Câncer de Mama Intracraniano Metastasse Cerebral Modelo de Camundongo para Caracterização de Células Imunes e Estromais em Meninges e Bulbo Olfatório

Resumo

O protocolo estabelece metástases cerebrais do câncer de mama por meio de inoculação intracraniana e caracterizar, por citometria de fluxo, subconjuntos linfáticos e imunológicos que regulam a imunidade cerebral. Essas análises fornecem insights sobre a dinâmica imune e das células estromais que moldam o microambiente cerebral, informando o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Resumo

O sistema nervoso central (SNC) é cercado por interfaces imunes especializadas, incluindo as meninges e o bulbo olfativo, que podem servir tanto como vias permissivas para a colonização metastática quanto como pontos de entrada para respostas imunes antitumorais. Compreender como a dinâmica das células imunes evolui dentro dessas estruturas durante a progressão metastática é essencial para identificar mecanismos que apoiam ou restringem o crescimento tumoral no cérebro. Este protocolo detalha o estabelecimento de um modelo de camundongos de metástases cerebrais para câncer de mama (BCBM) por meio da injeção intracraniana de células de câncer de mama E0771 em camundongos C57BL/6. Após o desenvolvimento do tumor, as meninges e o bulbo olfatório são cuidadosamente dissecados, digeridos enzimaticamente e processados em suspensões unicelulares. Essas populações são então analisadas usando citometria de fluxo espectral multiparamétrico para caracterizar de forma abrangente subconjuntos de células linfoides, mieloides e estromais dentro dos nichos imunes associados ao SNC. Esse fluxo de trabalho permite análises comparativas entre controles portadores e não tumorais, identificando alterações nas interfaces imunes do SNC que podem estar na base da evasão imune tumoral e representar potenciais alvos terapêuticos. No geral, o protocolo oferece uma abordagem reprodutível para estudar o BCBM e interrogar a regulação imune nas interfaces entre o sistema imunológico SNC e o sistema imunológico periférico. Ele pode ser adaptado para linhas celulares cancerígenas adicionais, imunoterapias ou modelos genéticos de camundongos para investigar mecanismos de resistência imunológica e resposta terapêutica no microambiente cerebral.

Introdução

Metástases cerebrais são os tumores malignos mais comuns que afetam o sistema nervoso central (SNC), ocorrendo com mais frequência do que tumores cerebrais primários. Câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma são os principais cânceres que mais frequentemente metastatizam para o cérebro¹. Entre essas, as metástases cerebrais por câncer de mama (BCBM) representam um grande desafio clínico, afetando 10%–30% dos pacientes com doença metastática e apresentando incidência crescente devido à melhoria das terapias sistêmicas e avanços em^{neuroimagem 2}. O prognóstico para pacientes com BCBM continua ruim, pois os tratamentos disponíveis – incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia – são em grande parte paliativos, e os sintomas neurológicos impactam severamente a qualidade^{de vida 3}. Embora terapias direcionadas e imunoterapias estejam sendo exploradas como estratégias complementares, o benefício clínico da imunoterapia em metástases cerebrais permanece limitado ^4,5,6.

Trabalhos recentes refinaram nossa compreensão da imunidade cerebral e renovaram o interesse em vias linfáticas funcionais associadas ao SNC, incluindo vasos linfáticos nas meninges⁷ e na mucosa^{nasal 8}. Essas estruturas formam uma rede linfática contínua ao redor do cérebro e se estendendo ao lado do bulbo olfatório e da placa cribriforme, conectando-se finalmente aos linfonodos cervicales. Esse sistema desempenha papéis-chave na homeostase dos fluidos, vigilância imune e tráfico celular imunológico entre o SNC e os órgãos linfoides^{periféricos.} À medida que cresce o interesse em abordagens imunoterapêuticas para tumores cerebrais e metástases, essas interfaces linfático-imunes estão emergindo como rotas promissoras, embora ainda pouco estudadas, pelas quais a imunidade sistêmica pode se comunicar com lesões intracranianas. Além disso, os mecanismos que governam o recrutamento de células imunológicas no microambiente tumoral cerebral e como essas células interagem nesse ambiente único continuam sendo pouco compreendidos. Juntas, essas lacunas ressaltam a necessidade de modelos pré-clínicos e procedimentos que permitam uma análise abrangente das interações tumor-imune e apoiem o desenvolvimento de estratégias para melhorar a imunidade antitumoral contra metástases cerebrais.

