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Artigo de método

Alternativa de baixo custo para examinar preferência social em peixe-zebra (Danio rerio) usando a tarefa de 3 câmaras em aquário aberto e natação livre

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DOI:

10.3791/70610

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7 de agosto de 2026

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1Christopher Newport University, 2Virginia Governor's School for Science and Technology, 3Bay Path University

Neste artigo

Resumo

Tarefas de preferência social multi-câmara foram adaptadas de roedores para peixe-zebra, facilitando o estudo do comportamento social em organismos modelo. Esse protocolo valida uma tarefa de baixo custo de 3 câmaras em tanque aberto, usando webcams e software de código aberto para medir a preferência social dos peixes-zebra, tornando-a acessível para pesquisa e ensino de graduação.

Resumo

Compreender o comportamento social é uma atividade central na pesquisa neurocomportamental, frequentemente estudada por meio de tarefas de preferência social. Essas tarefas, originalmente desenvolvidas para roedores e posteriormente adaptadas para peixes-zebra, são amplamente utilizadas para examinar dinâmicas sociais e respostas. A tarefa de 3 câmaras de natação livre em tanque aberto (OTFST) consiste em um tanque central ladeado por dois tanques de estímulo, com uma câmera posicionada para registrar o comportamento do sujeito no tanque central e polarização de filme e retroiluminação para melhorar a qualidade e a validade do vídeo. Esse protocolo utiliza uma configuração de baixo custo com webcams USB e materiais facilmente disponíveis. Apresentamos o uso do DeepLabCut, uma ferramenta de estimativa de pose sem marcadores de código aberto que permite o acompanhamento preciso em vídeo dos movimentos dos animais e fornece dados de séries temporais posicionais para serem analisados para diversas métricas. Sessões piloto validam a capacidade do sistema de capturar comportamentos robustos de preferência social. Essa abordagem econômica oferece uma plataforma acessível e escalável para laboratórios que investigam a interação social em peixes-zebra, e a versatilidade e relativa simplicidade do OTFST de 3 Câmaras o tornam adequado para laboratórios de ensino de graduação e projetos de pesquisa.

Introdução

Preferência social é a tendência do indivíduo de se envolver, buscar ou evitar estímulos sociais e é um aspecto fundamental do comportamento social que desempenha um papel fundamental no estabelecimento de vínculos e hierarquias dentro de grupos de animais, incluindohumanos 1,2,3,4. Compreender a preferência social é essencial para caracterizar os mecanismos neurais e comportamentais que fundamentam a interação social. Pesquisas anteriores indicam que déficits nas preferências sociais podem estar associados a transtornos neurodesenvolvimentais e psiquiátricos 5,6,7,8. Modelos animais podem fornecer insights sobre a base biológica do comportamento social e auxiliar no desenvolvimento de ferramentas translacionais para diagnosticar e tratar deficiências sociais. Esses modelos animais, que vão de roedores 9,10 a espéciesaquáticas 11,12, fornecem estruturas úteis para descobertas.

Roedores foram usados pela primeira vez em pesquisas comportamentais no início do séculoXIX, devido às suas semelhanças fisiológicas com os humanos14,15. Embora comportamentos como agressão tenham sido inicialmente estudados, medidas sistemáticas de preferência social permaneceram mínimas. Pesquisadores preencheram essa lacuna desenvolvendo a tarefa de preferência social de três câmaras, introduzida por Nadler et al.16. O aparelho consiste em três câmaras interconectadas. Normalmente, uma câmara lateral contém um novo conspecífico enquanto a outra câmara permanece vazia. O sujeito pode explorar livremente todas as câmaras, onde o tempo em cada câmara é registrado e avaliado como indicador de preferência. Esse aparelho e procedimento, juntamente com várias variações, ganhou ampla popularidade e tem sido usado para estudar vários aspectos do desempenho social 17,18,19 e déficits sociais em modelos de roedores para transtorno do espectro autista 5,20,21. No entanto, estudos com roedores são mais caros e exigem considerável espaço. Por isso, muitos pesquisadores passaram a usar espécies aquáticas para pesquisas neurocomportamentais.

