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Estabelecimento de um Protocolo Padronizado de Manipulação de Pinçamento da Coluna para um Modelo de Rato de Asma Pediátrica

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DOI:

10.3791/70623

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1 de outubro de 2026

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1College of Acupuncture and Massage, Nanjing University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo padronizado para a manipulação por compressão da coluna vertebral (SP) em um modelo de rato jovem com asma. Este protocolo atenuou a inflamação das vias aéreas, a hiperreatividade e o remodelamento em um modelo de asma induzido por OVA. O estudo pode abrir caminho para a exploração mecanicista e a tradução clínica.

Resumo

A asma é a doença inflamatória crônica das vias aéreas mais prevalente em crianças e é caracterizada por inflamação crônica das vias aéreas, hiperreatividade das vias aéreas (HVA) e remodelação das vias aéreas. Na medicina tradicional chinesa (MTC), a manipulação de pinçamento da coluna (PC) é uma técnica de massagem pediátrica amplamente utilizada para o manejo da asma e outras doenças infantis. Apesar de uma história de uso clínico que abrange mais de 1.000 anos, a PC permanece pouco conhecida fora da China. Além disso, os mecanismos subjacentes à PC ainda não são suficientemente caracterizados. Este artigo descreve um protocolo viável e padronizado para a PC que replica os procedimentos essenciais utilizados na prática clínica. A aplicação do protocolo melhorou a inflamação das vias aéreas, a HVA e a remodelação das vias aéreas em um modelo de rato jovem com asma. Para aumentar a reprodutibilidade, parâmetros procedimentais-chave foram padronizados, incluindo pressão dos dedos, frequência da manipulação, número de repetições e duração da intervenção. O protocolo padronizado neste estudo pode servir como referência para pesquisas futuras sobre a padronização da PC e seus mecanismos subjacentes na asma pediátrica experimental.

Introdução

A asma pediátrica é caracterizada por inflamação crônica das vias aéreas, hiperreatividade das vias aéreas (HRA) e remodelação das vias aéreas1,2. Frequentemente começa na primeira infância e é a doença crônica mais comum entre crianças em idade escolar. Os tratamentos convencionais atuais incluem corticosteroides inalatórios, agonistas dos receptores β₂, antagonistas dos receptores de leucotrienos e terapias biológicas3,4. No entanto, apenas 44,1% das crianças e 55,4% dos adolescentes com asma alcançam controle adequado da doença em todo o mundo5. Além disso, a administração repetida de corticosteroides sistêmicos ou inalatórios pode contribuir para o retardo do crescimento em crianças com asma mal controlada6.

Como uma terapia externa tradicional, a massagem (também conhecida como tuina na China) é econômica, bem tolerada e geralmente considerada segura para crianças. A massagem tem sido usada há muito tempo tanto na China quanto em países ocidentais para a prevenção e tratamento da asma pediátrica7. Revisões sistemáticas e meta-análises relataram resultados favoráveis da terapia de massagem no manejo da asma pediátrica7,8. A manipulação de pinçamento da coluna vertebral (SP) é uma técnica clássica e amplamente praticada na massagem pediátrica chinesa tradicional. De acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa (MTC), a estimulação do Vaso Governador (GV) e dos meridianos da Bexiga (BL) ao longo das costas modula a função dos órgãos Zang-Fu, mantendo assim a homeostase sistêmica e prevenindo ou tratando doenças9,10,11. Estudos anteriores demonstraram que a SP não apenas melhorou os sintomas e sinais atópicos em crianças, mas também reduziu a inflamação crônica das vias aéreas em um modelo de rato jovem com asma12,13,14. Além de seu uso clínico, a SP é comumente praticada como uma intervenção caseira de saúde11,15. Apesar de uma história clínica com mais de mil anos, a SP permanece relativamente desconhecida fora da China, e seus mecanismos subjacentes não foram amplamente investigados. Portanto, modelos animais padronizados são essenciais para elucidar os mecanismos da SP e apoiar sua avaliação e aplicação científicas mais amplas.

Vários estudos estabeleceram protocolos padronizados de massagem para pesquisas com animais. Um estudo anterior desenvolveu um protocolo padronizado de movimentos suaves nas costas ou no abdômen a aproximadamente 20 cm/s e uma pressão de 100 mm H₂O para inibir respostas excitatórias cardiovasculares16. Mais recentemente, demonstrou-se que a estimulação tátil repetitiva unidirecional ao longo do meridiano GV, utilizando um estimulador mecânico, promove a remodelação sináptica no córtex pré-frontal medial de um modelo murino adolescente de autismo. Nesse protocolo, aplicou-se uma pressão moderada de aproximadamente 30–50 g a uma velocidade de cerca de 15,3 cm/s, sem causar desconforto ou lesão. A estimulação foi realizada de maneira unidirecional, da região caudal até a nuca (região occipital), duas vezes ao dia durante 10 minutos, num período de 21 dias17. No entanto, a manipulação manual difere fundamentalmente da estimulação mecânica, e atualmente nenhum dispositivo mecânico reproduz os movimentos característicos da SP. Além disso, embora diversos estudos tenham investigado os mecanismos da SP em modelos de rato de asma e outras doenças pediátricas18, nenhum protocolo padronizado foi estabelecido para definir a força e a velocidade de estimulação necessárias para a SP em estudos com animais. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padronizado de SP é essencial para melhorar a reprodutibilidade e facilitar investigações mecanicistas.

