 3,4,5,6.

A manipulação física do tamanho do embrião representa uma técnica importante para estudar mecanismos regulatórios no desenvolvimento embrionárioinicial 7. A remoção citoplasmática por aspiração, que altera a razão N:C em embriões de camundongos iniciais, induz compactaçãoprematura 8. Além disso, reduzir o tamanho do embrião de peixe-zebra por meio do corte revelou um novo mecanismo baseado em gradiente de escalasomita 9. Além disso, a redução do volume citoplasmático em embriões de Xenopus revelou dinâmica do ciclo celular dependente da razão N:C 10. Importante, ao gerar mini embriões de Xenopus por meio da redução do tamanho celular e marcando transcritos nascentes com 5-etinil-uridina (5-EU) em células individuais, demonstramos que reduzir o tamanho celular induz a ativação do genoma zigótico (ZGA) de forma dependenteda dose 11. Esses resultados apoiam o papel crucial do tamanho celular na embriogênese inicial.

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para gerar mini embriões de Xenopus laevis por manipulação física usando nós de cabelo (Figura 1)10,11. Essa abordagem se baseia no uso fundamental de constrição por laço capilar em embriões deXenopus 1 por Newport e Kirschner (1982), fornecendo um protocolo claro e confiável para gerar mini embriões como ferramentas experimentais. Além disso, esse método é aplicável a outros sistemasembrionários 7, o que facilitaria a descoberta de novos mecanismos de embriogênese precoce.

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Protocolo

O trabalho com animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Sul.

1. Preparação de materiais

  1. Preparando soluções
    1. Prepare 20× MMR misturando 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 e 40 mMCaCl 2. Ajuste o pH para 7,8 com NaOH. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente.
    2. Prepare uma solução de meio de gradiente de densidade a 3% (peso/vol) misturando 1,5 g de meio de gradiente de densidade em 50 mL de 0,5× MMR. Mexa suavemente com uma barra magnética até que o polímero esteja dissolvido. Mantenha a 4 °C até o uso.
    3. Prepare gel de agarose a 1% em uma placa de Petri de 60 mm misturando 0,5 g de agarose em 50 mL de 0,1× MMR. Aqueça com um micro-ondas para dissolver a agarose, depois adicione 5 mL de agarose para revestir a base de uma placa de Petri de 60 mm em uma camada fina.
  2. Preparando nós de cabelo para comprimir embriões
    1. Pegue alguns fios finos e corte-os em pedaços de ~5 cm.
    2. Use uma pinça para inserir uma ponta do cabelo em uma ponta P10 com cerca de ~1 cm de profundidade.
    3. Coloque cera em uma colher e aqueça para derreter a cera. Mergulhe rapidamente a ponta P10 presa ao cabelo na cera e deixe secar por 1 minuto. Certifique-se de que o cabelo esteja fixo na ponta da ponta P10.
    4. Use uma pinça para fazer cuidadosamente um nó de cabelo por cima. Ajuste o tamanho do laço para ~1,5 mm. Apare o saliente se necessário. Deixe o nó de lado para uso futuro.
    5. Repita os passos acima para fazer mais nós de cabelo conforme necessário.

2. Fazendo mini embriões de Xenopus

  1. Para obter embriões de Xenopus , siga um protocolo padrão para realizar fertilização in vitro (FIV) (por exemplo, veja Sive et al., 2007)12. O embrião deve estar em 0,1× MMR, pronto para uso.
  2. Para visualizar a ZGA em células individuais de embriões iniciais e estudar seus mecanismos regulatores, microinjete embriões do estágio 1 com 5-etinil-uridina (5-EU) para marcar metabolicamente os transcritosnascentes 11,13 antes de prosseguir com os seguintes procedimentos.
  3. Quando os embriões estiverem a ~1 hora após a fertilização (hpf), use uma pipeta plástica de transferência para transferir ~20 embriões em uma placa de Petri de 60 mm (coberta com gel de agarose a 1%) contendo ~15 mL de meio gradiente de densidade de 3%/0,5× MMR.
  4. Use uma pinça em uma mão para girar um embrião cerca de ~45–60 graus sob um estereomicroscópio para acessar o polo vegetal (hemisfério pálido). Segure o embrião inclinado com a pinça e use uma agulha de 30 G na outra mão para perfurar cuidadosamente o poste vegetal. Libere um pouco de citoplasma pressionando suavemente o embrião.
  5. Cubra cuidadosamente um nó de cabelo montado em uma ponta P10 em um embrião para que o polo animal (hemisfério escuro) fique dentro do nó de cabelo. Ajuste a posição do nó de acordo com o tamanho desejado do mini embrião.
  6. Segure a pipeta P10 com uma mão e use uma pinça na outra para puxar as duas extremidades do nó em direções opostas. O nó de cabelo vai apertar ao redor do embrião, entre o polo animal (intacto) e o polo vegetal (com o citoplasma liberado). Corte o nó de cabelo no local onde ele se fixa na ponta P10.
  7. Repita os passos 2.4–2.6 acima para obter a quantidade desejada de mini embriões.
  8. Deixe os embriões permanecerem em médio gradiente de densidade de 3%/MMR de 0,5× por ~1–2 horas. Depois, remova o meio com uma pipeta P1000 sem perturbar os embriões e recoloque com 15 mL de 0,1× MMR.
  9. Deixe os embriões se desenvolverem até os estágios desejados e, em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente os nós dos mini embriões.
  10. Colete os embriões para análise desejada, como visualizar o ZGA em célulasindividuais 11,13.

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Resultados

Embriões de Xenopus laevis no estágio 1-celular estavam comprimidos com os nós de cabelo conforme descrito acima. Os embriões controle e mini no ~Estágio 9 (8,5 hpf a 23 °C) foram fotografados sob estereoscópio. Como mostrado na Figura 2, o volume de alguns mini embriões é ~1/3 do dos embriões controle. Esse resultado sugere que os embriões iniciais de Xenopus podem ser manipulados para gerar mini embriões, fornecendo um modelo único para e...

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Discussão

Aqui, descrevemos um método para gerar mini-embriões em Xenopus ao restringir fisicamente embriões do estágio 1 com nós de cabelo. Essa abordagem fornece evidências diretas de que a redução do tamanho celular induz ZGA em um embriãomodelo 11.

Vários aspectos desse protocolo são críticos para gerar com sucesso mini-embriões. Para fazer nós de cabelo, é importante usar cabelo fino e durável, preferencialmente de bebês. Quanto mai...

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Divulgações

O autor declara não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao laboratório Matthew Good da Universidade da Pensilvânia por fornecer o treinamento. Esse trabalho foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (R03HD105802).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha 30-GBD Medicina305128Para perfurar embriões
Placas de Petri Descartáveis de 60 mmVWR25384-092Para incubar embriões
Estereoscópios Zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Para visualizar embriões
AgaroseSigma-AldrichA-9414Para revestir placas de Petri
Pinça Dumont, Estilo 5Ciências da Microscopia Eletrônica72701-DPara ajustar e manter embriões
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Para incubar embriões
TipOne Pipette Tip, 10 & micro; LUSA Scientific1111-3700Para montar os nós de cabelo
Bloco de cera, pretoCarolina Biological Supply Co.974228Para montar os nós de cabelo

Referências

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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