Aqui, descrevemos um protocolo que combina a geração de um modelo de camundongo BCBM reprodutível e imunocompetente por meio da inoculação intracraniana estereotáxica de células E0771 com o isolamento e dissociação das meninges e do bulbo olfatório para imunofenotipagem por citometria de fluxo espectral. Essa abordagem permite a modelagem controlada da BCBM para avaliar a segurança e eficácia das intervenções terapêuticas e possibilita caracterização aprofundada das populações imunes e estromais na interface cérebro-linfático-imune, fornecendo insights sobre os atores celulares que moldam o microambiente tumoral cerebral e influenciam as respostas de tratamento.

Modelos animais continuam sendo indispensáveis para o estudo das metástases cerebrais, pois muitos aspectos críticos da progressão metastática não podem ser replicados in vitro. Vários modelos de camundongos in vivo foram desenvolvidos para gerar metástases cerebrais, cada um com vantagens e limitações específicas¹⁰. Modelos de metástase espontânea, incluindo implantação ortotópica ou modelos de camundongos geneticamente modificados, imitam de forma mais próxima a progressão clínica da doença, mas raramente geram lesões intracranianas, exigem longos períodos experimentais e frequentemente apresentam alta variabilidade devido à doença extracraniana generalizada. Abordagens sistêmicas, incluindo injeções intracardíacas, intracarótidas ou nas veias caudais, introduzem células tumorais na circulação e imitam melhor a disseminação hematogênica, extravasamento da barreira hematoencefálica e colonização. No entanto, esses modelos não capturam as etapas iniciais da invasão tumoral primária e frequentemente produzem metástases extracranianas extensas e variáveis, especialmente nos pulmões. Entre os modelos sistêmicos, a injeção intracarótida apresenta a menor variabilidade, mas requer expertise cirúrgica avançada. Alternativamente, a injeção intracraniana oferece várias vantagens, incluindo controle preciso sobre a localização do tumor, desenvolvimento rápido e reprodutível do tumor e redução da variabilidade entre os experimentos. Essa abordagem também pode ser complementada por implantação tumoral primária ortotópica seguida de resseção cirúrgica para imitar com mais precisão o curso metastático. Embora a injeção intracraniana não recapitule toda a cascata metastática e não seja adequada para estudar invasão e disseminação precoce, ela fornece um modelo robusto para avaliar a eficácia terapêutica contra lesões estabelecidas e para investigar interações no microambiente cerebral. Uma limitação conhecida é que a própria injeção pode induzir neuroinflamação local, potencialmente influenciando as leituras imunes, que podem ser avaliadas comparando perfis imunes em camundongos injetados e não injetados.

A caracterização imune das meninges e do bulbo olfatório continua sendo uma área de pesquisa relativamente nova e pouco explorada. A maioria dos estudos se baseia em amostras de linfonodos cerebrais inteiros ou^{cervicais 11}, que não capturam a composição celular distinta e as funções imunes especializadas desses tecidos associados ao linfático. A recuperação de ambas as estruturas oferece uma visão mais ampla e informativa da imunidade cerebral. Quando combinado com citometria de fluxo espectral multiparamétrico, esse fluxo de trabalho suporta o perfil de alto rendimento de populações de células imunes abundantes e raras envolvidas na comunicação imune SNC-periferia. Isso inclui a quantificação de marcadores de superfície e intracelulares para identificar subconjuntos celulares, avaliar estados de ativação e avaliar mudanças induzidas pelo tratamento. Outras metodologias para análise imune do SNC não cobertas por este protocolo incluem imunohistoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF), que preservam a distribuição espacial das células imunes, mas são limitadas pela multiplexação de baixos marcadores, quantificação subjetiva e sub-representação dos raros tipos^{celulares 12}. Mais recentemente, o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) expandiu a capacidade de perfilar populações imunes do SNC ao possibilitar a descoberta de estados celulares e programas transcricionais em alta resolução. Apesar de oferecer um insight transcriptômico poderoso, o scRNA-seq é limitado pelo custo, artefatos de dissociação, perda de transcritos e perda de resolução em nível^{proteico 13,14}. A citometria de fluxo, embora não possua análise espacial e seja sensível a efeitos relacionados à dissociação, oferece resolução fenotípica superior por meio de um painel multiparamétrico avançado e proporciona um perfil imunológico quantitativo robusto.