A asma alérgica é o fenótipo mais comum da asma pediátrica19. Assim, a sensibilização e o desafio com ovoalbumina (OVA) são os métodos mais amplamente utilizados para estabelecer um modelo experimental de asma pediátrica20. Os ratos são particularmente adequados para investigar intervenções baseadas em massagem, pois seu maior tamanho corporal facilita a manipulação manual. Além disso, os modelos com ratos reproduzem de forma confiável características patológicas-chave da asma alérgica, incluindo inflamação polarizada para Th2, hiperreatividade das vias aéreas (AHR) e remodelação das vias aéreas21.

Estudos anteriores demonstraram que o SP atenuou a inflamação das vias aéreas em ratos jovens após sensibilização e desafio com OVA11,14. Portanto, o presente estudo teve como objetivo estabelecer um protocolo padronizado de SP para um modelo de rato jovem de asma pediátrica, a fim de facilitar futuras investigações sobre os mecanismos subjacentes do SP. Este protocolo padronizado fornece uma estrutura experimental reprodutível para estudos mecanicistas e pesquisas translacionais futuras sobre o SP em modelos animais de asma pediátrica.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanquim (nº 202306A032). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e com as diretrizes ARRIVE 2.0.

Trinta ratos machos Sprague-Dawley (SD) livres de patógenos específicos (SPF), com três semanas de idade e pesando entre 45–55 g, foram utilizados. Os ratos foram mantidos (três por gaiola) em uma instalação com barreira SPF, sob ciclo de 12 h claro/escuro, a 22 ± 2 °C e umidade relativa de 30%–40%, com livre acesso a ração padrão e água. Com base em estudos anteriores que utilizaram modelos de rato jovem de asma11,14, o tamanho da amostra foi determinado para minimizar o uso de animais, conforme o princípio da redução das 3R. Após um período de aclimatação de 7 dias, o peso corporal basal foi registrado e cada rato recebeu um número de identificação único. Os ratos foram estratificados de acordo com o peso corporal basal e, em seguida, alocados dentro de cada estrato a um dos cinco grupos, utilizando uma tabela de números aleatórios, com uma razão de alocação de 1:1:1:1:1 (n = 6 por grupo): controle (CN), asma (AS), asma + SP (AS+SP), asma + metilprednisolona (AS+MP) e asma + SP + metilprednisolona (AS+SP+MP). A sequência de randomização e a alocação dos grupos foram geradas por um pesquisador que não participou das intervenções subsequentes nem das avaliações de desfecho.

Os critérios de inclusão foram ratos machos SD SPF saudáveis com 3 semanas de idade, pesando entre 45–55 g na linha de base, apresentando padrão respiratório normal e atividade física regular. Os ratos foram excluídos se apresentassem sinais de doença ou desvio no peso corporal de >20% da média do grupo durante a aclimatação, ou se morressem antes da conclusão da fase de intervenção. Equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo jaleco de laboratório, máscara descartável e luvas, foram utilizados durante todo o procedimento. Cadáveres e tecidos animais foram colocados em sacos de risco biológico com dupla camada e armazenados a −20 °C antes do descarte. A cama contaminada foi descartada como resíduo sólido biológico, e os objetos perfurocortantes foram descartados em recipientes aprovados, resistentes à perfuração. Para a coleta terminal de tecidos, foi administrado uretano a 20% (5 mL/kg, i.p.), e a anestesia profunda foi confirmada pela ausência dos reflexos de retirada plantar e corneano.

1. Estabelecimento do modelo de asma em ratos jovens

OBSERVAÇÃO: O seguinte procedimento foi utilizado para estabelecer o modelo de asma em ratos jovens12.

  1. Prepare a suspensão de OVA/Al(OH)₃ imediatamente antes de cada injeção. Dissolva 2 mg de OVA grau V diretamente em 1 mL de gel de Al(OH)₃ a 4% e vortex até obter uma suspensão homogênea.
    NOTA: Certifique-se de que a suspensão esteja homogênea antes da injeção. Caso ocorra precipitação, vortex brevemente para ressuspender a mistura. Armazene a suspensão em gelo e utilize-a dentro de 2 h após a preparação.
  2. Administre 1 mL da suspensão de OVA/Al(OH)₃ por via intraperitoneal nos dias experimentais 1, 8 e 15. Injete 1 mL de solução salina normal estéril (NaCl 0,9%) em ratos do grupo CN de acordo com o mesmo cronograma.
  3. Desafie os ratos com uma solução de OVA a 2% (grau II) do dia experimental 21 ao dia 42, utilizando um nebulizador ultrassônico. Administre os dois últimos desafios consecutivos com OVA a 3% para induzir exacerbação após a sensibilização.
  4. Realize a nebulização a cada dois dias durante 30 minutos, num período de 3 semanas. Coloque cada rato individualmente em uma câmara de exposição vedada conectada ao nebulizador ultrassônico (frequência ultrassônica: 1,7 MHz ± 10%; taxa de nebulização: ≥3 mL/min; diâmetro de partícula: <5 µm).
    NOTA: Confirme o sucesso no estabelecimento do modelo de asma observando espirros, movimentos de cabeça durante a respiração, respiração pela boca, contração dos músculos abdominais e sibilância.

2. Operação e aplicação do software do sistema Finger TPS

  1. Insira o conector do sensor verticalmente na interface da placa de circuito. Conecte a placa de circuito ao computador usando um cabo USB-C com aproximadamente 40 cm de comprimento para permitir flexibilidade operacional suficiente.
  2. Desinfete as mãos e os protetores digitais. Insira o polegar e o indicador direito do operador nas luvas digitais equipadas com sensores. Posicione os sensores flexíveis sobre o centro das polpas dos dedos e garanta contato próximo e sem rugas com a pele.
  3. Realize a calibração do sistema e o controle de qualidade para a medição de força
    1. Inspeccione os sensores e os cabos de conexão antes de cada sessão de treinamento do operador e verifique se o dispositivo está corretamente conectado.
    2. Selecione “N” como unidade de medida e defina a faixa de medição de −3,5 a 32 N.
    3. Garanta que nenhuma força externa esteja sendo aplicada aos sensores. Execute a função “Tare” para zerar o sistema.
    4. Registre a linha de base sem carga por 30 s. Inicie a medição de força somente quando a variação da linha de base permanecer abaixo de 0,02 N.
    5. Repita o procedimento de zeragem sempre que a posição do sensor ou a firmeza da luva for ajustada ou quando for observada deriva na linha de base.
    6. Utilize o sistema Finger TPS para monitorar a força aplicada durante o treinamento do operador. Mantenha uma força de 5 ± 0,6 N durante o movimento de retrocessão e de 12 ± 2 N durante o SP, mantendo a velocidade e frequência prescritas.
    7. Accepte a curva de força somente quando a linha de base permanecer estável, não ocorrer interrupção ou saturação do sinal e a força aplicada permanecer dentro das faixas-alvo especificadas.
  4. Realize a manipulação de retrocessão e o SP enquanto monitora a curva de força dinâmica. Ajuste a firmeza das luvas digitais conforme necessário até obter uma curva de força estável.
  5. Pratique as manipulações enquanto monitora a curva de força em tempo real. Mantenha uma força-alvo de 5 ± 0,6 N e uma velocidade de aproximadamente 5 cm/s durante a retrocessão, e mantenha uma força-alvo de 12 ± 2 N com frequência de 6–8 repetições/min durante o SP. Considere o operador competente somente após cinco tentativas consecutivas de prática atenderem aos critérios de técnica de manipulação, força digital e frequência do SP.
    NOTA: Considere o operador qualificado somente após alcançar consistentemente a força-alvo e os parâmetros de movimento. Remova os protetores digitais antes de realizar o procedimento formal de SP para evitar estímulo tátil adicional aos ratos. No entanto, nenhum dos testes de reprodutibilidade entre operadores neste estudo deve ser considerado ao adotar este protocolo como referência para o estudo de SP.

3. Procedimento detalhado da manipulação por pinçamento da espinha

  1. Segure suavemente o rato na posição prona sobre uma das palmas da mão. Apoie as patas dianteiras envolvendo delicadamente as axilas dianteiras com o polegar e o indicador, permitindo que as patas dianteiras fiquem suspensas naturalmente. Certifique-se de que o rato permaneça calmo, com respiração regular. Se houver vocalização, agitação ou defecação, solte o rato e permita que se acostume por 2–3 min antes de reposicioná-lo (Figura 1).
  2. Acaricie duas vezes a região dorsal do rato, da área dos ombros até a base da cauda, ao longo do vaso governador (VG), utilizando os dedos indicador, médio e anular da mão direita. Aplique uma força de aproximadamente 5 N para acalmar o rato antes do SP.
  3. Pince a pele na base da cauda usando o polegar direito posicionado posteriormente e os dedos indicador e médio posicionados anteriormente. Levante suavemente a pele, depois gire e avance os dedos cranialmente ao longo da coluna vertebral em direção ao ponto Dazhui (GV14). Evite causar sinais evidentes de desconforto. Mantenha uma pressão digital de aproximadamente 12 N e realize a manipulação com frequência de 6–8 repetições/min. Realize 15 repetições do dia experimental 1 ao dia 21 e 25 repetições do dia 22 ao dia 44.
  4. Repita o procedimento de movimentos de volta descrito na Etapa 3.2 para concluir a sessão de tratamento e acalmar a rata.
    OBSERVAÇÃO: De acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa (MTC), o SP é realizado ao longo da coluna vertebral para estimular os meridianos GV e BZFigura 2). O vaso governador estende-se ao longo da linha média dorsal desde a raiz da cauda até Dazhui (GV14), enquanto o meridiano da Bexiga Urinária situa-se aproximadamente 3–6 mm laterais à linha média, dependendo do tamanho corporal.22. Dazhui (GV14) localiza-se no ponto médio entre a sétima vértebra cervical e a primeira vértebra torácica. Aumente o número de repetições da SP com a idade, para simular o regime clínico de tratamento. Durante a fricção nas costas, certifique-se de que o rato permaneça relaxado, respire calmamente e não apresente comportamento defensivo. Durante a SP, espera-se leve arqueamento das costas e abertura dos bigodes, sem micção ou defecação induzidas pelo estresse, nem agitação violenta, vocalização ou tentativas de fuga.

4. Protocolos de intervenção

  1. Atribua ratos do grupo CN para não receberem nenhuma intervenção específica para a doença. Manipule os ratos suavemente pela mesma duração que o grupo AS+SP para controlar os efeitos da manipulação. Administre soro fisiológico intraperitoneal (1 mL/kg) no mesmo esquema utilizado para as injeções de metilprednisolona.
  2. Submeta os ratos do grupo AS à sensibilização e desafio com OVA. Aplique os mesmos procedimentos de manipulação e controle com injeção de soro fisiológico utilizados para o grupo CN.
  3. Submeta os ratos do grupo AS+SP à sensibilização e desafio com OVA. Aplique o protocolo de SP uma vez ao dia antes da indução do modelo.
  4. Submeta os ratos do grupo AS+MP à sensibilização e desafio com OVA. Administre metilprednisolona (10 mg/kg; 2 mg/mL preparada em soro fisiológico) por injeção intraperitoneal 30 min antes de cada desafio com OVA.
  5. Submeta os ratos do grupo AS+SP+MP aos mesmos procedimentos utilizados para o grupo AS+MP. Aplique o protocolo de SP uma vez ao dia antes da injeção de metilprednisolona.
    NOTA: Exceto para os grupos AS+SP e AS+SP+MP, aplique os mesmos procedimentos de manipulação a todos os demais grupos para controlar os efeitos inespecíficos da manipulação. Utilize seringas descartáveis estéreis para todas as injeções e descarte as agulhas em recipientes resistentes a perfuração. Insira a agulha para injeção intraperitoneal lateral à linha média abdominal para minimizar o risco de lesão visceral. Para controlar a estimulação tátil nos grupos não SP, acaricie os ratos quatro vezes durante a mesma intervenção que o grupo SP todos os dias. Utilize o mesmo procedimento de acariciamento nas costas utilizado para os grupos SP.

Resultados

O peso corporal é um indicador importante do crescimento em ratos jovens. Nenhuma diferença significativa no peso corporal foi observada entre os cinco grupos antes do tratamento experimental. Após a indução do modelo de asma, o grupo AS apresentou peso corporal significativamente menor do que o grupo CN (P = 0,000; Figura 3A). Em comparação com o grupo AS, o grupo AS+SP apresentou peso corporal significativamente maior (P = 0,008; Figura 3A), enquanto o grupo AS+MP não mostrou diferença significativa (P = 0,975; Figura 3A). Da mesma forma, o grupo AS+SP+MP não apresentou aumento significativo no peso corporal em comparação com o grupo AS (P = 0,925; Figura 3A). Os resultados sugerem que a SP promove o ganho de peso durante a modelagem de asma pediátrica e o tratamento com metilprednisolona (MP) em ratos jovens.

Após o desafio com OVA, os ratos do grupo CN não apresentaram sinais de desconforto respiratório, incluindo falta de ar, espirros, movimentos bruscos da cabeça, respiração pela boca aberta, contração dos músculos abdominais ou sibilância. Em contraste, os ratos do grupo AS exibiram manifestações típicas de asma pediátrica, incluindo falta de ar, espirros, movimentos bruscos da cabeça e respir游戏副本

Para avaliar os efeitos anti-inflamatórios do SP em ratos jovens com asma experimental, tecidos pulmonares foram coletados após anestesia profunda com uretano a 20% (5 mL/kg, i.p.), conforme procedimentos previamente descritos12. A coloração com hematoxilina e eosina (HE) e a análise da expressão gênica pró-inflamatória foram realizadas para avaliar a inflamação crônica das vias aéreas, enquanto a coloração de Masson foi utilizada para avaliar o remodelamento das vias aéreas. A hiperreatividade das vias aéreas (AHR) foi avaliada por meio de pletismografia de corpo inteiro (WBP), medindo-se a pausa aprimorada (Penh).

Após procedimentos rotineiros de coloração com HE e Masson23, cortes pulmonares foram corados com hematoxilina e eosina e pontuados quanto à inflamação peribronquiolar utilizando uma escala modificada de 0 a 424. O grupo modelo de asma apresentou escores de inflamação significativamente mais altos do que o grupo CN (P = 0,000). Em comparação com o grupo AS, os grupos AS+SP, AS+MP e AS+SP+MP mostraram todos escores de inflamação significativamente reduzidos (P = 0,005, P = 0,006 e P = 0,000, respectivamente), sem diferenças significativas entre os três grupos tratados (Figura 4A, Tabela 1).

A remodelação das vias aéreas foi avaliada pela quantificação do depósito de colágeno ao redor dos bronquíolos utilizando coloração de Masson. O depósito de colágeno foi expresso como a área positiva para colágeno normalizada em relação ao perímetro da membrana basal (µm2/µm). O grupo AS apresentou deposição de colágeno significativamente maior do que o grupo CN (P = 0,000). Em comparação com o grupo CN, os grupos AS+SP e AS+MP apresentaram deposição de colágeno moderadamente maior (P = 0,050 e P = 0,051, respectivamente), mas deposição de colágeno significativamente menor do que o grupo AS (P = 0,001 em ambas as comparações). O grupo AS+SP+MP não mostrou diferença significativa em relação ao grupo CN (P = 0,105), mas apresentou deposição de colágeno significativamente reduzida em comparação com o grupo AS (P = 0,001). Nenhuma diferença significativa foi observada entre os três grupos de intervenção (Figura 4B, Tabela 1).

Curvas de força representativas obtidas utilizando o sistema Finger TPS são mostradas na Figura 5. Durante o treinamento do operador, a curva de força registrada durante o movimento de retorno permaneceu estável em aproximadamente 5 N (Figura 5A), enquanto a curva de força registrada durante o SP exibiu picos repetidos de força correspondentes à manipulação de pinçamento, com a força aplicada mantida dentro do intervalo-alvo predefinido (Figura 5B). Esses perfis de força demonstram as características padronizadas de força utilizadas durante o treinamento do operador.

A linha do tempo experimental geral é resumida na Figura 6. Após o período de aclimatação de 7 dias, a sensibilização com OVA foi realizada de acordo com o cronograma especificado, seguida por desafios repetidos com OVA. O SP foi administrado aos grupos AS+SP e AS+SP+MP durante o período de intervenção designado, enquanto a metilprednisolona foi administrada antes do desafio com OVA nos grupos de tratamento correspondentes. A avaliação por WBP e a coleta de tecidos foram realizadas após o desafio final (Figura 6).

A pletismografia de corpo inteiro é amplamente utilizada para avaliar o Penh em roedores conscientes e não restritos, sem causar lesão ou estresse significativos25. Embora o Penh seja um indicador indireto influenciado pelo padrão respiratório e por fatores ambientais, a medição direta da resistência das vias aéreas exige anestesia e traqueostomia, procedimentos que podem alterar a fisiologia das vias aéreas26. Contudo, relatou-se que o Penh se correlaciona com medições invasivas da resistência pulmonar27. Vinte e quatro horas após o último desafio com OVA, ratos foram colocados em câmaras não restritas e expostos sequencialmente ao PBS nebulizado seguido por acetilcolina (Ach) nas concentrações de 3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 mg/mL. Cada desafio com aerossol durou 2 min e foi seguido por um período de registro de 5 min28. O grupo AS apresentou valores de Penh significativamente mais altos do que o grupo CN, enquanto o tratamento com SP, MP ou sua aplicação combinada reduziu significativamente os valores de Penh (P = 0,005; Figura 3B). Esse resultado indicou que o SP melhorou a função respiratória em ratos asmáticos, um achado que ainda necessita de validação adicional, combinada com medições diretas da resistência das vias aéreas (Raw).

A interleucina-4 (IL-4) inicia a inflamação eosinofílica mediada por Th2, enquanto o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) contribui para a hiperreatividade brônquica (AHR) e o remodelamento das vias aéreas, desempenhando juntos papéis centrais na patogênese da asma pediátrica29. Para avaliar mais detalhadamente a inflamação das vias aéreas, os níveis de expressão de IL-4 e TNF-α nos tecidos pulmonares foram quantificados por meio da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). Em comparação com o grupo CN, o grupo AS apresentou aumento significativo na expressão de IL-4 e TNF-α (P = 0,000 e P = 0,000, respectivamente; Figura 3C,D). A expressão de ambas as citocinas foi significativamente reduzida após o tratamento com SP ou MP, e a combinação de SP e MP produziu a maior redução (P = 0,001 e P = 0,000, respectivamente; Figura 3C,D).

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Figura 1: Procedimento detalhado da manipulação de pinçamento na coluna (SP) em ratos. (A) Segure o rato em posição prona sobre a palma da mão do operador. (B) Pince a pele na base da cauda. (C) Levante a pele pinçada. (D) Gire e avance os dedos cranialmente ao longo da coluna em direção ao ponto Dazhui (GV14). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Ilustração esquemática do Vaso Governador (VG), meridiano da Bexiga (B) e Dazhui (VG14) em ratos. O diagrama ilustra a localização anatômica do VG, do meridiano da Bexiga e de Dazhui (VG14), que servem como locais-alvo para a manipulação por pinçamento da coluna vertebral. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Efeitos da manipulação por pinçamento da coluna vertebral sobre o peso corporal, hiperreatividade das vias aéreas e fatores inflamatórios pulmonares em ratos jovens. (A) Comparação do peso corporal entre os grupos experimentais. (B) Comparação dos valores de pausa aprimorada (Penh).CExpressão gênica relativa da interleucina-4 (IL-4) no tecido pulmonar. (D) Expressão gênica relativa do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no tecido pulmonar. Os dados são apresentados como média ± SD. *P < 0,05 e **P < 0.01 versus o grupo CN; #P < 0,05 e ##P < 0,01 versus o grupo AS. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Alterações histopatológicas representativas no tecido pulmonar. (A) Coloração com hematoxilina e eosina (HE) mostrando inflamação peribronquiolar. (B) Coloração com tricrômio de Masson mostrando deposição de colágeno e remodelação das vias aéreas. As imagens foram obtidas com aumento de 200×. Barras de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Curvas de força representativas registradas durante a manipulação de pinçamento da espinha utilizando o sistema Finger TPS. (A) Curva de força registrada durante a manipulação de escovação reversa. (B) Curva de força registrada durante a manipulação de pinçamento da espinha (SP). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Cronograma experimental. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

GrupoPontuação de Inflamação em HEÁrea de Colágeno/Perímetro da Membrana Basal (μm²/μm)
CN1.10 ± 0.252.50 ± 0.43
AS2.32 ± 0.50**4.23 ± 0.53**
AS+SP1.66 ± 0.27##3.12 ± 0.56*##
AS+MP1.67 ± 0.31##3.12 ± 0.50*##
AS+SP+MP1.34 ± 0.27##3.01 ± 0.33##

Tabela 1: Pontuações de histopatologia pulmonar. A inflamação peribronquiolar foi avaliada por meio da coloração com hematoxilina-eosina, e o remodelamento das vias aéreas foi quantificado como a área positiva para colágeno normalizada em relação ao perímetro da membrana basal (µm2/µm). Os dados são apresentados como média ± SD (n = 5 por grupo). *P < 0,05 e **P < 0,01 versus o grupo CN; #P < 0,05 e ##P < 0,01 versus o grupo AS.

Discussão

A sensibilização e desafio com ovoalbumina (OVA) é um dos modelos experimentais mais amplamente utilizados para o estudo da asma pediátrica30,31. O presente estudo demonstrou que o protocolo padronizado de manipulação por aperto na espinha (SP) aliviou a inflamação crônica das vias aéreas, a hiperreatividade brônquica (AHR) e o remodelamento das vias aéreas. Estudos clínicos anteriores mostraram que a massagem pediátrica tradicional, incluindo o SP, melhora a asma e outras doenças alérgicas em crianças11,13,32. Além disso, estudos animais anteriores demonstraram que o SP atenuou a inflamação das vias aéreas em modelos de rato jovem com asma por meio da modulação da microbiota intestinal12,15. O presente estudo demonstrou ainda que a aplicação de um protocolo padronizado de SP melhorou a inflamação crônica das vias aéreas, a AHR e o remodelamento das vias aéreas em um modelo de rato jovem com asma. Além disso, o SP potencializou os efeitos terapêuticos da metilprednisolona (MP), reduzindo seus efeitos colaterais retardadores do crescimento.

A técnica SP é praticada na China há mais de 1.000 anos e permanece um dos métodos de massagem pediátrica mais amplamente utilizados para a prevenção e tratamento da asma e outras doenças infantis12,15,33,34,35. Apesar de sua longa história de aplicação clínica, a técnica SP permanece relativamente desconhecida fora da China. De acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa, os meridianos GV e BL percorrem ou ficam adjacentes à coluna vertebral e se comunicam com os órgãos internos. Consequentemente, acredita-se que a estimulação dos meridianos GV e BL regule a função visceral, module a atividade imunológica e aumente a resistência a doenças. A técnica SP consiste em pinçar, levantar, torcer e avançar sobre a pele ao longo da coluna vertebral, estimulando simultaneamente os meridianos GV e BL. Essa manipulação aplica forças compressivas e de tração sobre a pele e a fáscia subjacente, produzindo uma estimulação mecânica moderada. Na prática clínica, a manipulação de alisamento suave nas costas é rotineiramente realizada antes e depois da técnica SP, com o objetivo de reduzir a estimulação e melhorar o conforto do paciente. O alisamento nas costas consiste em movimentos suaves descendentes ao longo das costas e é amplamente utilizado na massagem pediátrica. Assim, com base nos princípios de relevância clínica, viabilidade, simplicidade e reprodutibilidade, o protocolo padronizado incorpora tanto a técnica SP quanto a manipulação de alisamento nas costas.

Estudos anteriores demonstraram que o SP reduz a inflamação tanto nos pulmões quanto no hipocampo por meio de mecanismos imunomoduladores12,36. A asma pediátrica é caracterizada por uma inflamação polarizada para Th2, estreitamente associada à desregulação imunológica37. Estudos experimentais anteriores relataram que a carícia manual ou com escova regulava as respostas imunes em camundongos quando realizada com uma pressão de 100–150 mmH₂O (7–11 mmHg) e uma velocidade de aproximadamente 3 cm/s38. Além disso, um estudo clínico relatou que carícias realizadas a aproximadamente 1–10 cm/s eram percebidas como mais agradáveis39. Com base nesses achados, o protocolo padronizado adotou uma força de carícia nas costas de 5 ± 0,6 N e uma velocidade de 5 cm/s para obter um efeito calmante adequado. A pressão, a frequência e o número de repetições do SP foram determinados com base em estudos anteriores12,15 e pesquisas relacionadas de outros grupos de pesquisa40,41. Embora estudos anteriores tenham padronizado tanto a carícia manual nas costas (20 cm/s; aproximadamente 100 mmH₂O) quanto a estimulação mecânica do GV (30–50 g; aproximadamente 15,3 cm/s) para alcançar inibição cardiovascular ou promover remodelação sináptica em roedores, o SP manual representa uma intervenção biomecânica distinta que depende do feedback tátil e proprioceptivo e, portanto, não pode ser totalmente replicada por dispositivos mecânicos existentes. Essa distinção destaca a importância de protocolos padronizados pelo praticante para futuras pesquisas translacionais sobre intervenções táteis na asma alérgica.

Numerosos estudos publicados em chinês demonstraram que a PS modula a função imunológica e suprime a inflamação42,43,44. No entanto, até onde se sabe atualmente, nenhum estudo anterior fora do grupo de pesquisa do autor padronizou a pressão e a velocidade da PS para investigar uma doença específica em modelos animais de asma pediátrica. Estudos anteriores investigaram os mecanismos subjacentes à PS em modelos de ratos jovens com asma, incluindo a modulação da microbiota intestinal, o aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta, a melhoria da função muscular respiratória (por exemplo, força do diafragma) e a atenuação da inflamação das vias aéreas e da disfunção pulmonar11. O presente estudo concentrou-se principalmente em estabelecer um protocolo padronizado, em vez de elucidar de forma abrangente os mecanismos de ação subjacentes. Utilizou-se um sistema de medição e registro tátil de alta precisão para padronizar a força aplicada durante a massagem nas costas e a PS, enquanto a velocidade e a frequência das manipulações foram padronizadas com base em estudos anteriores. Os ratos foram escolhidos porque seu tamanho corporal facilita o manuseio estável e a aplicação manual da PS, ao mesmo tempo que se aproxima do procedimento clínico. A massagem nas costas foi realizada com os dedos de uma mão, como na prática clínica pediátrica. Devido ao menor tamanho corporal dos ratos, a PS foi realizada com três dedos de uma mão, em vez de ambas, mantendo-se as características biomecânicas essenciais da técnica clínica. Essa modificação reproduz de forma fiel a estimulação dos meridianos GV e BL no modelo de rato. Como os parâmetros de medição podem variar entre diferentes sistemas de medição de pressão tátil, a padronização da manipulação manual com base nas respostas comportamentais dos ratos durante a massagem nas costas e a PS pode proporcionar maior reprodutibilidade do que depender exclusivamente de medições de força específicas do dispositivo. Estudos anteriores também demonstraram que a massagem nas costas exerce efeitos antidepressivos em ratos jovens induzidos pelo CUMS9, embora a PS tenha produzido efeitos terapêuticos significativamente maiores. Consequentemente, os efeitos benéficos observados no presente estudo podem refletir parcialmente a contribuição da manipulação de massagem nas costas, além dos efeitos principais da PS.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiramente, o tamanho da amostra foi relativamente pequeno, o que pode limitar a robustez e a generalização dos achados. Em segundo lugar, o presente estudo focou-se principalmente em estabelecer e validar um protocolo padronizado de SP; portanto, investigou apenas um conjunto limitado de desfechos mecanicistas, em vez de delinear de forma abrangente os mecanismos biológicos subjacentes. Assim, a validação mecanicista — incluindo contagem de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA), níveis de IgE específica para OVA, perfilagem de citocinas Th2 (por exemplo, IL-5, IL-13) e análise de vias de sinalização intracelular — não foi realizada. Esse resultado indicou que o SP melhorou a função respiratória em ratos asmáticos, um achado que ainda necessita de validação adicional, combinada com medidas diretas de resistência das vias aéreas (Raw). Terceiro, todas as manipulações foram realizadas por um único operador treinado, e a reprodutibilidade entre diferentes operadores treinados não foi avaliada. Por fim, um grupo de intervenção com apenas movimentos de fricção nas costas não foi incluído para distinguir os efeitos independentes da fricção nas costas dos efeitos do SP. Estudos futuros devem incluir amostras maiores, avaliar a reprodutibilidade entre operadores, incorporar grupos controle adicionais e investigar mais a fundo os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos do SP.

Divulgações

Os autores declaram que não têm nada a revelar. Durante o processo de elaboração do manuscrito, nenhuma ferramenta de inteligência artificial foi utilizada na preparação deste manuscrito. Os autores assumem total responsabilidade pela completude e precisão do manuscrito final.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (líder do projeto Xiong Ying, nº 81973970, vinculada à Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing). Os autores agradecem ao Instituto de Pediatria, ao Laboratório-Chave de Jiangsu de Saúde Infantil e Medicina Chinesa e ao Laboratório-Chave de Pesquisa em Acupuntura e Medicina do Ministério da Educação pela disponibilização de instalações, instrumentos e equipamentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% gel de Al(OH)3Shanxi ZHHC Biomedical Technology Co., LTD, ChinaBS010N/A
Ach (acetilcolina)Sigma, USAA2251N/A
Lâminas de microscopia adesivasCitotest, Jiangsu, ChinaREF.188105
P/N.80312-3161		N/A
Sacos descartáveis para resíduos biológicosNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.HJ421-2008N/A
Máquina de aquecimento de tecidos biológicosKedee, Zhejiang, ChinaKD-HIIN/A
Máquina de inclusão de tecidos biológicosKedee, Zhejiang, ChinaKD-BMN/A
Máquina de espalhamento de tecidos biológicosKedee, Zhejiang, ChinaKD-PIN/A
Buxco Research SystemsDSI Buxco, Wilmington, NC, USAPFTN/A
Misturador ajustável (MX-S)DLAB, Pequim, China8031102000N/A
Centrífuga para microplacasScilogex, USASCI-CF2800M E050S11B000798N/A
Bancada de fluxo laminar Sanfa, Xangai, ChinaSF-CJ-1AN/A
Centrífuga convencionalDLAB, Pequim, ChinaD100BE: 9031001011N/A
Luvas descartáveis estéreisShanghai Kebang Medical Latex Equipment Co., Ltd.22010739https://www.sh-kebang.com/products_detail/6.html
Balança eletrônicaJinghai, XangaiYP3001NN/A
Balança eletrônicaJinghai,  Xangai, ChinaYP3001NN/A
Sistema Finger TPSPressure Profile System, Inc, USAVersão do software aplicável: Chameleon 2018https://pressureprofile.com/body-pressure-mapping/finger-tps
 Microscópio óptico de fluorescênciaOlympus, Tóquio, JapãoDP70N/A
Esterilizador por vapor sob pressãoTomy, JapãoSX-500N/A
Centrífuga congeladora de alta velocidadeEppendorf5418RN/A
Kit de coloração tricrômica de MassonSolarbio, Xangai, ChinaG1340N/A
Micropipetas e ponteiras estéreiseppendorfJ48931Lhttps://www.eppendorf.com/hk-en/Products/Liquid-Handling/All-Pipettes-Dispensers-Automated-Liquid-Handlers/Eppendorf-Reference2-p-PF-222171
MicrotomosLeica, AlemanhaRM2145N/A
MP (succinato de sódio de metilprednisolona)Shyndec, Xangai, ChinaH20070007N/A
Espectrofotômetro NanoDrop LiteThermo Fisher Scientific, USAnd-ndl-pr-2yrw-cccN/A
 Controlador de nebulizaçãoEmka, FrançaVENT4:14554N/A
Envelopes opacos e seladosNanjing Kongdu printing Co., Ltd201701N/A
OVA (Grau II)Sigma, USAA5253N/A
OVA (Grau V)Sigma, USAA5503N/A
Kit de PCRYeasen, Xangai, China11201ES08N/A
Recipiente resistente a perfurocortantesNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.KMT-15YN/A
Kit de transcrição reversaBio.vazyme, Nanquim, ChinaR323N/A
Centrífugas pequenasHettich, AlemanhaMIKRO 220R D-78532N/A
Bolas de algodão estéreis e secasZHENDE, Zhejiang, China202203121Bhttps://www.zhende.com/index.php?g=product&m=index&a=info&id=13
TrizolBio.vazyme, Nanquim, ChinaR771N/A
Freezer de armazenamento ultrafrioThermo Fisher Scientific, USA950GP-ULTSN/A
Nebulizador ultrassônicoJiangsu Yuwell Medical Instruments Co., Ltd., China402AIN/A
Sistema de PCR em tempo real ViiATM7Life TechnologiesTM, Singapura278882021N/A
Pletismógrafo de corpo inteiroScrieq, Canadá1185162,1184031,1185898FV-FXM1-01, cartucho expiratório FX1: FV-FXM1 ET, cartucho inspiratório FX1: FV-FXM1-IA

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