Espécies aquáticas, principalmente o peixe-zebra (Danio rerio), possuem um repertório comportamental elaborado, incluindo interações sociaiscomplexas 22. Devido à sua utilidade como modelo de pesquisa biomédica e à importância da interação social em sua ecologia comportamental, os peixes-zebra fornecem uma estrutura significativa para respostas sociais que pode ser usada em comparação com os humanos23. Peixes-zebra tornaram-se cada vez mais populares para pesquisas em neurociência comportamental, pois são baratos de manter e exigem um espaço relativamente pequeno, tornando essa espécie um modelo prático e econômico para estudos em larga escala sobre comportamento social e preferência24. Em alguns estudos, uma configuração adjacente do aquário foi usada para estudar interações sociais em espéciesaquáticas 25,26; No entanto, esse sistema proporcionou um fluxo de avaliação relativamente limitado para avaliação da preferência social, já que apenas um estímulo foi apresentado. Essa limitação foi resolvida com a adaptação da tarefa murina de três câmaras para peixes-zebra em2018-27. O aparelho modificado para a tarefa de 3 câmaras de piscina livre e piscina livre (OTFST) consistia em um único tanque de acrilamida dividido com barreiras fixas de acrilamida para fornecer uma zona de início neutra e duas câmaras laterais, cada uma contendo um conspecífico familiar ou novo. Para medir a preferência social, o tempo acumulado passado próximo a cada câmara lateral foi registrado, demonstrando que a exposição ao etanol e a eliminação por sam2 reduziram a preferência por novidade nopeixe-zebra-27. Enquanto o teste de interação social de 3 câmaras do roedor permite interações multimodais complexas entre o sujeito e o(s) conspecífico(s) do teste, por meio das modalidades visual, química, tátil e acústica, o uso de câmaras separadas para o OTFST aquático de 3 câmaras reduz a interação entre o sujeito e os animais de estímulo apenas à modalidade visual. Embora essa interação monomodal possa ter menor validade ecológica, ela oferece mais controle experimental e aumenta a simplicidade para projetos conduzidos por pesquisadores de graduação. Na literatura, diversos pesquisadores exploraram desde então adaptações do OTFST de 3 câmaras para investigar fatores genéticos e ambientais que influenciam o comportamento social empeixes-zebra 28,29,30,31,32.

A atual adaptação do OTFST de 3 câmaras foi projetada para servir como um aparelho modelo versátil e amigável para estudantes de graduação. O FishLab, um laboratório totalmente de graduação, criou e utilizou esse sistema e demonstrou sua eficácia como uma ferramenta de alto rendimento para investigar preferência social em peixes-zebra. Estudos que utilizam esse sistema exploraram múltiplas facetas da preferência social dos peixes-zebra em resposta a manipulações de variáveis independentes. O primeiro estudo demonstrou que o peixe-zebra pode detectar estímulos sociais vivos versussimulados 33, enquanto o segundo investigou a preferência por cardumes estabelecidos em comparação com cardumesrecém-formados 34. O estudo mais recente examinou a capacidade dos peixes-zebra de diferenciar cardumes quimicamente alarmados e nãoalarmados 35. Juntos, esses estudos abordam diferentes aspectos do comportamento social, incluindo realismo, familiaridade e detecção de ameaças, ao mesmo tempo em que demonstram semelhanças nas preferências de cardume e avaliam respostas ao risco de predação. No entanto, o sistema usado nesses estudos anteriores empregava câmeras digitais IP montadas em equipamentos profissionais de câmeras, um sistema dedicado de alojamento aquático e software proprietário tanto para aquisição quanto para análise de vídeo, com um custo total que poderia ser proibitivo para investigadores/instrutores com orçamentos operacionais pequenos. Com o advento de softwares de código aberto e webcams de alta qualidade baseadas em USB, uma versão de baixo custo agora é viável para pesquisadores que desejam empregar essa técnica com pesquisadores de graduação, com um preço total (aproximadamente US$2.000; excluindo o computador) substancialmente inferior ao custo do sistema de alto custo (aproximadamente US$20.000+, excluindo o computador).

O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e aplicação de uma versão de baixo custo do OTFST de 3 câmaras para peixe-zebra. Sua acessibilidade, simplicidade e versatilidade o tornam uma ferramenta útil para pequenos laboratórios ou ambientes educacionais com recursos limitados. Quando combinada com moradias de baixo custo, como aquários de 10 galões comumente disponíveis, a configuração atual custa significativamente menos para instalar e manter. Além disso, o uso de softwares de acesso aberto, como o sistema de radiodifusão aberta (OBS), para gravação de sessões experimentais e várias aplicações de rastreamento (por exemplo, DeepLabCut, SLEAP, etc.), oferece uma estrutura acessível e de baixo custo para capturar vídeo e gerar dados de séries temporais das interações sociais dos peixes-zebra.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Christopher Newport University (Protocolo #2025-23).

1. Animais

  1. Obtenha adultos de peixe-zebra selvagem de nadadeira curta 23,36,37, embora outras cepas possam ser usadas. Alternativamente, obtenha embriões e crie-os internamente.
  2. Aloje os peixes em aquários independentes de 10 galões (38 L) com densidade de aproximadamente dois peixes por galão (3,8 L) de água. Equipe tanques com biofiltros ativos, pedras de ar e aquecedores submersíveis. Alternativamente, peixes domésticos em um sistema de suporte aquático.
  3. Manter parâmetros de qualidade da água dentro das seguintes faixas: pH 7,0–8,0, condutividade 400–700 μS, temperatura 25–27 °C, <40 ppm de nitratos, <0,2 ppm de nitritos e 0,01–0,1 ppm de amônia.
  4. Mantenha os animais sob um fotoperíodo escuro de 12 horas por luz e 12 horas e alimente-se uma vez ao dia com lascas comerciais.
  5. Selecione animais aleatoriamente desses tanques para atribuição experimental.
  6. Ao concluir o experimento, reaproveite os animais para outros fins de pesquisa/ensino, ou eutanasie-os por imersão em tricaína tamponada de 250-500 mg/mL por 30 minutos, seguida de um método físico (por exemplo, decapitação) para garantir a morte. Use os animais eutanasiados para bioensaios subsequentes e/ou análises neuroquímicas.

2. Aparelho e software de tarefa de 3 câmaras para banho livre e natação livre

  1. Construção de câmaras de teste
    1. Remova cuidadosamente o acabamento plástico do fundo de cada aquário de 5,5 galões. Use uma ferramenta rotativa com uma roda de corte para cortar o plástico nos cantos e facilitar a remoção. Depois que o acabamento plástico for cortado, separe o plástico do adesivo de silicone com uma espátula comum.
    2. Para dissipar a iluminação de fundo, cubra a parte de trás dos três tanques, a extremidade esquerda de um tanque e a extremidade direita do outro tanque com o revestimento branco adesivo da prateleira. Deixe as extremidades abertas no tanque que será usado como câmara central.
    3. Coloque uma linha preta horizontal para indicar o nível de preenchimento a 4,5 cm abaixo da borda superior na frente de cada câmara com um marcador esmaltado ou com fita gráfica preta para layout.
    4. Corte uma folha de filtro polarizador para encaixar no lado final destapado de cada tanque lateral. Oriente as placas de filtro 90° uma em relação à outra. Use fita transparente ao longo das quatro bordas para evitar que a água entre entre o vidro do aquário e o material filtrante.
      NOTA: A orientação deslocada dos filtros polarizadores impedirá que animais de estímulo em uma câmara lateral vejam os animais (ou outros estímulos) na outra câmara de estímulo lateral, enquanto ainda assim permite que vejam o sujeito. O sujeito no tanque central pode ver os estímulos visuais em ambas as câmaras laterais.
    5. Construa a base de policloreto de vinilo (PVC) para alinhar a posição exata dos tanques na bancada de montagem. Corte a base da base a partir de uma folha branca de PVC de 1/4 de polegada (0,635 cm) de espessura, com 21 cm x 122,5 cm, e corte as peças finais a partir de uma placa de acabamento de PVC 1 x 2, com 21 cm de comprimento.
    6. Teste de ajuste nas extremidades da base com os três tanques posicionados. Garanta a fácil inserção e remoção dos painéis divisores (abaixo) e confirme que os tanques laterais não fiquem muito próximos às laterais do tanque central. Após a conclusão do teste de prova, unam as peças finais à base de PVC com cimento de PVC.
    7. Para fazer as tampas transparentes de cada câmara, corte a folha de policarbonato em três pedaços dimensionados conforme as dimensões externas da borda superior do tanque de 5,5 galões (40 cm × 21 cm). Corte um canal de rabbet (6 mm × 4 mm) ao redor da borda de cada tampa para garantir um posicionamento seguro da tampa no topo da câmara.
    8. Cubra as câmaras com as tampas sempre que animais estiverem presos nas câmaras. Coloque um aquecedor submersível e uma pedra de ar conectada a uma bomba de ar de aquário enquanto os animais são mantidos em suas respectivas câmaras para garantir controle de temperatura e aeração. Use uma válvula de ar de três vias para equilibrar o fluxo de ar entre as três pedras de ar.
    9. Faça divisórias opacas simples para posicionar entre a câmara central e cada câmara lateral para controlar quando os sujeitos de teste recebem exposição visual a estímulos sociais, laminando duas folhas de papel cartão A4 de cor clara.
    10. Prepare os divisores para pendurar e remover remotamente, perfurando dois furos de 85 mm e 125 mm ao longo de uma das bordas de 210 mm de cada folha laminada.
    11. Corte dois comprimentos de 75 cm de barbante de alta resistência, passe o barbante por cada orifício e amarre as extremidades restantes juntas, conectando as duas folhas em um manche central.
    12. Corte um comprimento de 6 m de barbante. Amarre uma extremidade do barbante de 6 m ao jugo para criar uma linha central amarrada, e enfiar a ponta livre do barbante por uma polia de olho giratório.
    13. Monte a polia de olho giratória no teto, acima do tanque mais central, e certifique-se de que a ponta do barbante fique pendurada do lado de fora do sistema experimental (Figura 1A).
  2. Construção do sistema de iluminação
    1. Faça uma moldura com uma chapa branca de PVC de 1/4 de polegada (0,635 cm) de espessura para a luz do painel. Corte duas peças finais (10 cm × 31,5 cm) e uma parte superior e uma inferior (10 cm × 122 cm). Teste o ajuste das peças da estrutura de forma que o painel se encaixe dentro da estrutura. Depois de testado, unam as peças da estrutura usando cimento de PVC.
    2. Peça para um eletricista qualificado adicionar um cabo de 3 condutores à luz do painel.
    3. Peça para um eletricista qualificado ligar o dimmer deslizante para controlar a tomada de saída na caixa à prova d'água. Conecte a luz do painel nessa tomada.
    4. Ajuste o dimmer deslizante para ajustar o brilho da retroiluminação para 350 lux. Encha as câmaras com água e mova o regulador deslizante para ajustar o brilho na frente das câmaras para 15 lux.
      NOTA: Os pesquisadores devem verificar a iluminação antes, durante e após um estudo para garantir que as configurações de brilho foram mantidas.
  3. Construção da cortina e da moldura da câmera
    1. Monte a bancada de testes com a luz do painel, o painel base do tanque e as três câmaras. Posicione e ajuste os dois postes de lona verticalmente para que cada um caiba perfeitamente do chão ao teto, pelo menos 75 cm da frente dos tanques.
    2. Faça um bolso superior para cada cortina dobrando uma ponta do lençol por mais de 60 cm e costurando um ponto reto a 6 cm da dobra superior para criar um bolso para a peça da moldura deslizar.
    3. Meça as dimensões das seções de união cruzada e estabilizadora para o montamento da estrutura de acordo com a largura e profundidade da área a ser usada para o montagem.
      NOTA: Para a configuração atual no The FishLab, os postes verticais de lona foram colocados a 146,5 cm da parede de fundo, no canto do laboratório. O poste interno da lona está posicionado a 6,5 cm da parede lateral, enquanto o poste externo está posicionado a 142,5 cm da parede lateral.
    4. Corte três seções de conduíte de tubo metálico elétrico (EMT) a 143 cm para serem usados como seções estabilizadoras nas laterais da estrutura. Passe uma seção pelo bolso superior da cortina móvel e posicione-se horizontalmente a 190 cm acima do chão.
    5. Fixe a seção no poste externo da lona com um braçadeiro em T em uma extremidade e o soquete personalizado impresso em 3D na outra extremidade. Prenda o soquete impresso em 3D na parede de trás usando parafusos. Prenda as outras duas seções ao poste interno da lona.
    6. Passe a parte superior pelo bolso superior de uma das cortinas fixas e posicione-a a 190 cm acima do chão. Prenda ao poste interno da lona com um braçadeiro em T em uma extremidade e o outro soquete impresso em 3D na outra extremidade.
    7. Prenda o soquete impresso em 3D na parede lateral usando parafusos. Coloque a seção estabilizadora final 120 cm acima do piso e fixe-a de forma semelhante às outras duas seções estabilizadoras.
    8. Corte outro trecho do eletroduto EMT de 127 cm para ser usado como seção estabilizadora na frente da estrutura. Passe essa seção pelo bolso superior da segunda cortina fixa e fixe-a a 193 cm acima do chão, fixando cada extremidade nos postes da lona usando um braçadeiro em T em cada extremidade.
    9. Corte o restante do eletroduto EMT a 145 cm para ser usado como barra de montagem da câmera. Coloque essa seção horizontalmente a 88 cm acima do chão para alinhar as câmeras com o centro dos tanques. Coloque uma extremidade em um soquete impresso em 3D, que é parafusado na parede, e use as pinças cruzadas personalizadas impressas em 3D para segurar a barra da câmera firmemente contra os postes da lona (Figura 1B).
  4. Construção do sistema de câmeras
    1. Prenda um suporte de câmera na barra da câmera para que os centros horizontal e vertical da câmera se alinhem com os centros horizontal e vertical correspondentes da câmara central.
      NOTA: Câmeras adicionais podem ser instaladas na frente de cada câmara lateral caso os pesquisadores desejem obter vídeo digital das respostas de animais vivos usadas como estímulos visuais. A configuração mais simples envolve colocar uma única câmera para capturar vídeo da câmara experimental central. Para estímulos sociais ao vivo nas câmaras de estímulo, os pesquisadores também podem desejar coletar vídeos das câmaras.
    2. Monte cada câmera no poste roscado de cada suporte. Ajuste cada câmera para que a imagem fique centrada na zona de observação de sua respectiva câmara.
    3. Prenda os cabos USB de cada câmera na barra usando tiras ou abraçadeiras para evitar que os cabos fiquem pendurados, o que pode causar desalinhamento das câmeras.
    4. Corte uma seção de prateleira de arame com 140 cm de comprimento e prenda-a verticalmente na parte externa da frente da moldura para evitar que as câmeras se desalinhem. Monte a "gaiola da câmera" usando grampos em T presos aos postes da lona.
      NOTA: Uma segunda gaiola de câmera pode ser montada no interior do quadro para evitar que as câmeras sejam desalinhadas; Uma pequena seção da grade de arame pode precisar ser removida se a frente das câmeras estiver "enjaulada" para evitar a oclusão das imagens do tanque.
  5. Carregar e configurar software de aquisição - Open broadcaster studio (OBS)
    1. Baixe o OBS e instale-o em um computador local operado com Windows. Inicie o OBS Studio e execute o Assistente de Configuração Automática para otimizar as configurações para as necessidades específicas de gravação, recursos de hardware e condições de rede.
      NOTA: Esta ferramenta está disponível em Ferramentas > Assistente de Configuração Automática.
    2. Verifique as configurações básicas antes de configurar a câmera. Defina a resolução base (tela) para corresponder à resolução da tela e ajuste a resolução de saída (escalada) para a resolução de gravação (por exemplo, 720 pixels).
    3. Crie uma cena clicando com o botão direito na caixa Cenas (ou use a cruz na parte inferior). Atribua um nome à cena. Use a cena para definir o layout do stream.
    4. Adicione uma nova fonte clicando com o botão direito na caixa Fontes (ou use o símbolo mais na parte inferior). Selecione Dispositivo de Captura de Vídeo para adicionar uma webcam. Atribua a cada câmera um nome distinto (por exemplo, "câmera-esquerda", "câmera-centro", "câmera-direita"). Repita esse processo para obter câmeras ou fontes adicionais conforme necessário.
    5. Posicione e redimensione as fontes na janela de visualização. Certifique-se de que a câmera está visível confirmando que está listada acima de outras fontes na lista de Fontes . Para centralizar a visão da câmera na tela, selecione a fonte na lista de Fontes (uma caixa delimitadora vermelha aparecerá) e pressione CTRL+D (Centro para a Tela).
    6. Preencha toda a tela com uma fonte pressionando CTRL+F (ajustar à Tela) ou CTRL+S (esticar para a Tela), se desejar. Recorte a fonte segurando a tecla Alt enquanto arrasta a caixa delimitadora. Verifique o corte verificando se as bordas ficaram verdes.
    7. Ajuste propriedades de vídeo, como brilho e contraste, clicando duas vezes na câmera selecionada na lista de Fontes e selecionando Configurar Vídeo. Modificar configurações usando o menu de propriedades .

3. Testes comportamentais

  1. Aclimatação
    1. Encha as 3 câmaras com água dos tanques de alojamento. Coloque barreiras opacas entre cada câmara e deixe-as no lugar durante todo o período de aclimatação. Transfira um sujeito para a câmara experimental central e permita que ele se aclimate por pelo menos 1 hora antes do teste.
      NOTA: O período de aclimatação para os resultados representativos foi fixado em 3 horas. O período de aclimatação é necessário para que os animais se recuperem de qualquer estresse momentâneo de transferência e se ajustem ao ambiente da câmara antes dos testes comportamentais.
    2. No início do período de aclimatação, coloque os estímulos sociais nas câmaras de estímulo laterais. Centralize os estímulos sociais artificiais na câmara de estímulo esquerda e transfira um pequeno cardume de 4 peixes (2 machos e 2 fêmeas de tamanho, idade e familiaridade semelhantes) para a câmara de estímulo direita.
      NOTA: As posições dos estímulos sociais artificiais e dos estímulos sociais ao vivo foram fixas e não contrabalançadas no protocolo atual, já queestudos anteriores 33,34 não detectaram efeito da posição do estímulo usando o OTFST. Contrabalançar nesse caso exigiria dobrar desnecessariamente o número de animais usados para pesquisa, o que é contrário aos "3R" da pesquisa animal. Este protocolo oferece flexibilidade quanto à natureza dos estímulos a serem testados, por exemplo, modelos estáticos, espécies simpátricas ou novas, etc.
    3. Durante a aclimatação, forneça a todas as câmaras contendo animais vivos com um aquecedor submersível (ajustado a 26 °C), uma pedra borbulhadora conectada à bomba de ar do aquário e uma tampa do tanque para manter condições estáveis de armazenamento. Remova os aquecedores e as pedras de bolha antes de iniciar uma sessão experimental.
  2. Testes experimentais
    1. Verifique o status de atividade dos estímulos sociais testados em cada um dos tanques laterais e do sujeito de teste no tanque central. Use a única câmera no tanque central para gravar vídeo de cada cobaia.
      NOTA: Os resultados representativos deste protocolo são uma replicação de uma única condição de Velkey et al.33 para testar a preferência dos peixes-zebra entre estímulos sociais de baixa fidelidade (modelos móveis) e alta fidelidade (cardume vivo).
    2. Abra o OBS Studio para começar a gravar uma sessão. Redimensione a visão central da câmera para preencher a tela clicando e arrastando os cantos do vídeo. Selecione Iniciar Gravação em Controles , no canto inferior direito da tela.
    3. Imediatamente após o início da gravação, remova as barreiras opacas pelo sistema de polias-cordas. Continue gravando por 10 minutos e permita que o sujeito tenha exposição simultânea a ambos os estímulos sociais enquanto se move livremente dentro da câmara experimental central.
    4. Termine a sessão selecionando Parar a Gravação em Controles. Acesse as sessões gravadas selecionando Arquivo no menu superior esquerdo e selecionando Mostrar Gravações no menu suspenso.
      NOTA: Os vídeos resultantes fornecem dados não estruturados adequados para uma variedade de análises.
    5. Transfira peixes vivos para os aquários, remova a água das três câmaras, enxágue bem com água (evite que entre os filmes polarizados fique com água), borrife cada câmara com ácido cítrico a 5% para higienizar, deixe as câmaras secarem ao ar livre durante a noite e enxágue no início do próximo dia experimental antes de ser colocada novamente na bancada de teste.

4. Obtenção de dados estruturados para análises

  1. Selecione um aplicativo de software de análise de movimento (por exemplo, DeepLabCut; veja https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut). Instale o DeepLabCut no computador, seguindo o guia do usuário em https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html. Consulte as informações e o guia do usuário do software selecionado para mais instruções caso não esteja usando o DeepLabCut.
  2. Coloque quatro a cinco vídeos no DeepLabCut para treinamento de modelos e extraia 20–30 quadros por vídeo. Defina pelo menos três pontos principais de rastreamento (por exemplo, cabeça, tronco, cauda) e treine a rede para rastrear esses pontos através de quadros.
    NOTA: Para mais informações, consulte o guia do usuário do DeepLabCut em https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html. Os resultados representativos usam 22 quadros rotulados de cinco vídeos com 3 pontos de rastreamento.
  3. Use uma rede neural baseada em ResNet-101 para treinar o modelo. Determine o número de iterações necessárias para completar o treinamento (sugere-se entre 100.000 e 200.000). Determine um valor de corte p entre 0,5 e 1.
    NOTA: Para os resultados representativos, 150.000 iterações foram usadas para treinar o modelo com um corte p de 0,7. Se a rede treinada cair abaixo do corte de 0,7 p, aumentar o contraste do vídeo ou alterar a convenção de rotulagem resolverá esse problema.
  4. Implante o modelo DeepLabCut totalmente treinado nos vídeos experimentais restantes. Extraia dados posicionais de cada ensaio. Siga o guia do usuário em https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html.
    NOTA: Para os resultados representativos, validamos com 2 embaralhamentos e determinamos que o erro de teste foi 2 pixels:train 4 pixels (com tamanho de imagem de 1600 x 820 pixels). A rede foi então usada para analisar os vídeos experimentais obtidos a partir do atual sistema experimental.
  5. Use softwares de programação, como Python, para definir e analisar o movimento nas três zonas verticais da arena de largura igual para quantificar a preferência. Meça o tempo na zona por pelo menos dois pontos do corpo dentro da zona identificada para reduzir o ruído de rastreamento. Use a fórmula: Tempo total na zona = (Total de quadros na zona)/(Total de quadros).
  6. Se se desejar uma medida de tigrotaxa, quantifique as zonas pelo comprimento total do corpo de um peixe-zebra a partir das paredes do aquário, o que fornecerá uma medida da tendência passiva dos sujeitos de permanecerem próximos a uma fronteira vertical. Essa medida é mais apropriada para tanques experimentais relativamente maiores.
  7. Use o mesmo software de codificação para definir e medir o tempo imóvel (por exemplo, congelamento). Defina o limite de movimento em 2–5 pixels por quadro, com um número mínimo de quadros consecutivos de 15 quadros.
    NOTA: Para os resultados representativos, o congelamento foi identificado com um limite de 3 pixels por quadro para 15 quadros.
  8. Compilar e exportar medidas para análise estatística e visualizações.
    NOTA: Para análise de dados, consulte https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts. Nós

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Resultados

Para validar os métodos de baixo custo descritos acima, uma condição dos experimentos realizados em Velkey et O AL.33 foi replicado usando a configuração atual de baixo custo. Os participantes (N = 23, 11 homens e 12 mulheres) foram apresentados aos estímulos sociais móveis artificiais móveis (baixa fidelidade) à esquerda e aos estímulos sociais vivos em banco (alta fidelidade) à direita (Figura 2); como estudos anteriores

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Discussão

O protocolo atual demonstra que a adaptação de baixo custo do OTFST de 3 Câmaras pode ser usada para caracterizar de forma confiável a preferência social em peixes-zebra adultos, medida pelo tempo passado na zona. Utilizando materiais de construção baratos, uma webcam conectada por USB e aplicativos de software de aquisição e análise de código aberto, o sistema atual replicou com sucesso a descoberta de que peixes-zebra preferem um cardume de conspecípicos vivos a modelos móveis de menor...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação de dados; na redação do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer a Rommel Pagkalinawan, Robby Buck, Elizabeth Hiltz, Haley Dewitt, Maia Tankersley, Alexis Thai-Nguyen, Grady Fleming, Jacob Young e Jack Medlin, da equipe TheFishLab da Christopher Newport University, por suas contribuições à criação de animais e à coleta de dados para o experimento de validação. Os autores também desejam agradecer a Samantha Commons por sua ajuda durante o Programa de Capitães Comunitários de Verão 2025, incluindo a realização do inventário de todos os componentes do sistema de alto custo existente, bem como do sistema de baixo custo. Os autores também gostariam de agradecer ao Escritório de Pesquisa e Atividade Criativa Estudantil da Christopher Newport University pelo financiamento fornecido a K.K. pelo Programa de Bolsas de Verão de Graduação. A Figura 2 foi criada em BioRender por Kinslow, K. (2025). https://BioRender.com/wbf0wph.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10-Gallon AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100110010comprado em pet shop local (1 a 4)
12 Pieces 1-inch T-Pipe ClampsJoyHua Trade, ChinaASIN #B0DF19DJF1comprado na Amazon.com (1)
2-gang electrical boxSigma Engineered Solutions, Raleigh, NC, USA# 14350comprado em loja de ferragens local (1)
3/4" Silver-Metallic electrical metallic(EMT) Conduit - 10-footWheatland Tube, Inc., Wheatland, PA, USA #0550110000comprado em loja de ferragens local (3)
3-conductor cordUtilitech, Inc., Charlotte, NC, USAUT010710comprado em loja de ferragens local (1)
3-prong receptacleEaton, Inc., Beachwood, OH, USA#270W-SP-LWcomprado em loja de ferragens local (1)
3-way Air ValvePenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModel VN3comprado em pet shop local (1)
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Referências

  1. Seo, H., Lee, D. Neural basis of learning and preference during social decision-making. Curr Opin Neurobiol. 22 (6), 990-995 (2012).
  2. Bray, J., et al. Social bonds predict dominance trajectories in adult male chimpanzees. Anim Behav. 179, 339-354 (2021).
  3. Tibbetts, E. A., Pardo-Sanchez, J., Weise, C. The establishment and maintenance of dominance hierarchies. Philos Trans R Soc B. 377 (1845), 20200450(2022).
  4. Chase, I. D., Tovey, C., Spangler-Martin, D., Manfredonia, M. Individual differences versus social dynamics in the formation of animal dominance hierarchies. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (8), 5744-5749 (2002).
  5. DeLorey, T. M., et al. Gabrb3 gene deficient mice exhibit impaired social and exploratory behaviors, deficits in non-selective attention and hypoplasia of cerebellar vermal lobules: a potential model of autism spectrum disorder. Behav Brain Res. 187 (2), 207-220 (2008).
  6. Lee, J., Green, M. F. Social preference and glutamatergic dysfunction: underappreciated prerequisites for social dysfunction in schizophrenia. Trends Neurosci. 39 (9), 587-596 (2016).
  7. Fortier, A. V., et al. Prefrontal circuits guiding social preference: implications in autism spectrum disorder. Neurosci Biobehav Rev. 141, 104803(2022).
  8. Weiner, J. Social Relationships of Individuals with ADHD Across the Lifespan. Clinical Handbook of ADHD Assessment and Treatment Across the Lifespan. Matson, J. , Springer. Cham. (2023).
  9. Toth, I., Neumann, I. D. Animal models of social avoidance and social fear. Cell Tissue Res. 354, 107-118 (2013).
  10. Guo, M., Sun, L. From rodents to humans: rodent behavioral paradigms for social behavioral disorders. Brain Circ. 9 (3), 154-161 (2023).
  11. Geng, Y., Peterson, R. T. The zebrafish subcortical social brain as a model for studying social behavior disorders. Dis Model Mech. 12 (8), dmm039446(2019).
  12. Ogawa, S., Pfaff, D. W., Parhar, I. S. Fish as a model in social neuroscience: conservation and diversity in the social brain network. Biol Rev. 96 (3), 999-1020 (2021).
  13. Moss, S. M. Notes on the habits of a domesticated white rat, and a terrier dog (Flora), that lived in harmony together. Mag Nat Hist. 9, 182-185 (1836).
  14. Kietzman, H. W., Gourley, S. L. How social information impacts action in rodents and humans: the role of the prefrontal cortex and its connections. Neurosci Biobehav Rev. 147, 105075(2023).
  15. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 201-211 (2013).
  16. Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), (2004).
  17. Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Curr Protoc Neurosci. 56, 8.26.1-8.26.16 (2011).
  18. Zhao, C., Gammie, S. C. The circadian gene Nr1d1 in the mouse nucleus accumbens modulates sociability and anxiety-related behaviour. Eur J Neurosci. 48 (3), 1924-1943 (2018).
  19. Arakawa, H. Revisiting sociability: factors facilitating approach and avoidance during the three-chamber test. Physiol Behav. 272, 114373(2023).
  20. Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 10 (4), 248-258 (2004).
  21. Ehninger, D., et al. Gestational immune activation and Tsc2 haploinsufficiency cooperate to disrupt fetal survival and may perturb social behavior in adult mice. Mol Psychiatry. 17 (1), 62-70 (2012).
  22. Ward, A. J. W., Kent, M. I. A., Webster, M. M. Social recognition and social attraction in group-living fishes. Front Ecol Evol. 8, 15(2020).
  23. Gerlai, R. Misbehaving fish: the role of these simple vertebrates in the analysis of human brain function and dysfunction. Brain Res. 1863, 149795(2025).
  24. Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
  25. Faustino, A. I., Tacão-Monteiro, A., Oliveira, R. F. Mechanisms of social buffering of fear in zebrafish. Sci Rep. 7, 44329(2017).
  26. Akinrinade, I. D., Varela, S. A. M., Oliveira, R. F. Sex differences in social buffering and social contagion of alarm responses in zebrafish. Anim Cogn. 26 (4), 1307-1318 (2023).
  27. Ariyasiri, K., et al. Pharmacological (ethanol) and mutation (sam2 KO) induced impairment of novelty preference in zebrafish quantified using a new three-chamber social choice task. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 88, 53-64 (2018).
  28. Angiulli, E., et al. Increase in environmental temperature affects exploratory behaviour, anxiety and social preference in Danio rerio. Sci Rep. 10 (1), 5385(2020).
  29. Lindeyer, C. M., et al. Nonapeptide influences on social behaviour: effects of vasotocin and isotocin on shoaling and interaction in zebrafish. Behaviour. 152 (7-8), 897-915 (2015).
  30. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Sci Rep. 10 (1), 5435(2020).
  31. Aslanzadeh, M., et al. The body size of stimulus conspecifics affects social preference in a binary choice task in wild-type, but not in dyrk1aa mutant, zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 262-267 (2019).
  32. Ribeiro, D. Oxytocin receptor signalling modulates novelty recognition but not social preference in zebrafish. J Neuroendocrinol. 32 (4), e12834(2020).
  33. Velkey, A. J., et al. High fidelity: assessing zebrafish (Danio rerio) responses to social stimuli across several levels of realism. Behav Processes. 164, 100-108 (2019).
  34. Velkey, A. J., Koon, C. H., Danstrom, I. A., Wiens, K. M. Female zebrafish (Danio rerio) demonstrate stronger preference for established shoals over newly-formed shoals in the three-tank open-swim preference test. PLoS One. 17 (9), e0265703(2022).
  35. Velkey, A. J., et al. Zebrafish (Danio rerio) prefer undisturbed shoals over shoals exposed to the synthetic alarm substance hypoxanthine-3N-oxide (C5H4N4O2). Biology. 14 (3), 233(2025).
  36. Canzian, J., Fontana, B. D., Quadros, V. A., Rosemberg, D. B. Conspecific alarm substance differently alters group behavior of zebrafish populations: putative involvement of cholinergic and purinergic signaling in anxiety- and fear-like responses. Behav Brain Res. 320, 255-263 (2017).
  37. Do Nascimento, B. G., Maximino, C. Social investigation and social novelty in zebrafish: roles of salience and novelty. Behav Processes. 210, 104903(2023).
  38. Bolgan, M., O’Brien, J., Gammell, M. The behavioural repertoire of Arctic charr (Salvelinus alpinus (L.)) in captivity: a case study for testing ethogram completeness and reducing observer effects. Ecol Freshw Fish. 25 (2), 318-328 (2016).
  39. Thomsen, H., Jensen, T. H., Ydesen, K., Madsen, N. Use of ethograms to analyse shoaling behaviour of mackerel (Scomber scombrus) in an aquarium. Genet Biodivers J. , (2020).
  40. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods Ecol Evol. 9 (3), 460-464 (2018).
  41. Pereira, T. D., et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 19 (4), 486-495 (2022).
  42. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  43. Gerlai, R. Social behavior of zebrafish: from synthetic images to biological mechanisms of shoaling. J Neurosci Methods. 234, 59-65 (2014).
  44. Collar, D. C., Thompson, J. S., Ralston, T. C., Hobbs, T. J. Fast-start escape performance across temperature and salinity gradients in mummichog Fundulus heteroclitus. J Fish Biol. 96 (3), 755-767 (2020).
  45. Collar, D. C., Hobbs, T. J., Thompson, J. S. Scaling of fast-start performance and its thermal dependence in mummichog Fundulus heteroclitus. J Fish Biol. 104 (3), 611-623 (2024).
  46. Collar, D. C., Stanley, K. L., Thompson, J. S. Fast-start performance and its dependence on temperature and salinity in sheepshead minnow (Cyprinodon variegatus). Environ Biol Fishes. 108 (10), 1515-1530 (2025).

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