Juntas, as metodologias descritas aqui fornecem uma plataforma flexível e poderosa para modelar a BCBM e analisar a dinâmica imune nas interfaces linfáticas do SNC, apoiando o desenvolvimento pré-clínico de terapias que visam tanto o microambiente do tumor cerebral quanto suas vias reguladoras imunológicas associadas.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Os protocolos foram revisados e aprovados pela autoridade portuguesa competente para proteção animal, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Referência 0421/000/000/2021).

1. Preparação de células E0771 para implantação in vivo

1. Em um capuz estéril, cultive células E0771 em um frasco T75 usando o Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) de penicilina e estreptomicina (PEST).
   1. Certifique-se de que as células sejam autenticadas por perfil STR ao receberem pelo fornecedor e confirmadas como livres de micoplasma por meio de testes de rotina. Cultive células tumorais para pelo menos 2 a 8 passagens após o descongelamento antes do implante cerebral.
2. No dia da implantação, certifique-se de que as células estejam saudáveis e 80-90% confluentes. Remova o meio e lave as células com soro tampão fosfatado (PBS).
3. Adicione tripsina ao cantil e incube por 5 minutos a 37 °C. Depois, adicione três vezes o volume do meio suplementado (DMEM com 10% de FBS v/v e 1% v/v PEST) para neutralizar a tripsina e dissociar células.
4. Transfira as células para um tubo e centrifuge a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT). Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet no PBS para contagem celular.
5. Centrifuge novamente (300 x g por 5 min), descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em PBS a uma concentração de 1 x 10⁵ células de E0771 em 2 μL por animal. Mantenha a suspensão celular no gelo até a inoculação contra tumores. Prepare a suspensão celular imediatamente antes da injeção.

2. Inoculação contra tumor intracraniano usando aparelho estereotáxico

1. Obtenha fêmeas C57BL/6 camundongos (6-8 semanas de idade) e aclimate-os à instalação veterinária por pelo menos 7 dias antes da cirurgia. Mantenha os camundongos domésticos sob condições controladas com um ciclo de 12 horas luz/escuro e forneça alimento e água ad libitum.
   NOTA: Recomenda-se um mínimo de cinco animais por grupo experimental para garantir poder estatístico suficiente para um perfil imunológico comparativo significativo entre condições tumorais e de controle.
2. Prepare o campo cirúrgico e todos os materiais necessários antes de iniciar o procedimento:
   1. Instrumentos cirúrgicos: lâminas de bisturi, tesoura, pinças, suportes de agulha, fio de sutura.
   2. Equipamentos e outros: instrumento estereotáxico, seringa de vidro, furadeira, barbeadora, cotonetes, almofada térmica.
   3. Anestesia: Prepare cetamina-xilazina (K-X) (25 mg/mL e 2 mg/mL, respectivamente) em PBS em um tubo de 15 mL.
   4. Analgesia: Prepare buprenorfina a 15 μg/mL em PBS em um tubo de 15 mL.
   5. Outras soluções: povidona-iodo, peróxido de hidrogênio 3% v/v (_{H 2O 2}), pomada oftálmica.
      ATENÇÃO: H_2O2 é prejudicial se ingerido e pode causar irritação na pele.
3. Anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de K-X (100 μL por 10 g de peso corporal). Confirme anestesia adequada pela ausência de resposta ao aperto do dedo do pé.
4. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a desidratação e coloque o rato sobre uma almofada térmica durante todo o procedimento.
5. Raspe o couro cabeludo e desinfete a área cirúrgica com povidona-iodo. Faça uma incisão longitudinal de 1 cm ao longo da linha média para expor o crânio.
6. Limpe o crânio exposto com_H2O2 usando um cotonete em movimento circular para visualizar o bregma. Se houver espuma excessiva, remova-a com um cotonete seco.
7. Posicione o mouse no quadro estereotáxico. Defina a bregma como ponto de referência (0,0) e meça 2,5 mm lateral e 0,5 mm anterior à bregma. Marque o local da injeção.
8. Remova o rato e faça um pequeno furo nas coordenadas marcadas. Evite furar muito fundo para evitar danos cerebrais.
9. Monte a seringa no injetor. Ressuspenda as células e carregue a seringa de vidro com volume suficiente para duas injeções (4–5 μL). Não prepare mais de duas injeções por vez para evitar a sedimentação celular.
10. Reposicione o mouse no estereotáxico, alinhe a agulha com o orifício e desça lentamente até uma profundidade de 3,0 mm dentro do parênquima cerebral. Injete células (ou PBS estéril para controle simulado) a 1 μL/min.
11. Após a injeção, mantenha a agulha no lugar por pelo menos 1 minuto, retraia 1,5 mm, segure por mais um minuto e depois retire completamente. Isso minimiza o refluxo e garante a deposição celular adequada.
12. Feche a incisão com pontos e aplique povidona-iodo. Administrar buprenorfina (100 μL) por via subcutânea.
13. Mantenha o rato em uma almofada térmica até a recuperação total da anestesia. Coloque o rato de volta em uma gaiola limpa e monitore diariamente para desconforto, sinais neurológicos ou infecção.

