Geração de Substratos de Matriz Extracelular de Poliacrilamida e Silício com Rigidez Definida para Aplicações em Biologia Celular

Resumo

Embora a rigidez da matriz extracelular (MEC) seja um regulador chave do comportamento celular, os mecanismos subjacentes de detecção e transdução permanecem incertos. Para resolver isso, fornecemos protocolos para criar substratos à base de poliacrilamida e silicone com rigidez ajustável, avançando nosso entendimento sobre diafonia celular-ECM.

Resumo

A matriz extracelular (ECM) é um regulador crítico do comportamento celular, com a rigidez da ECM servindo como um indicador mecânico chave que governa a sinalização, morfologia e destino celular. No entanto, a investigação experimental de respostas celulares dependentes da rigidez é frequentemente limitada pela disponibilidade de plataformas de cultura reprodutíveis, econômicas e acessíveis, com propriedades mecânicas precisamente ajustáveis. Este protocolo descreve métodos à base de poliacrilamida (PA) e silicone para fabricar substratos ECM com rigidez sintonizável. Os procedimentos detalham a preparação do substrato, a funcionalização da superfície e a conjugação das proteínas da ECM para garantir a aderência celular consistente em uma faixa de rigidez fisiologicamente relevante. Substratos baseados em PA são compatíveis com ensaios bioquímicos posteriores, incluindo extração de proteínas e RNA, bem como imagens de fluorescência de alta resolução. Substratos à base de silicone são otimizados para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF), permitindo a visualização das interações célula-ECM na membrana basal. Além disso, substratos macios podem ser adaptados para suportar culturas esferoides posicionadas em um plano de imagem consistente, facilitando a aquisição consistente de imagens. Esses métodos fornecem plataformas robustas, econômicas e reprodutíveis para sondar sistematicamente como a rigidez da ECM regula processos celulares, avançando a percepção mecanicista sobre a intercomunicação celular-ECM em contextos fisiológicos e de doenças.

Introdução

A matriz extracelular (MEC) é um andaime estrutural e bioquímico fundamental que define as propriedades mecânicas dos tecidos e apoia suas funções biológicas. Por exemplo, tecidos elásticos como pulmões e artérias são enriquecidos com ECM à base de colágeno e elastina, que fornece a resiliência mecânica necessária para ciclos repetidos de estiramento-recuo durante a respiração. Em contraste, o sistema nervoso central contém ECM rica em glicosaminoglicanos que cria um ambiente altamente complacente, otimizado para diferenciação e sinalização^{neuronal 1}. Em diversos tecidos do corpo, a rigidez dos tecidos abrange várias ordens de magnitude, variando desde centenas de pascais em tecidos moles como cérebro e pulmões até níveis de rigidez em megapascal e gigapascal nos tendões e ossos,^{respectivamente 2,3}. Essas diferenças mecânicas não são apenas estruturais, mas também desempenham um papel crítico na regulação do comportamento celular ^4,5. Por exemplo, células-tronco mesenquimatosas passam por especificação de linhagem dependente da rigidez, adotando destinos neuronais em substratos macios, destinos miogênicos em substratos intermediários e destinos osteogênicos em substratos^{rígidos 6}. Alterações patológicas na rigidez da MCE também podem impulsionar respostas celulares aberrantes e contribuir para o início e progressão da ^{doença 7,8,9}. Da mesma forma, mudanças nas propriedades da ECM ao redor das células também alteram a função dos organelos e vários comportamentos^{celulares 10,11}. Apesar da reconhecida importância da ECM na orientação da sinalização, da função dos organelos e da patogênese da doença, os mecanismos pelos quais as células detectam e transducem sinais de ECM em sinais bioquímicos permanecem incompletamente compreendidos.

O progresso na compreensão da diafonia célula-ECM foi prejudicado em parte pela disponibilidade limitada de plataformas experimentais que oferecem controle preciso sobre as propriedades da ECM, mantendo-se totalmente compatíveis com ensaios bioquímicos padrão e fluxos de trabalho de imagem. Além disso, estudar as interações célula-ECM é frequentemente percebido como tecnicamente desafiador, pois requer expertise interdisciplinar abrangendo ciência dos materiais, biologia celular e bioengenharia. Esse método visa enfrentar esses desafios fornecendo protocolos passo a passo para gerar substratos ECM à base de PA e silicone com propriedades mecânicas definidas, que podem ser facilmente preparados na maioria dos ambientes de laboratório úmido.

Hidrogéis PA com rigidez ajustável são essenciais da mecanobiologia; no entanto, sua utilidade é frequentemente prejudicada pelo alto custo dos reagentes para conjugação de ECM, funcionalização superficial inconsistente e baixa compatibilidade com fluxos de trabalho bioquímicos em grande escala. Além disso, abordagens práticas e padronizadas para colheita e imagem de amostras em substratos de rigidez variável não estão bem estabelecidas. Esses gargalos podem ser resolvidos usando nossa plataforma de gel PA descrita, caracterizada por quatro inovações principais: (i) redução substancial de custos, (ii) química de funcionalização reproduzível, (iii) produção escalável por meio de hardware reutilizável e (iv) integração perfeita com muitos ensaios convencionais de biologia celular e bioquímica. Essa abordagem utiliza diferentes proporções de acrilamida e bisacrilamida para gerar hidrogéis com propriedades mecânicas distintas (Tabela 1). Géis de PA são inertes e não se conjugam diretamente às proteínas ECM. Portanto, uma reação de polimerização iniciada por radicais livres por UV é usada para conjugar uma fina rede reticulada de tetraacrilato de di(trimetilolpropano), éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS-acrilato) e bisacrilamida na superfície dos géis PA (Figura 1). Essa rede cria uma superfície adesiva de dupla ação para proteínas ECM: o NHS-acrilato fornece ancoragem covalente estável para proteínas ECM, enquanto o tetraacrilato facilita a adsorção uniforme da proteína^{ECM 12}. Além disso, fornecemos métodos que demonstram como extrair proteínas e ácidos nucleicos, como RNA, desses substratos de forma compatível com análises de biologia celular a jusante, como western blotting e reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa-quantitativa (RT-qPCR). Além disso, os substratos PA complacentes resultantes também suportam a formação e posição dos esferoides dentro de um plano focal consistente, permitindo a análise sistemática dos comportamentos celulares^{3D 13}.

Em contraste, as limitações ópticas dos hidrogéis PA restringem seu uso em modalidades avançadas de imagem, especialmente na microscopia de fluorescência interna total (^{TIRF) 14}. Para resolver essa limitação, desenvolvemos substratos de ECM à base de silicone mecanicamente sintonizáveis, otimizados para imagens TIRF. Esses materiais exibem um índice de refração muito próximo ao do vidro, mantendo a rigidez ajustável em uma ampla faixa (Figura 2A). Uma fina camada de gel de silicone, com diferentes proporções de partes, é aplicada por centrifugação sobre um copo de cobertura antes da conjugação da ECM (Figura 2B e Tabela 2). No entanto, a hidrofobicidade intrínseca e a inércia química do silicone impedem a conjugação direta de ECM. Portanto, implementamos uma estratégia de modificação de superfícies para permitir a fixação covalente dos ligantes de ECM. O tratamento com plasma de oxigênio introduz grupos hidroxila na superfície do silicone (Figura 2C). Subsequentemente, o (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) converte esses grupos hidroxila em amina reativa. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropila) carbodiimida cloridrato (EDC), um cruzador de carbodiimídeo de comprimento zero, facilita então a formação de ligações amida covalentes entre os grupos amina na superfície do gel e os grupos carboxila nas proteínas ECM.

Coletivamente, essas plataformas ECM fornecem sistemas econômicos, reproduzíveis e escaláveis para sondar mecanismos de sinalização dependentes da rigidez do ECM. Sua flexibilidade permite uma integração perfeita com ensaios bioquímicos, imagens de alta resolução e fluxos de trabalho de alta produtividade, possibilitando a investigação de como a rigidez da ECM influencia o comportamento celular e impulsiona a progressão da doença.

Protocolo

1. Geração de hidrogéis ECM baseados em PA

1. Funcionalização de superfícies de vidro para fixação de gel de PA
   NOTA: Realize todos os passos em temperatura ambiente em um agitador orbital. Enxágue bem com água de alta qualidade entre as etapas.
   1. Limpe as superfícies do vidro com alvejante a 10% por 3 h em um recipiente resistente a produtos químicos (por exemplo, poliestireno). Use volume suficiente para cobrir totalmente o vidro e garantir que não haja bolhas presas ou áreas secas.
      ATENÇÃO: Água sanitária é um produto químico altamente corrosivo e reativo. Siga as instruções de segurança do fabricante.
   2. Incube os coverslips em ácido clorídrico (HCl) 0,2 M por 16 horas com agitação suave em um shaker.
      ATENÇÃO: O HCl é altamente corrosivo e pode causar queimaduras na pele. Use EPI adequado.
   3. Adicione 0,1 M de NaOH e incube por 1 hora.
      ATENÇÃO: As soluções de NaOH são corrosivas e podem causar queimaduras na pele. Use EPI adequado.
   4. Incube os cobertores em APTES 0,5% em água de alta qualidade por 30 minutos.
      ATENÇÃO: O APTES é tóxico. Trabalhe com APTES em uma exaustão e EPI apropriado.
   5. Enxágue as mantas com um grande volume de água para remover quaisquer resíduos de APTES.
      NOTA: Lavagem incompleta causará uma reação entre APTES e glutaraldeído na próxima etapa e levará a precipitados brancos que comprometerão a ativação da superfície do vidro.
   6. Incube os coverslips em glutaraldeído 0,5% em PBS por 1 hora.
      ATENÇÃO: Glutaraldeído é tóxico. Trabalhe com glutaraldeído em uma exaustão com EPI apropriado.
   7. Seque as mantas em material absorvente (por exemplo, papel toalha) durante a noite. Guarde as coberturas em um recipiente limpo e lacrado até o uso.
2. Preparação de solução de hidrogel de PA e fundição em gel
   NOTA: As formulações necessárias para obter hidrogéis com o módulo elástico especificado são fornecidas na Tabela 1. Volumes recomendados de gel e dimensões do vidro para diferentes aplicações experimentais são apresentados na Tabela 3.
   1. Misture componentes hidrogel de PA em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, excluindo persulfato de amônio (APS) e tetrametiletilendiamina (TEMED).
      NOTA: Não prepare grandes volumes porque géis de maior rigidez polimerizam rapidamente e podem endurecer antes da fundição estar concluída.
   2. Desgasifice a mistura de gel PA, APS e tubos TEMED em uma câmara a vácuo a 25 mmHg por 30 minutos.
   3. Prepare as capas de capa hidrofóbicas aplicando uma camada repelente à água nas mantas limpas usando um cotonete. Certifique-se de que as coberturas estejam livres de manchas para manter uma polimerização consistente do gel.
   4. Adicione APS e TEMED à solução desgasejada, depois pipetee suavemente a mistura sobre os coversheads ativados.
   5. Coloque as coberturas hidrofóbicas sobre a solução para criar uma camada uniforme e fina de hidrogel. Deixe os géis polimerizarem por 35 minutos em temperatura ambiente. Certifique-se de que nenhuma bolha fique presa entre as coberturas e que a solução não derrame pelas bordas.
      NOTA: Siga os volumes recomendados para a fundição em gel para garantir a espessura correta; géis excessivamente finos permitem que as células detectem o vidro^{subjacente 15}. Antes de desmontar o sanduíche de gel, verifique a mistura residual no tubo da microcentrífuga para confirmar a polimerização.
   6. Submerga o sanduíche de hidrogel em PBS para separar as camadas. Certifique-se de que o hidrogel permaneça preso ao coverslip inferior ativado, e o coverslip superior hidrofóbico se desprenda facilmente.
3. Funcionalização de hidrogéis com ligandos ECM
   NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser realizadas em condições estéreis dentro de um gabinete de biossegurança.
   1. Esterilize os hidrogéis mergulhando-os em 70% de etanol e depois transfira-os para plásticos de cultura de tecidos com PBS estéril.
      NOTA: Não deixe hidrogéis no etanol por um período prolongado, pois isso desidratará os géis e comprometerá a conjugação da MEC.
   2. Prepare uma solução mestre de funcionalização composta por água, etanol, HEPES e bisacrilamida (Tabela 4).
      ATENÇÃO: A bisacrilamida é tóxica ao ser inalada ou ingerida.
   3. Prepare soluções diluídas de fotoiniciador UV e tetraacrilato. Ambos os reagentes são dissolvidos em etanol (Tabela 4).
      NOTA: Realize diluições seriadas de tetraacrilato a cada vez, pois quantidades excessivas podem levar à superpolimerização e à presença visível de depósitos pretos na superfície (veja a Figura 3A).
   4. Pese a quantidade necessária de acrilato do NHS usando uma balança analítica. Resuspenda o acrilato do NHS em 50% etanol/50% água imediatamente antes do uso.
      NOTA: Quantidade excessiva de acrilato de NHS resultará na formação de depósitos pretos visíveis na superfície e pode levar a um revestimento ECM irregular (Figura 3B).
   5. Adicione soluções de fotoiniciador UV, tetraacrilato e NHS-acrilato à mistura master preparada na Etapa 1.3.2. Aspire o PBS e adicione a mistura master aos gels, garantindo que fiquem totalmente cobertos.
   6. Expõe os hidrogéis (sem tampas de tapas de taças de cultura de tecido) à luz UV por 400 s (fonte de luz UV com comprimento de onda menor que 365 nm).
      ATENÇÃO: Use proteção ocular adequada ao trabalhar com luz UV.
   7. Remova os géis e coloque-os no gelo. Aspire a solução de funcionalização, depois lave os géis três vezes com pré-frio estéril de 25 mM HEPES (pH 6,0), seguido por três lavagens com pré-frio estéril de 0,9% de NaCl.
   8. Incube os hidrogéis com o ligando ECM preferido em um HEPES pré-frio estéril de 100 mM (pH 8,0) com 100 mM de NaCl durante a noite a 4 °C em um agitador orbital.
      NOTA: A concentração de ligandos de ECM pode ser selecionada a critério do usuário; No entanto, é fundamental manter concentrações idênticas de ligantes em todos os substratos com rigidez variável dentro do mesmo lote.
   9. Aspire cuidadosamente a solução do ligando ECM 16 horas depois. Lave os hidrogéis três vezes com PBS e adicione uma base sem sérum (ou PBS) para mantê-los hidratados. Incube os géis durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos para verificar a esterilidade antes do semeadura celular.
      NOTA: O meio parecerá turvo após incubação durante a noite a 37 °C em meio de cultura de base se houver contaminação.
   10. Use os géis imediatamente para a semeadura das células ou armazene-os a 4 °C no meio base por no máximo 3 semanas.

2. Geração de substratos ECM à base de silicone mecanicamente sintonizáveis

1. Preparação de coberturas de vidro para revestimento em gel de silicone
   1. Limpe as coberturas de vidro com 3 M NaOH por 20 minutos.
   2. Lave cuidadosamente com água de alta qualidade cinco vezes e aspire a água no final. Deixe-os secarem ao ar livre e use um jato de nitrogênio para remover quaisquer gotículas ou detritos restantes.
2. Preparação de gel de silicone
   1. Pese o Componente A e o Componente B do elastômero de silicone de dois componentes de acordo com a razão de peso especificada na Tabela 2, usando uma balança analítica. Use uma ponta de pipeta cortada para aspirar as soluções viscosas.
   2. Misture cuidadosamente o Componente A e o Componente B usando uma ponta de pipeta para garantir a incorporação completa.
   3. Desgasifice a mistura em uma câmara a vácuo a 25 mmHg por 10 minutos.
3. Montagem em gel sobre lâminas de vidro
   1. Coloque um engobe de cobertura sobre um tapete de borracha posicionado no recobridor de centrifugação, garantindo que fique bem centralizado.
      NOTA: O tapete de borracha garante uma vedação a vácuo adequada. Sem uma vedação adequada, a cobertura pode ser deslocada e quebrar. Centralização inadequada pode resultar em revestimento não uniforme.
   2. Acione o aspirador para fixar a cobertura.
   3. Adicione 100 μL da mistura de gel ao centro da cobertura. Centrifugar a 500 rpm por 10 s, seguido por 8.000 rpm por 60 s.
   4. Asse o revestimento revestido a 80 °C por 2 horas. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.
      NOTA: Armazene em temperatura ambiente por até um mês antes do uso.
4. Funcionalização do gel de silicone com ligantes ECM
   1. Expõe as coberturas revestidas com gel de silicone ao plasma de oxigênio por 5 minutos a 11 W de potência.
      NOTA: A exposição ao plasma de oxigênio por um tempo mais longo ou uma potência maior pode levar ao rachadura dos géis. A combinação ideal de potência e tempo pode precisar ser testada dependendo do equipamento utilizado.
   2. Prepare uma solução de silanização contendo 95% de etanol, 0,5% de APTES e 4,5% de_dH2O.
      NOTA: Realize todas as etapas subsequentes sob condições estéreis dentro de um gabinete de biossegurança.
      ATENÇÃO: O APTES é tóxico. Trabalhe com APTES em uma exaustão e EPI apropriado.
   3. Incube o cobertor revestido com gel com a solução de silanização por 10 minutos.
   4. Lave cuidadosamente com PBS cinco vezes.
   5. Prepare a solução de ECM contendo 100 μg/mL de EDC e a ECM de escolha na concentração desejada em PBS.
      NOTA: O EDC é instável em solução e sensível à umidade. Prepare-o fresco antes do uso e guarde-o bem fechado em um local fresco e seco, protegido da umidade e da luz solar direta.
      ATENÇÃO: O EDC é prejudicial se engolido e tóxico se inalado. Use EPI adequado e trabalhe em uma exaustão.
   6. Incube o coverslip com a solução de ECM por 1 hora a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
   7. Lave o envelope com PBS cinco vezes. Enxágue com substrato base e adicione células.
      NOTA: A densidade celular ideal depende da linha celular específica e dos objetivos experimentais (por exemplo, subconfluente para morfologia ou monocamada para adesão célula-célula). Por exemplo, uma densidade de 0,1 x 10⁶ células/cm² é comumente usada para fibroblastos atingirem 50% de confluência em 48 horas.

3. Preparação do substrato de ECM para imunocoloração e imagem

1. Imunocoloração e imagem em substratos baseados em PA
   NOTA: Hidrogéis PA de dezoito milímetros geralmente fornecem área suficiente para análise quantitativa. Para aplicações de imagem, funda os hidrogéis e realiza imunocoloração em "câmaras laranja" preparadas a partir de tubos de 15 mL. Reutilize as câmaras laranja para múltiplas rodadas de fundição e tingimento em gel, desde que mantenha a integridade estrutural.
   1. Anéis de perfuração de filme de policarbonato e filme de borracha de silicone usando furos de 18 mm de diâmetro externo e 14 mm internos para preparar espaçadores e juntas.
   2. Corte uma abertura no centro de uma tampa de tubo de centrífuga de 15 mL usando tesoura para criar uma câmara para fundição e coloração em gel.
   3. Vi o tubo da centrífuga na marca de 14 mL. Corte as bordas irregulares com um bisturi e lixe a borda da tampa para garantir que caiba em uma placa padrão de 12 poços.
   4. Monte o sanduíche de cobertura de hidrogel (conforme descrito na Seção 1), colocando o anel espaçador sobre o engobe ativado.
   5. Desmonte o sanduíche quando os géis estiverem totalmente polimerizados.
   6. Esterilize os hidrogéis de 18 mm e transfira-os para uma placa de cultura de tecido de 12 poços com PBS estéril.
   7. Realize a funcionalização dos ligantes ECM conforme descrito na seção 1.
   8. Coloque as células das sementes e fixe-as com 4% de formaldeído.
      NOTA: Evite fixadores à base de álcool, pois eles desidratam os géis e comprometem a integridade estrutural.
      ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico e deve sempre ser usado dentro de uma exaustão.
   9. (Opcional) Remonte as amostras na câmara da tampa do tubo da centrífuga. Use uma junta de silicone para vedar a câmara.
      NOTA: Realize um teste de vazamento com PBS por várias horas antes de tingir. Embora esse método possa parecer mais trabalhoso, ele promove uma coloração uniforme e reduz o consumo de anticorpos.
   10. Prossiga com a coloração por imunofluorescência de acordo com os protocolos preferidos pelo usuário.
   11. Após a coloração, armazene amostras em PBS suplementadas com glicerol a 50%. Faça imagens das amostras o mais rápido possível.
       NOTA: Evite meios de montagem padrão que endurecem, pois podem rachar hidrogéis com o tempo e danificar amostras. A intensidade da fluorescência diminui com o tempo; Imagem em até 1 semana para qualidade de sinal ótima.
   12. Coloque uma pequena gota de PBS (ou meio de montagem) sobre a superfície do fundo de vidro de um prato de cultura de tecidos. Inverta cuidadosamente os hidrogéis tingidos sobre a gota para que as células fiquem voltadas para o vidro da cobertura e prossiga com a imagem.
2. Imunocoloração e imagem em substratos de ECM à base de silicone
   1. Fixe as amostras usando 4% de formaldeído e tinga-as diretamente em um prato de fundo de vidro usando um protocolo padrão de imunofluorescência. Evite fixadores à base de álcool, pois eles vão rachar os substratos da ECM.
   2. Amostre a imagem diretamente usando um microscópio de fluorescência tradicional.

4. Colheita de proteínas e RNA de células revestidas em substratos de ECM

1. Usando pinças, remova cuidadosamente os géis do recipiente de cultura e submerga-os em PBS estéril para enxaguar o meio de cultura residual e o soro.
   NOTA: Manuseie as coberturas com cuidado, pois são extremamente frágeis e podem quebrar facilmente.
2. Passe suavemente a borda do hidrogel em lenços lenços de baixo fiapo para remover o excesso de PBS.
3. Adicione um volume apropriado de tampão de extração de RNA à tampa de um prato de cultura de tecidos.
   NOTA: Reagentes à base de fenol-guanidina são compatíveis com a extração de RNA de géis PA. Buffers de lise proteica podem ser usados de acordo com os requisitos experimentais. Visualize as amostras ao microscópio após a incubação do tampão de lise para garantir a completa ruptura celular.
4. Coloque o coverslip (lado gel para baixo) sobre a solução de lise. Levante e abaixe cuidadosamente o hidrogel várias vezes para garantir a lise uniforme de todas as células.
5. Raspe suavemente a superfície do gel para liberar o lisado.
   NOTA: Não use raspadores de células plásticas comerciais, pois o plástico rígido pode danificar os hidrogéis macios e contaminar o lisado com pedaços de gel. O plástico macio usado para fabricar espaçadores (veja Passo 3.1.1) é adequado para esse propósito e pode ser reaproveitado para fazer raspadores personalizados.
6. Armazene o RNA ou lisados de proteínas a -80 °C até processamento adicional usando métodos bioquímicos convencionais ou utilize-os imediatamente.

5. Geração da cultura esferoide de plano único

1. Prepare o hidrogel PA de 75 Pa em coberturas de 18 mm e funcionalize a superfície com extrato de membrana basal (BME) ou outro ligante ECM apropriado para facilitar a fixação celular.
2. Coloque as células semente sobre hidrogéis ou géis de silicone revestidos com ECM na densidade desejada.
3. Após 2 horas, remova suavemente as células soltas e adicione uma camada de BME diluída em meio basal pré-frio.
   NOTA: O BME polimeriza conforme aquece. Pré-resfrie as pontas antes de pipetar. A porcentagem de BME incorporada é determinada pela integridade mecânica e estabilidade desejadas do andaime 3D resultante.
4. Incubar as culturas a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecidos por 1,5 h para permitir a polimerização da EMB.
5. Adicione suavemente o meio de cultura celular para cobrir completamente os géis 3D.
6. Mantenha culturas sob condições padrão. As células continuarão a crescer e se auto-montar em esferoides 3D ao longo do tempo até que o ponto experimental desejado seja alcançado.

Resultados

A rigidez do gel de PA gerada usando as formulações da Tabela 1 foi testada experimentalmente com um reômetro. Foram selecionados géis com valores nominais de rigidez de 0,4 kPa, 6 kPa e 60 kPa, abrangendo três ordens de grandeza. Os valores de rigidez medidos foram 363 ± 76 Pa para gels de 400 Pa, 6,41 ± 0,50 kPa para géis de 6 kPa e 36 ± 8 kPa para géis de 60 kPa (Figura 4A). Para avaliar a fixação uniforme da ECM aos géis de PA, a fibronectina marcada...

Discussão

O protocolo de fabricação ECM descrito oferece um fluxo de trabalho reproduzível, escalável e econômico, podendo ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios. Embora os utensílios tradicionais de cultura de vidro e plástico sejam convenientes e permitam a coleta rápida de dados, os substratos sintéticos não conseguem replicar a rigidez dos tecidos fisiologicamente relevantes. Substratos alternativos mecanicamente sintonizáveis, como polidimetilsiloxano (PDMS) ou gelatina metac...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1.7 mL microcentrifuge tubes	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-well tissue culture-treated plates	-	83.3921	Sarstedt
15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide solution	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Acrylamide solution	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehyde	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm tissue culture-treated dishes	-	83.3901	Sarstedt
A549 cells	-	CCL-185	ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))	-	A37572	Invitrogen
Ammonium persulfate	7727-54-0	-	Bio-Rad
Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 silicone gel, Components A and B	2624028	-	Dow
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectin	-	356008	Corning
Formaldehyde (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)	-	86435K452	McMaster-Carr
Hydrochloric acid	7647-01-0	-	BioShop
Large hollow hole punch tool set	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Microscope slide coverslips, 18 mm diameter	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Microscope slide coverslips, 50 mm diameter	-	1.84E+16	eBay
PBS (1×)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	17466-45-4	-	Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antibody	-	85567	Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antibody	-	3671	Cell Signaling Technology
Plasma cleaner	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR primers (forward and reverse)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthesis Kit	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Screw-cap tubes, conical base, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Screw-cap tubes, conical base, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Serological pipette, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Sodium hydroxide	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby protein gel stain	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol reagent	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV chamber	-	165-5031	Bio-Rad