3. Perfusão intracardíaca de camundongos

1. Anestesiar camundongos por injeção de K-X (100 μL por 10 g de peso corporal). Confirme anestesia adequada pela ausência de resposta ao aperto do dedo do pé.
2. Usando tesoura, faça uma incisão de 5–6 cm através da parede abdominal e duas incisões pela caixa torácica até a clavícula. Tenha cuidado para não cortar nenhum vaso sanguíneo importante.
3. Com o coração exposto, corte o átrio direito para permitir a circulação sanguínea. Injete PBS gelado no ventrículo esquerdo com uma seringa de 20 mL equipada com uma agulha de 25G × 1 polegada.
4. Pare a perfusão quando o líquido que sai estiver livre de sangue. Para camundongos adultos, leva cerca de 20 mL de PBS.

4. Isolamento das meninges e do bulbo olfatório do camundongo

1. Após a perfusão intracardíaca, decapite o camundongo com tesoura cirúrgica. Remova completamente o couro cabeludo para expor o crânio.
2. Usando tesoura, corte o crânio no plano transversal da região posterior em direção aos olhos, tomando cuidado para não danificar o tecido cerebral subjacente. Extraia suavemente o cérebro usando pinças finas, evitando contato ou raspagem da superfície interna do crânio.
3. Após a remoção cerebral, as meninges durais permanecem presas à superfície interna do crânio. Submerga o crânio em PBS gelado por pelo menos 5 minutos para facilitar a separação intacta das meninges.
4. Disseque o bulbo olfatório da região anterior do cérebro e transfira-o para PBS gelado para armazenamento temporário até o processamento.
5. Usando pinças de ponta fina, desprenda suavemente as meninges da superfície interna do crânio levantando e descolando cuidadosamente a camada fina de tecido. Transfira as meninges para PBS gelado até processamento adicional. Evite rasgar o tecido para garantir uma recuperação celular ideal a jusante.

5. Dissociação de tecidos em células individuais

1. Meninges
   1. Transfira meninges para 3 mL de RPMI 1640 contendo 0,05% de colagênase II e DNase I. Incube por 20 minutos a 37 °C, agitando suavemente a cada 10 minutos. A digestão excessiva reduz a viabilidade celular e deve ser evitada.
   2. Passe o tecido digerido por um filtro de células de 40 μm para um tubo de 50 mL. Dissocie mecanicamente o tecido restante pressionando suavemente um êmbolo de seringa contra o peneiro e lave com 5 mL de PBS.
   3. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 3 mL de PBS.
   4. Repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante, resuspenda o pellet final no volume restante e transfira para uma placa U-bottom de 96 poços.
2. Bulbo olfativo
   1. Remova o PBS e dissocie mecanicamente o tecido usando um desentupidor de seringa. Adicione uma solução digestiva de 3 mL contendo 0,02% de colagênase II na solução salina balanceada de Hanks (HBSS). Incube por 20 minutos a 37 °C, agitando suavemente a cada 10 minutos.
   2. Passe a suspensão da célula por um filtro de 70 μm para um tubo de 50 mL e lave com PBS de 10 mL.
   3. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet final no volume restante. Transfira para uma placa de 96 poços no fundo do fundo.
3. Guarde as placas a 4 °C até que fiquem manchadas.
   NOTA: Realize a coloração no mesmo dia para garantir a viabilidade ideal das células.

6. Coloração celular e aquisição por citometria de fluxo

1. Design dos painéis
   1. Por favor, veja a Tabela 1.
      NOTA: O painel deste protocolo foi projetado para um citometro de fluxo espectral equipado com 4 lasers (violeta, azul, amarelo-esverdeado e vermelho) e um total de 51 detectores (48 canais de fluorescência + 3 de dispersão). O painel precisa ser projetado com base na configuração do citômetro de fluxo e nas proteínas/marcadores de interesse.
2. Coloração celular
   1. Centrifuge as placas de 96 poços no fundo em U a 300 x g por 5 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o supernadante. A partir desse passo, proteja as placas da luz.
   2. Adicione um corante de viabilidade de 50 μL (FVD, diluição 1:5000 em PBS) aos poços apropriados e incube por 20 minutos em RT. Lave com 150 μL PBS, centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante. Adicione corante de viabilidade apenas aos controles de viabilidade e amostras.
   3. Bloqueie os receptores Fc incubando células com 30 μL de anticorpo anti-CD16/CD32 (0,01 μg/mL no tampão FACS: PBS com 2 mM de EDTA e 0,5% de BSA) por 10 minutos no gelo. Lave com um tampão FACS de 170 μL, centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
   4. Adicione mistura de anticorpos de 30 μL ou controles de cor única (preparados de acordo com as diluições de anticorpos listadas na Tabela de Materiais, no tampão FACS) e incube por 20 minutos no gelo. Lave com um tampão FACS de 170 μL, centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
   5. Fixe as células com 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 2% (PBS) por 20 minutos em RT. Lave com 100 μL de PBS, centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
      NOTA: Para marcadores intracelulares, substitua essa etapa por fixação e permeabilização usando um conjunto de tampão comercial, depois realize a coloração intracelular antes da resuspensão final.
   6. Resuspenda os pellets de células finais em 200 μL de tampão FACS. Armazene as placas a 4 °C até a aquisição no citômetro de fluxo.
3. Controles de cor única e Fluorescência Menos Um (FMO)
   1. Amostras coloridas por cor única são necessárias para otimização de desmistura. As células são usadas para amostras coloridas por cor única para os marcadores que mostram picos positivos e negativos. Caso contrário, o uso de contas de compensação é preferido e recomendado para obter a melhor desmistura. Prepare esferas de compensação para anticorpos conjugados fluorescentes de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: Preparar controles FMO é um passo importante para alcançar o gate adequado, especialmente para os marcadores que não apresentam picos positivos e negativos claros. Prepare várias amostras de FMO para diferentes fluorocromos conforme necessário.
   2. Prepare amostras de FMO para antígenos de superfície celular seguindo as etapas da Parte 6.2, mas exclua o anticorpo de interesse da mistura de anticorpos na etapa 6.2.4.
4. Aquisição e análise de citometria de fluxo
   1. Ligue o citômetro, inicie o software de aquisição do citometro de fluxo e prepare as esferas de controle de qualidade (QC) (1 gota em PBS de 300 μL) em um tubo de amostra de 12 x 75 mm enquanto a máquina está aquecendo (pelo menos 30 min).
   2. Limpe o instrumento rodando: 3 min 10% v/v de água sanitária, 30 min_{H 2}O com vazão alta. Coloque a vazão de volta para baixa para os próximos passos.
   3. Selecione a aba de controle de qualidade, carregue o tubo e passe as esferas apertando start. Quando o controle de qualidade termina, aparece uma mensagem dizendo "Aprovado".
   4. Vá na aba de aquisição, selecione ou crie o experimento e inicie a aquisição bloqueando células por FSC e SSC. Adquira controles sem mancha e de cor única, execute o assistente de desmixagem e salve as configurações. Prossiga para coletar amostras manchadas.

Resultados

Após a inoculação intracraniana das células E0771, os camundongos desenvolveram uma lesão localizada de câncer de mama nas coordenadas estereotáxicas alvo. As coordenadas estereotáxicas que visam o parênquima estriatal (2,5 mm lateral, 0,5 mm anterior ao bregma e 3,0 mm ventral a partir do bregma) foram selecionadas com base nos atlas cerebrais padrão de camundongos e abordagens de implantação intracraniana previamente^{descritas 15,16}. Essa região é amplamente uti...

Discussão

Ao combinar a implantação de tumor intracraniano com o isolamento, dissociação e caracterização imune das meninges e do bulbo olfatório, esse protocolo permite uma investigação detalhada da interação dinâmica entre o microambiente tumoral cerebral e as interfaces imunes associadas ao SNC. O método proporciona formação reprodutível de tumores intracranianos, suspensões celulares de alta qualidade e resolução robusta de subconjuntos imunológicos. No entanto, a implantação intracraniana con...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgi