Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Summary

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Abstract

As bicamadas de interface de gotículas (DIBs) oferecem uma plataforma sintonizável para sondar as propriedades eletromecânicas das membranas lipídicas e peptídicas sob estimulação elétrica controlada. Os DIBs permitem medições de condutância iônica em canal único e conjunto em áreas de membrana ordens de magnitude maiores do que aquelas acessíveis pelas técnicas tradicionais de pinça de remendo, permitindo assim análises em nível de membrana da deformação eletromecânica e sua influência sobre peptídeos condutores de íons. Ao ajustar sistematicamente a estrutura da membrana através da fase hidrocarbonetária a granel (por exemplo, hexadecano [C16] vs. dodecano/hexadecano [C12/C16] [25%/75%, v/v]), essa plataforma bottom-up possibilita variação sistemática da composição da membrana e do ambiente do óleo, que influenciam a viscoelasticidade e a reorganização estrutural da membrana, e, assim, a condução de íons peptídeos. Procedimentos detalhados são fornecidos para a montagem de membranas 1,2-difitaniola-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) dopadas com gramicidina A-dopada usando diferentes composições de óleo de hidrocarboneto e para a aplicação de protocolos de pulso de tensão que conduzem as membranas a estados eletromecânicos metaestáveis. A condução adaptativa de íons por membrana é caracterizada, incluindo respostas semelhantes à plasticidade de curto prazo (semelhantes a STP) e de potenciação e depressão de longo prazo (semelhantes a LTP/semelhantes a LTD) em um sistema modelo de membrana. De forma mais ampla, esse protocolo oferece uma abordagem robusta e reprodutível para investigar sistematicamente contribuições eletromecânicas dependentes da composição, em nível de membrana, para o comportamento condutor semelhante a sinápticos e para entender como ambientes de membrana lipídica modulam a função dos canais iônicos.

Introduction

As membranas biológicas são estruturas supramoleculares críticas que podem regular a condução iônica e possibilitar a comunicação entre neurônios por meio de sinapses elétricas e ^químicas 1,2,3,4.Esse tipo de comunicação é ainda controlado pela plasticidade sináptica, onde mudanças estruturais nas sinapses modulam sua força e persistência em uma faixa de escalas de tempo ^5,6, comumente descritas em termos de plasticidade de curto prazo (STP) e potenciação ou depressão de longo prazo (LTP ou LTD). Esses fenômenos, que envolvem mudanças dinâmicas na condutância da membrana em resposta à atividade neural, geralmente estão acoplados à neuroplasticidade⁷, que fundamenta o aprendizado e^{a memória 8}. Modelos tradicionais de plasticidade frequentemente enfatizam a regulação bioquímica dos canais iônicos por meio da síntese, tráfego de proteínas ou^{fosforilação 9}. No entanto, o papel das membranas plasmáticas neuronais em modelos de plasticidade foi, em sua maioria,^{negligenciado 10,11}.

Os métodos de pinça de contato têm sido usados há mais de meio século para estudar a eletrofisiologia de canal de íons único. No entanto, eles podem interrogar apenas áreas de membrana muito menores do que sinapses intactas ou modelos sintéticos em grande escala. Assim, eles representam uma limitação técnica para o estudo da reorganização e deformação de membranas em mesoescala. A mesoescala é cada vez mais reconhecida como uma escala crítica de comprimento para entender muitos aspectos da biofísica de^{membranas 12,13}.

Uma metodologia é apresentada para usar 1,2-difitaniola-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) bicamadas de interface de gotículas (DIBs^)14,15 dopadas com o ionóforo monovalente de cátion peptídico, gramicidina-A (gA), para modelar a condução iônica, semelhante ao que ocorre em uma sinapse elétrica. Esse sistema oferece várias vantagens principais: (i) DIBs fornecem uma plataforma sintonizável de lipídios e óleo que permite a reorganização sistemática das^{membranas 16}; (ii) DIBs permitem o estudo de eventos de canal único e conjunto em uma faixa de escalas de^{comprimento 17,18}; e (iii) DIBs possibilitam a interrogação de patches de membrana de tamanho^{submilimetrico 2} que capturam a reestruturação coletiva eletromecânica induzida da membrana, preservando a capacidade de resolver eventos de condução iônica^{de canal único 19,20}. Esse método é mais adequado para estudos que exigem interrogação elétrica e óptica simultânea da eletromecânica de membrana sobre áreas de membrana maiores do que aquelas acessíveis pelo patch clamp convencional, mantendo ainda a capacidade de resolver eventos discretos de canais. É particularmente útil quando o objetivo experimental é examinar como a composição da membrana, o ambiente de óleo e as formas de onda de tensão impostas influenciam a reestruturação coletiva da membrana e a condução peptídica. O método é menos adequado para experimentos que exigem arquitetura celular nativa ou leituras moleculares diretas de alterações conformacionais proteicas em membranas biológicas^intactas 19,20,21.

Ao aplicar estimulação elétrica fisiologicamente relevante, os DIBs são conduzidos a estados estacionários fora do equilíbrio, nos quais a reestruturação eletromecânica dinâmica altera a condução dos canais de íons peptídicos. Essas mudanças emergentes na condução iônica são descritivamente análogas aos fenômenos neurológicos STP, LTP e LTD discutidos em^{neurociência} 22,23,24. No presente estudo, esses comportamentos são interpretados principalmente como respostas físicas em nível de membrana à estimulação elétrica associadas a propriedades mecânicas intrínsecas da membrana, como viscoelasticidade e compressibilidade em um sistema modelo^{de membranas 25}. Notavelmente, o estudo descrito aqui se baseia em evidências anteriores de que as bicamadas lipídicas podem apresentar memória elétrica fundamental por meio de mudanças persistentes de condutância e armazenamento de carga capacitiva após^{estimulação} 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, oferecendo novos insights sobre os mecanismos pelos quais as bicamadas lipídicas podem suportar funcionalidades adaptativas, semelhantes às sinápticas, na ausência de máquinas celulares complexas. Por fim, essa metodologia também permite o exame direto das relações estrutura-função e de como o comportamento emergente em escala macro surge de simples reorganizações^estruturais 21,25,27.

Protocol

Limpe cuidadosamente todos os vidros e equipamentos preparatórios com detergentes laboratoriais adequados e enxágue com água destilada antes do preparo da amostra. Use óculos de segurança o tempo todo e luvas de nitrilo ou látex para evitar contaminação. Descarte todos os resíduos químicos conforme as diretrizes institucionais de segurança. Garanta que os solventes voláteis sejam armazenados corretamente, de acordo com as diretrizes institucionais de segurança. Garanta que o espaço e o hardware do laboratório de experimentação (Figura 1A), o vaso de experimentação (Figura 1B) e as conexões elétricas e ópticas (Figura 1C) permaneçam desobstruídos e livres de obstáculos.

1. Preparação de solução tampão aquosa

1. Pese a quantidade adequada de ácido propanesulfônico 3-(N-morfolino) (MOPS) e cloreto de potássio (KCl) para obter as concentrações finais desejadas (por exemplo, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl em 500 mL).
2. Adicione o MOPS e o KCl a ~450 mL de água destilada em um frasco volumétrico ou cilindro graduado de 500 mL e mexa com uma barra magnética até que estejam totalmente dissolvidos.
3. Meça o pH com um medidor calibrado. Ajuste o pH para 7,4 adicionando 1 M de hidróxido de potássio (KOH) ou ácido clorídrico (HCl) em incrementos de 0,25 mL enquanto mexe continuamente.
4. Leve o volume total para 500 mL com água destilada e misture bem. Transfira o tampão para um frasco limpo e rotulado, fele e armazene a 4 °C.
   NOTA: Use o buffer por até ~2 meses. Verifique e ajuste novamente o pH para 7,4 antes de cada uso.

2. Preparação da solução de caldo de gramicidina

1. Em uma exaustão química, adicione 5 mg de gramicidina A (gA) a um frasco de vidro limpo de 20 mL. Adicione 10 mL de metanol usando uma seringa de vidro ou estanque a gás e faça vórtice até que o peptídeo esteja totalmente dissolvido. Rotule o frasco como "estoque de gA" e armazene a -80 °C.
   NOTA: Experimentos em conjunto usam razões molares lipídicas e peptídicas de ~1:^10-4. Experimentos de canal único usam peptídeo ~10–100 vezes menor (1:^10-5–^10-6) para resolver eventos individuais em curtos tempos de gravação (<1 min). Preparar um estoque diluído melhora a precisão da pipeteação em proporções molares baixas (< ~ 1:^10-4).
2. Purge dois frascos de vidro mais limpos de 20 mL com gás argônio por ~5 s cada para remover a poeira.
3. Usando uma seringa limpa e hermética, dispense 9,9 mL de metanol em cada frasco purgado.
4. Pipete 100 μL da solução de gA com uma seringa estéril, estanque, em um frasco para obter um volume total de 10,0 mL. Rotule este frasco como "A". Concentração = 2,66 μM gA no metanol.
5. Pipete 100 μL da solução "A" no segundo frasco de vidro para obter 10,0 mL de volume total. Rotule este frasco como solução "B". Concentração = 26,6 nM gA em metanol.
6. Fele frascos com tampas e embrulhe com parafilme.
7. Armazene todas as soluções de gA a -80 °C até o uso.

3. Preparação de vesículas lipídicas peptídicas

1. Purge um frasco de vidro limpo de 20 mL com gás argônio por ~5 s.
2. Adicione 4 mg de lipídio 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) ao frasco.
3. Em uma exaustor, adicione 1 mL de metanol usando uma pipeta de vidro. Gire suavemente ou forme um vórtice até que todos os lipídios sejam dissolvidos.
4. Usando uma seringa hermética a gás de 500 μL, adicione 178 μL da solução "A" (para experimentos STP em nível de conjunto; Razão molar DPhPC:gA = 1:^10-4) ou 890 μL da solução "B" (para experimentos de canal único; Proporção molar DPhPC:gA = 1:5×^10-6) na solução de metanol DPhPC. Leve suavemente o vórtice para misturar.
5. Sob um fluxo suave de argônio na exaustão, evapore o metanol até que um filme lipídico fino e uniforme se forme no fundo do frasco.
6. Coloque o frasco aberto em um forno a vácuo a 40 °C e puxe um vácuo completo por 10–12 horas ou durante a noite para remover o solvente residual.
7. Retire o frasco do forno a vácuo e adicione 2 mL do tampão de KCl de 0,1 M preparado na Seção 1 para experimentos STP, resultando em uma concentração final de lipídio e gramicidina em suspensão de 2,36 mM e 236 nM, respectivamente. Para experimentos de canal único, adicione 2 mL de um buffer KCl de 1 M conforme preparado na Seção 1. Vórtice para reidratar o filme lipídico e obter uma suspensão lipídica de 2 mg/mL, resultando em uma concentração final de lípidos e gramicidinas em suspensão de 2,36 mM e 11,8 nM, respectivamente.
8. Congele o frasco a -80 °C por pelo menos 6 minutos, depois descongele em uma chapa elétrica ou banho-maria a 40 °C por 6 minutos. Vórtice para misturar brevemente. Repita esse ciclo de congelamento-descongelamento seis vezes para promover a formação de vesículas multilamelares.
9. Monte um extrusor de vesícula lipídica com membrana gravada por trilho de 0,1 μm de poros de diâmetro, seguindo as instruções do fabricante. Passe 500 μL de tampão pelo extrusor 3 vezes para hidratar a membrana, verifique se não há vazamentos e descarte o tampão.
10. Carregue 1 mL da suspensão lipídica descongelada no extrusor e realize 31 passagens através da membrana de 0,1 μm para obter vesículas unilamelares de ~100 nm de diâmetro e garantir a homogeneidade do tamanho.
11. Transfira as vesículas extrudidas (Grandes vesículas unilamelares, LUV) para um tubo de PCR de 1 mL, marque e armazene a 4 °C. Use dentro de 2 semanas após a preparação.
12. Sele qualquer suspensão de proteína lipídica não extrudida restante no frasco original, envolva com parafilme e armazene a -80 °C para uso posterior.
13. Se usar amostras previamente congeladas e não extrudidas, funda novamente a 40 °C usando uma placa quente ou deixe a amostra aquecer até a temperatura ambiente, depois extruda a amostra.

4. Preparação do gel de agarose

1. Coloque um béquer de vidro limpo de 50 mL sobre uma chapa quente. Adicione um comprimido de agarose a 50 mL do mesmo tampão usado para hidratar o filme lipídico (por exemplo, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4) para formar uma solução de gel de agarose a 1%.
2. Adicione uma barra de mexer limpa de Teflon e mexa vigorosamente até que o comprimido se disperse.
3. Cubra o béquer com papel alumínio e perfure um pequeno orifício de ventilação com uma espátula de metal. Ajuste a temperatura da placa quente para 220–230 °C. A solução ficará clara e atingirá uma fervura rolante, indicando a dissolução completa da agarose.
4. Desligue o fogo e remova cuidadosamente o papel alumínio. Passe qualquer filme de superfície com uma espátula de metal limpa. Use imediatamente a solução quente de agarose para revestimento de eletrodos ou deixe esfriar e solidificar no béquer para uso posterior.
5. Após o revestimento de agarose com eletrodo, cubra a agarose solidificada com folha de alumínio, sele com parafilme, rótule e armazene a 4 °C. Quando necessário, reaqueça até ferver, mexendo até estar totalmente derretido.

5. Preparação de eletrodos

1. Corte fio de prata de 0,125 mm de diâmetro em comprimentos de ~70 mm para eletrodos de cabeça e ~130 mm para eletrodos de terra.
2. Usando uma chama aberta (por exemplo, isqueiro manual ou queimador Bunsen), mantenha uma extremidade de cada fio prateado horizontalmente no cone central mais quente da chama até que a ponta derreta e forme uma esfera esférica de ~0,2 mm de diâmetro (Figura 2A).
3. Coloque os fios em uma superfície limpa e verifique ao microscópio que as bolas sejam esféricas e de tamanho semelhante. Se uma bola for oblonga ou irregular, corte a ponta e repita o derretimento (Passo 5.2).
4. Coloque as extremidades dos dois fios prateados em um recipiente de vidro com água sanitária fresca (hipoclorito de sódio, NaClO). Certifique-se de que as bolas estejam totalmente submersas e incubem por pelo menos 1 hora para clorar a superfície e formar Ag/AgCl. Uma aparência marrom-acinzentada opaca confirma a cloração bem-sucedida (Figura 2B).
5. Remova os fios da água sanitária quando as extremidades da bola estiverem de cor cinza opaca, enxágue bem com água destilada e deixe-os em uma superfície limpa e sem fiapos para secar.
6. Obtenha um suporte de pipeta de cabeça e um suporte de eletrodo de terra. Corte um capilar de vidro borosilicato de 100 mm (1,0 mm de diâmetro diâmico, 0,58 mm de diâmetro interior) ao meio usando um cortador de vidro.
7. Insira um semi-capilar no suporte da pipeta de headstage e aperte o suporte para fixá-lo. Monte um capilar completo de 100 mm no suporte do eletrodo de terra e prenda-o.
8. Insira a extremidade não esfera do fio prateado de 130 mm no capilar do eletrodo de terra até que ~20 mm da extremidade esférica se projete. Prenda a ponta oposta do fio ao suporte, deixando ~5 mm expostos para conexão terra.
9. Repita o próximo passo com um fio de 70 mm para o eletrodo do headstage, garantindo contato firme entre o fio e o conector do headstage (peça dourada). Corte qualquer fio excedente da extremidade do conector do headstage.
10. Mergulhe cada bola de prata clorada na agarose, logo acima da junção esfera-eixo, para formar uma camada fina e uniforme. Faça um mergulho para dentro e para fora pelo menos 10 vezes.
11. Retire o eletrodo e deixe a agarose gelificar em temperatura ambiente. Repita o mergulho se necessário para produzir uma casca lisa e uniforme de agarose, com dezenas de micrômetros de espessura. Evite aplicar uma camada muito alta ou muito baixa no fio (Figura 2C).
12. Monte os eletrodos do headstage e aterramento nos micromanipuladores. Conecte o fio de terra exposto (~5 mm) ao terra do amplificador usando um clipe de jacaré.
13. Usando uma pinça, dobre suavemente cada eletrodo até o meio do caminho entre a extremidade esférica e o capilar, de modo que a extremidade esfera fique perpendicular ao estágio do microscópio. Evite curvas maiores que 90° para minimizar a distorção óptica nas vistas de captura visual e de vídeo do microscópio.
14. Ajuste a orientação dos eletrodos em seus suportes para que as extremidades da bola revestidas com agarose fiquem perpendiculares ao plano de imagem do microscópio (Figura 3A).

6. Formação de bicamadas de interface de gotículas (DIBs)

1. Coloque uma placa de Petri limpa e transparente no palco de um microscópio invertido. Encha a panela com óleo de alcano (por exemplo, 100% hexadecano, ou 25%/75% v/v dodecano/hexadecano) até uma profundidade de ~ 5 mm (Figura 1B).
2. Usando os controles do micromanipulador, abaixe ambas as extremidades da bola revestidas de agarose para dentro do óleo até uma profundidade de ~2,5 mm abaixo da superfície do óleo. Evite movimentos rápidos com o micromanipulador para evitar colisões entre bola e cabeça do eletrodo com a placa de Petri.
3. Ajuste o foco do microscópio até que ambas as extremidades da bola e seus revestimentos de agarose fiquem nítidos. Posicione os eletrodos próximos à borda do campo de visão para que ambos possam ser observados simultaneamente.
4. Usando uma pipeta calibrada de 2 μL, aspire a suspensão extrudada de vesícula peptídica lipídica. Dispense lentamente 250 nL da suspensão diretamente em cada extremidade esférica revestida de agarose, usando uma ponta de pipeta separada para cada uma, sem tocar a concha de agarose com a ponta da pipeta.
   NOTA: Para minimizar as vibrações das mãos e aumentar a estabilidade, fixe ambos os cotovelos na saliência da mesa antivibração. Estabilize o pulso que pipeta com a mão que não pipeta, submerga lentamente a pipeta no óleo e aproxime-se do eletrodo gradualmente. A breve suspensão da respiração durante o carregamento de gotas pode reduzir ainda mais movimentos não intencionais.
5. Deixe as gotículas se espalharem e revestirem a casca de agarose, afastando-se do eletrodo sob gravidade. Observe o afundamento lateral através da parede da placa de Petri se estiver claro (Figura 3B).
   NOTA: O tempo necessário para o afundamento das gotículas depende da distribuição do tamanho da vesícula, temperatura e topografia de agarose. Para DIBs de DPhPC, espere pelo menos 5 minutos após a deposição de^{gotículas 15}.
6. Empurre suavemente a mesa antivibração para avaliar a prontidão das gotas. Confirme que as gotículas caídas se movem com um leve atraso em relação ao movimento dos eletrodos, indicando a formação de gotículas monocamada lipídicas totalmente revestidas.
   NOTA: O movimento retardado ocorre porque a formação de uma monocamada lipídica ao redor da gota aquosa reduz significativamente a tensão superficial, atrasando assim a resposta física ao mover o eletrodo no óleo.
7. Se esse comportamento não for observado, espere mais 2–3 minutos e repita o processo.

7. Instalação elétrica e monitoramento em duas camadas (visual e elétrico)

1. Certifique-se de que o microscópio, a mesa antivibração, a gaiola de Faraday e todos os componentes elétricos, incluindo amplificador, digitalizador, gerador de funções e computador, estejam conectados a um aterramento comum (Figura 1).
2. Organize as conexões do instrumento de acordo com o guia de configuração do fabricante. Use a Figura 1C como referência esquemática para a configuração elétrica e óptica essencial. Consulte as instruções detalhadas sobre aterramento³⁵, configuração de hardware/software e ajuste de offset de pipeta para experimentos DIB.
   NOTA: Siga instruções específicas de configuração para cada equipamento para todo o software e hardware listados na Tabela de Materiais.
3. Conecte os eletrodos de headstage e terra ao amplificador patch-clamp.
4. Configure um gerador de funções externo (ou o canal de saída do software de aquisição) para gerar uma forma de onda de tensão triangular de 10 Hz e 10 mV. Confirme a amplitude e a frequência em um osciloscópio conectado e dentro do software de aquisição.
5. Depois que as gotas caírem por ~ 10 minutos, use os micromanipuladores para trazer as duas gotas em contato suave. Ajuste as posições dos eletrodos para que a área de contato das gotículas seja inicialmente não mais que ~ 1/⁴ do seu diâmetro.
6. Ligue a forma de onda triangular de 10 Hz, 10 mV e monitore a resposta capacitiva da corrente com o amplificador e o software de aquisição.
7. Aguarde pela formação espontânea de duas camadas, indicada eletricamente por uma resposta capacitiva expansiva de pico a pico e opticamente por uma reflexão interna crescente (aparência oval) do contato com duas camadas (Figura 4). Confirme que as bicamadas lipídicas puras exibem platôs retangulares de corrente ao estímulo de tensão triangular, enquanto as bicamadas dopadas por gA a ~1:^10-4 lipídicos: o peptídeo apresenta planaltos inclinados refletindo a condução iônica em conjunto.
8. Ajuste a área de contato das gotículas movendo levemente os eletrodos até que a resposta de corrente capacitiva pico a pico para a forma de onda triangular de 10 Hz, 10 mV esteja entre ~100–200 pA para DIBs de ~250 nL em óleos C16 ou C12/C16, correspondendo a uma faixa de capacitância de ~250–500 pF³³.
   NOTA: Pulsos de alta frequência ou tensões de retenção DC diferentes de zero podem induzir eletroumedição e expansão excessiva da bicamada, levando à coalescência de gotículas e à ruptura da bicamada. A faixa de 100–200 pA fornece um equilíbrio entre estabilidade em duas camadas e relação sinal-ruído, permitindo expansão suficiente da área durante a estimulação.
9. Se o DIB se unir, retire os eletrodos do óleo. Enxágue bem as cabeças dos eletrodos com o mesmo tampão aquoso usado para as amostras de lipídios e agarose.
10. Remova quaisquer gotículas aquosas da placa de Petri com uma seringa estéril. Reabasteça com óleo novo se necessário, submerga novamente os eletrodos. Recarregue a solução de LUV nos eletrodos conforme descrito na Seção 6 e repita o processo.
11. Uma vez confirmadas respostas capacitivas ou condutivas estáveis, desligue a forma de onda triangular e permita que o DIB se equilibre por pelo menos 15 minutos antes de aplicar protocolos de estimulação.

8. Protocolos de estimulação elétrica

1. Experimentos de pulso (respostas do tipo STP em conjunto e do tipo LTP / LTD)
   1. Configure o gerador de funções ou software de aquisição para fornecer pulsos de tensão com a amplitude, duração e intervalo entre pulsos desejados (por exemplo, padrões PPF [facilitação de pulsos pareados] e PPD [depressão de pulsos pareados]).
   2. Abra o software de captura de vídeo. Selecione as configurações apropriadas da câmera e da lente objetiva. Defina a taxa de quadros para pelo menos 20 quadros/s e confirme que ela permanece estável durante a gravação.
   3. No software de aquisição de dados, defina a frequência de amostragem para pelo menos 5 kHz para o sinal atual.
   4. Clique em Adquirir > Novo Protocolo para criar um novo protocolo, ou Adquirir > Editar Protocolo para modificar um existente. Na aba Modo de Aquisição , selecione Estimulação Episódica. Defina Runs/Trial em 1 e Sweeps/Run em 1.
   5. Defina a duração da varrida para 4 s maior que a duração total do experimento. Para um protocolo STP de 120 s (60 s PPF + 60 s PPD), ajuste a duração do varremento para 124 s para permitir 2 s de referência pré e pós-estímulo.
   6. Na aba Entradas , atribua o canal de gravação à entrada atual. Na aba Saídas , atribua o canal de estimulação à saída de voltagem que controla os eletrodos.
   7. Abra a aba Forma de Onda . Na Coluna A, defina o Tipo para Passo, Primeiro Nível para 0 mV e Primeira Duração para 2000 ms para definir uma linha base pré-estimulação.
   8. Na Coluna B (PPF), defina Tipo como Passo. Especifique a amplitude de tensão desejada (por exemplo, +100 mV), duração do pulso (por exemplo, 100 ms) e Taxa de Treinamento para definir o intervalo entre pulsos correspondente ao ciclo de trabalho alvo (por exemplo, 90,9%).
   9. Na Coluna C (PPD), ajuste o Tipo para Passo com a mesma amplitude e duração de pulso, mas aumente a Taxa de Trem ou o intervalo de interpulso para alcançar o ciclo de trabalho desejado mais baixo (por exemplo, 28,6%).
   10. Na Coluna D, configure uma linha de base pós-estimulação idêntica à Coluna A (0 mV, 2000 ms).
       NOTA: Se a duração total de todas as épocas na aba Forma de Onda exceder a duração do varremento na aba Modo/Taxa , aumente ligeiramente a duração do varrimento até que o erro seja resolvido.
   11. Salve o protocolo com um nome descritivo (por exemplo, "STP_120s").
   12. Inicie a gravação do vídeo e imediatamente inicie a aquisição/estimulação elétrica clicando no botão círculo vermelho "Gravar" para registrar os dados. Alternativamente, configure um gatilho digital para que o início da estimulação acione simultaneamente a gravação de vídeo e a aquisição elétrica.
   13. Nos primeiros 60 segundos de estimulação (PPF), a resposta de corrente medida geralmente aumenta a partir do primeiro pulso e pode atingir um platô visível por t = 60 s, enquanto nos últimos 60 segundos de estimulação (PPD), a resposta à corrente medida geralmente diminui (Figura 5). Ao final do protocolo, interrompa a aquisição elétrica e a gravação de vídeo simultaneamente.
2. Experimentos de canal único
   1. No painel frontal do amplificador de patch clamp, configure o interruptor de Entrada de Comando Externo para DESLIGADO. Ajuste a tensão de manutenção para +200 mV. Ajuste o filtro passa-baixa embutido do amplificador para 1 kHz. No software de aquisição, defina a taxa de amostragem para 10–50 kHz e selecione um modo contínuo de gravação "sem lacunas".
      NOTA: Altas taxas de amostragem podem reduzir a relação sinal-ruído dos dados adquiridos. Usar taxas de amostragem mais altas ao resolver transições rápidas de gate ou estados de cintilação de curta duração é importante. As vidas médias abertas da gramicidina A estão tipicamente na faixa de 0,1 s a 10 s, enquanto estados de cintilação podem ocorrer em escalas de tempo sub-ms e μs; portanto, taxas de amostragem de ~50 kHz podem ser necessárias para capturar tais^{eventos 36}. Análises subsequentes de idealização de canal único com JSMURF permitem detecção robusta de eventos em gravações com razões variáveis^{sinal-ruído 37}.
   2. Sem comando externo aplicado, comece a registrar o sinal de corrente base. No amplificador, alterne o comando de tensão de OFF para "+" para aplicar uma tensão DC de +200 mV através do DIB.
   3. Recorde de ~15 s para capturar eventos de canal único enquanto limita a deriva da linha de base. Na concentração molar lipídica:gA de 1:5×^10-6_, a corrente registrada parece em degraus devido à formação e eliminação dos eventos de condutância dos canais.
   4. Antes de parar a gravação, mude o Comando de Voltagem de "+" de volta para DESLIGADO. Pare a aquisição de dados e salve a gravação com um nome de arquivo descritivo (por exemplo, "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      NOTA: Gravações de canal único de duração definida também podem ser realizadas por meio de uma Estimulação Episódica Programada, com amplitude e duração fixas, conforme descrito na Seção 8 para PPF/PPD. Para experimentos de canal único "pós-PPF", a Estimulação Episódica com uma tensão DC de +200 mV é acompanhada imediatamente após os 60 s de PPF.

9. Área de membrana e extrapolação de fluxo

1. Ao final de cada experimento de conjunto (STP, LTP/LTD), mova lentamente um eletrodo lateralmente com os micromanipuladores para destacar o DIB.
2. Afrouxe o suporte do eletrodo do micromanipulador e gire o eletrodo em seu suporte em ~45° para que o fio de prata de 125 μm fique no plano de imagem.
3. Ajuste a altura do eletrodo até que o fio fique em foco nítido no microscópio. Capture uma imagem estática ou captura de tela do fio prateado focado usando o software da câmera. Salve a imagem em escala para calibração posterior do tamanho do pixel para milímetros.
4. Processe os rastros de corrente registrados de acordo com os procedimentos descritos na referência 28 para obter dados contínuos e livres de artefatos de corrente versus tempo (Figura 6A).
5. Determine o mapeamento frame-time dividindo índices de frame pela taxa de frames medida e correspondendo aos carimbos de tempo de aquisição.
6. Importar os quadros de calibração da escala e dos experimentos para o software de análise de imagens.
7. Use o diâmetro conhecido do fio (125 μm) da imagem de calibração da escala para definir a escala espacial usando a função de calibração por software (Analisar > Definir Escala).
8. Para cálculos de fluxo para cada experimento, escolha N pontos de tempo que abrangem o período total de estimulação (por exemplo, 30 pontos de tempo sobre o experimento de 120 s). Certifique-se de que o primeiro ponto de tempo corresponda ao primeiro pulso de estímulo.
9. Em cada ponto de tempo, meça o diâmetro do DIB desenhando uma linha através da interseção da borda da bicamada e registrando seu comprimento em unidades calibradas.
10. Converta cada diâmetro medido em área de membrana (A), assumindo geometria circular ou usando o fator geométrico de escala elipse apropriado para a configuração específica de óleo lipídico. Use as áreas resultantes para avaliar a evolução da área da membrana ao longo do tempo para diferentes condições experimentais (Figura 6B).
11. Para cada ponto de tempo, divida o valor correspondente da corrente pela área para obter fluxo (I/A). Divida todos os N pontos de dados de fluxo pelo primeiro valor de fluxo para obter o fluxo normalizado ao primeiro pulso, (I/A) / (I₀/_{A 0),} quando desejada a análise de fluxo normalizada (Figura 6C).
12. Plote fluxo ou fluxo normalizado vs tempo ou número de pulsos vs tempo. Análise de fluxo repetida para todos os experimentos em conjunto (STP, LTP/LTD) (Figura 6D).
13. Interprete elevações persistentes de fluxo ou fluxo normalizado em relação ao primeiro pulso durante a DPP ou além de 2 minutos como condução aprimorada, enquanto retornos ao valor de base ou diminuições abaixo do valor do primeiro pulso indicam condução deprimida. Use as escalas de tempo resultantes para classificar as respostas como comportamento de plasticidade de curto prazo (<2 min) ou comportamento de potencialização / depressão a longo prazo (> ~5 min).

10. Análise de canal único

1. Importe gravações brutas de canal único para um ambiente de análise preferido ou para a interface clampSeg e consulte^{o 37} para descrições completas e explicações das funções do software.
2. Aplique um filtro passa-baixa digital correspondente ao filtro experimental de aquisição (por exemplo, Bessel de 1 kHz).
3. Configuração de parâmetros.
   1. Defina alfa (α) = 0,05, definindo o nível de confiança estatístico de modo que cada passo detectado tenha <5% de probabilidade de ser uma flutuação aleatória de ruído.
   2. Especifique de 5.000 a 10.000 iterações de Monte Carlo por segmento de 1 s para estimar a distribuição de ruído e aumentar a robustez estatística da detecção de eventos.
      NOTA: Use processamento computacional paralelo em "blocos" de 1 s, se disponível, para reduzir o tempo de análise.
   3. Execute o algoritmo JSMURF no rastreio de corrente filtrado.
4. Validação do modelo.
   1. Sobreponha-se a trilha idealizada de condutância (onda quadrada) sobre a trilha de corrente filtrada e confirme visualmente que as transições em degraus coincidem com mudanças abruptas no sinal experimental.
   2. Use as características conhecidas do filtro passa-baixa para gerar uma reconstrução convoluta da trilha idealizada e sobreponha-a sobre a trilha^{bruta 37}. Confirme que o sinal reconstruído corresponde de perto ao envelope de tempo e amplitude da corrente registrada.
5. Quantificação da condutância e do tempo de vida.
   1. Defina o platô estável mais baixo no traço idealizado como o estado de base fechado. Identifique a primeira amplitude de platô diferente de zero como a condutância primária em estado aberto (nível de canal único).
   2. Classifique múltiplos inteiros mais altos dessa amplitude como estados abertos multicanal (2+, 3+, etc.). Identifique platôs intermediários que são estáveis, mas abaixo dos níveis abertos completos, como estados de subcondutância.
   3. Extraia a amplitude e a duração de cada evento do traço idealizado e agrupe-os para gerar histogramas de amplitude de condutância e histogramas de vida útil.
6. Histogramas de amplitude e distribuições ao longo da vida
   1. Compare os histogramas idealizados de condutância-amplitude com os histogramas de amplitude gerados diretamente a partir dos dados filtrados. Confirme que os histogramas idealizados exibem picos mais nítidos e melhor separados, correspondentes aos estados discretos^{de condutância 37}.
   2. Para cada condição experimental, calcule-se a função de sobrevivência N(t)/N(0), onde N(0) é o número total de eventos abertos (plenos e subcondutância) e N(t) é o número de eventos com durações maiores que t. Exclua intervalos de estado fechado desta análise.
   3. Plote N(t)/N(0) em função do tempo e ajuste funções de decaimento exponencial usando uma rotina de mínimos quadrados não linear em um software preferido.
   4. Interprete deslocamentos para a direita nos picos de distribuição de condutância em histogramas de amplitude como aumento da condutância, constantes de tempo de decaimento mais longas em N(t)/N(0) versus gráficos de tempo como maior estabilidade em estado aberto, e distribuições deslocadas para a esquerda como vidas de canal mais curtas.
      NOTA: Minimize distúrbios ambientais, como correntes de ar, vibrações e objetos próximos em movimento. Evite se apoiar na mesa óptica e mantenha as conversas longe do setup experimental. Mantenha celulares, tablets, laptops e outros dispositivos eletrônicos pessoais a pelo menos 1,5 m de distância da gaiola de Faraday para reduzir interferências eletromagnéticas. Use um reservatório de óleo opticamente transparente e otimize a iluminação e o contraste do microscópio para afiar as bordas das gotículas e bicamadas. Adquira e/ou exporte vídeos em escala de cinza se isso melhorar o contraste de fronteira e simplificar as medições manuais do diâmetro do DIB. Para experimentos que não investigam efeitos da temperatura, certifique-se de que o ambiente do laboratório, o suporte do microscópio e o óleo sejam mantidos entre 21 e 22 °C.

Results

Configuração experimental DIB
O sistema de gravação é alojado dentro de uma gaiola de Faraday sobre uma mesa anti-vibração, com dados elétricos e de vídeo adquiridos por dois computadores separados (Figura 1A), embora um único computador com capacidade de tela dividida possa ser utilizado. O ambiente da amostra DIB consiste em dois eletrodos revestidos de agarose, submersos em um volume definido de óleo de alcano (Figura 1B). Figura 1C mostra um esquema das conexões elétricas e ópticas essenciais para o montamento experimental descrito neste manuscrito.

Figura 1: Configuração experimental. (A) Mesa antivibração e gabinete da gaiola de Faraday com componentes principais indicados, incluindo amplificador, digitalizador, filtro de ruído, geradores de funções e interface de computador duplo para aquisição elétrica e de vídeo. (B) Vista frontal do ambiente da amostra DIB e dos eletrodos. (C) Esquema das conexões elétricas e ópticas associadas ao sistema experimental descrito neste manuscrito. Todos os componentes individuais compartilham um terreno comum no prédio do laboratório. Todos os experimentos foram realizados em temperatura ambiente (21–22 °C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Preparação e controle de qualidade dos eletrodos Ag/AgCl
Derreter a ponta do fio prateado forma uma esfera esférica (Figura 2A); fundidos de baixa qualidade aparecem oblongos ou irregulares. A cloração na água sanitária produz uma superfície opaca de Ag/AgCl marrom-acinzentado (Figura 2B). Uma camada fina e uniforme de agarose, com espessura de dezenas de micrômetros na bola, é essencial para suporte estável de gotículas e acoplamento eletroquímico de baixa impedância, enquanto revestimento desigual leva a uma fixação deficiente das gotículas (Figura 2C).

Figura 2: Preparação do eletrodo. (A) Imagens de microscópio de eletrodos de boa e baixa qualidade. (B) Comparação entre cabeças de eletrodos não clorados e clorados. (C) Exemplos de revestimentos de agarose de boa e baixa qualidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Configuração de eletrodos. (A) Vista superior do alinhamento do ângulo do eletrodo montado. (B) Vista lateral de comparação de gotículas não caídas imediatamente após a carga de LUV com gotículas caídas após formação de monocamadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Posicionamento do eletrodo e comportamento de queda das gotículas
Vistas de cima para baixo mostram o posicionamento angular correto dos eletrodos para minimizar a distorção óptica (Figura 3A). As vistas laterais comparam gotículas não caídas (imediatamente após a carga da solução de LUV) e gotículas revestidas de lipídios (após 5 minutos) (Figura 3B). Gotículas caídas usadas para formar um DIB apresentam resposta física retardada ao movimento devido à diminuição significativa da tensão superficial das monocamadas lipídicas, confirmando visualmente a formação de uma gota aquosa suspensa totalmente revestida por uma monocamada lipídica. Após o afundamento ser estabelecido, a estimulação por onda triangular é usada para fornecer confirmação elétrica da formação da bicamada e da estabilidade³⁵.

Figura 4: Formação de bicamadas da interface de gotículas. (A) Sequência de lapso de tempo mostrando formação e expansão de bicamadas após o contato de gotículas. (B) Reflexão interna da membrana usada para estimar diâmetro e área da bicamada. A imagem DIB é realizada por baixo do sistema, via um microscópio invertido. Barra da escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Formação e medição de área do DIB
Imagens sequenciais capturam o "zipping" espontâneo de duas camadas e a expansão da área quando duas gotas caídas entram em contato (Figura 4A). As reflexões ovaladas internas brilhantes no contato da gota são usadas para estimar o diâmetro da bicamada e, por extensão, a área da membrana ao longo do tempo (Figura 4B).

Figura 5: Protocolo STP — estimulação e resposta. Respostas representativas de corrente durante a facilitação de pulsos pareados (PPF, 0–60 s, vermelho) e a depressão de pulso pareado (PPD, 60–120 s, azul) são mostradas (em cima), juntamente com o protocolo de estimulação correspondente (embaixo). Pulsos PPF e PPD têm duração de 100 ms com tempos de OFF de 10 ms e 250 ms, respectivamente, resultando em ciclos de trabalho de 90,9% e 28,6%. Facilitação corresponde a aumentos líquidos na corrente iônica; Depressão corresponde a diminuições líquidas. As respostas atuais são registradas apenas durante os períodos de ON; Para visualização, os dados entre pulsos são interpolados para destacar tendências gerais na corrente. Os esquemas dos pulsos, os tempos, os tempos e o número de pulsos dentro das fases PPF e PPD não são desenhados em escala e são ilustrados para fins de visualização. Dados representativos de resposta à corrente reproduzidos de Podar PT et al.,²⁵ sob CC BY-NC-ND 4.0. Direitos autorais © 2025 O(s) Autor(es). Publicado pela PNAS. Esquema de estimulação modificado para o presente manuscrito. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo de estimulação elétrica para induzir comportamento semelhante à plasticidade de curto prazo (semelhante a STP)
Os padrões de estimulação denotados aqui representam facilitação de pulsos pareados (PPF) e depressão (PPD) por analogia à terminologia da neurociência, semelhante a Koner e Najem^28,29. A facilitação de pulsos pareados (PPF; 0–60 s) e a depressão por pulsos pareados (PPD; 60–120 s) são realizadas usando pulsos de 100 ms com tempos de desligamento de 10 ms e 250 ms, respectivamente, correspondendo a ciclos de trabalho de 90,9% para PPF e 28,6% para PPD. O painel superior mostra respostas representativas da corrente durante os períodos de ON, enquanto o painel inferior mostra o padrão de estimulação.

Corrente, área e fluxo iônico durante STP e subsequente estimulação de longo prazo
Corrente normalizada (I/_{I 0}) para bicamadas DPhPC dopadas com gA nos óleos C16 e C12/C16 é mostrada durante PPF e PPD (Figura 6A). A área normalizada da membrana (A/_{A 0}) medida em 30 pontos de tempo revela evolução semelhante da área em ambas as condições do petróleo, apesar das correntes diferentes (Figura 6B). Os dados para corrente e área normalizadas são representados como médias ± nuvens e barras de S.D., respectivamente, em 28 DIBs independentes por condição de óleo. Fluxo normalizado, J/_{J 0} = (I/_{I 0})/(A/_{A 0}), separa as mudanças independentes da área na condutância e é consistente com mudanças na condução da membrana além da simples expansão de área (Figura 6C). No entanto, essas mudanças podem refletir contribuições tanto da condutância de canal único quanto do número de canais condutores ativos. A estimulação prolongada da DPP por até 30 minutos produz um comportamento prolongado semelhante à depressão (LTD) nas membranas C16, mas mantém fluxo elevado, consistente com comportamento semelhante ao da LTP nas membranas C12/C16 (Figura 6D). Juntos, esses dados mostram que a composição da membrana modula tanto mudanças de plasticidade em curto quanto longo prazo, semelhantes a mudanças no fluxo iônico.

Figura 6: Corrente, área e fluxo iônico calculado de DIBs durante STP e transição para LTP/LTD. (A) Corrente normalizada (I/I₀) durante PPF (0–60 s, fundo branco) e PPD (60–120 s, fundo cinza) para membranas DPhPC dopadas com gA em óleos C16 (laranja) e C12/C16 (azul), com cada condição composta por n = 28 DIBs formados de forma independente. (B) Áreas de membrana normalizadas (A/A₀), medidas em 30 pontos de tempo, mostrando trajetórias de área comparáveis apesar das respostas de corrente diferentes; os dados são mostrados como média ± S.D. no mesmo n = 28 DIBs independentes por condição de óleo. (C) Fluxo normalizado, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), é calculado a partir das respectivas medições de corrente e área, destacando mudanças na condutância além dos efeitos de área. (D) Comportamento a longo prazo sob estimulação prolongada de DPP: após os 120 s iniciais de STP (sombreado em cinza), os DIBs foram submetidos a 30 minutos de PPD com pulsos ON = 100 ms e OFF = 250 ms (vermelho/verde sólido) ou 30 s (laranja/cinza). O fluxo decai até ou abaixo do nível basal nas membranas C16, indicando comportamento semelhante ao LTD, mas permanece elevado nas membranas C12/C16, indicando comportamento persistente semelhante ao LTP. Regiões sombreadas representam erro propagado de I/I₀ e A/A₀. Conjuntos de dados de PPD estendido em (D) foram obtidos a partir de n = 6 DIBs independentes por condição de óleo para o protocolo 120 s, seguidos por 3 DIBs por condição PPD estendida. Todos os pontos de dados são conectados apenas para fins de visualização. Os painéis A, B e D foram reproduzidos sob CC BY-NC-ND 4.0. Direitos autorais © 2025 O(s) Autor(es). Publicado pela PNAS. O Painel C foi recentemente gerado para o presente manuscrito a partir de dados relatados em Podar PT et al.,²⁵. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Traço representativo de corrente de canal único de 15 s de um DIB dopado com gA formado em óleo C16 após estimulação com PPF
O traço inclui o sinal bruto capturado a 50 kHz com um filtro passa-baixa de 1 kHz, um traço de 8 polos filtrado por Bessel a 250 Hz e o ajuste idealizado do JSMURF. O nível estável mais baixo define o estado fechado, e níveis superiores correspondem a eventos de canal único, multicanal e subcondutância. Esses traços fornecem a base para a análise de amplitude e vida útil da condutância. O exemplo de tempo de permanência no estado de condutância indicado representa a duração de um nível específico de condutância, cuja amplitude e duração refletem a contribuição combinada de múltiplos eventos simultâneos de total e/ou subcondutância.

Distribuição de amplitude e duração da condutância
Histogramas de amplitude de condutância para membranas C16 e C12/C16 (Figuras 7A–B) comparam condições pré-PPF e pós-PPF em uma razão molar DPhPC:gA de 1:5×^10-6. As aproximações gaussianas abaixo dos dados indicam deslocamentos nos picos médios de condutância após a PPF e resolvem picos separados correspondentes a subcondutância e estados multicanais. Comparações estatísticas das distribuições de condutância foram realizadas com dados agrupados em nível de evento usando o teste t de Welch e o teste U de Mann-Whitney (α = 0,05), com cada condição compreendendo 3 registros DIB independentes e N para um dado estado de condutância indicando o número total de eventos detectados agrupados nesses registros. Distribuições de probabilidade ao longo da vida, N(t)/N(0), antes e depois (Figura 7C–D) mostram que as membranas C12/C16 desenvolvem distribuições de condutância com cauda mais longa e tempos de vida alterados em relação ao C16, indicando mudanças na estabilidade do canal. Os dados do histograma representam o traço filtrado de 15 s (traço vermelho) adquirido para cada condição. Distribuições de vida útil do estado de condutância foram geradas a partir de 3 gravações DIB independentes por condição; Curvas pontilhadas denotam réplicas individuais, e curvas sólidas denotam ajustes exponenciais globais a N(t) / N(0) versus t.

Figura 7: Histogramas de amplitude de condutância e distribuições de tempo de permanência do estado de condutância. Histogramas de amplitude de condutância para atividade de gA nas membranas (A) C16 e (B) C12/C16 comparam condições pré-PPF (cinza) e pós-PPF (laranja/azul) em uma proporção molar de 5 × 10-6 gA:lipídicos. Aproximações gaussianas abaixo dos histogramas indicam deslocamentos nos picos médios de condutância e desvios padrão para estados de canal único e múltiplo. Os deslocamentos na condutância média após a PPF são indicados por linhas tracejadas (preto = pré-PPF; azul/laranja = pós-PPF) e setas. Cada condição representa 3 gravações DIB independentes. Comparações estatísticas das distribuições de condutância foram realizadas com dados agrupados em nível de evento usando o teste t de Welch e o teste U de Mann-Whitney (α = 0,05), onde N para um dado estado de condutância denota o número total de eventos detectados somados nessas três gravações. Eventos de subcondutância também foram incluídos na análise, com distribuições representativas de subcondutância indicadas à esquerda do primeiro pico em estado aberto para cada condição de membrana. Distribuições de probabilidade ao longo da vida de eventos de estado de condutância nas membranas C16 (C) e C12/C16 (D) antes (laranja / azul) e após a estimulação PPF (laranja escuro / azul escuro) a 5×^10-6 M gA:lipídios correspondem às análises de condutância mostradas na Figura 7A–B. Aqui, N(t) representa o número acumulado de eventos de total e subcondutância com durações maiores que o tempo t. Linhas pontilhadas indicam distribuições de vida útil de réplicas individuais (n = 3 DIBs independentes por condição), e os conjuntos sólidos mostram ajustes exponenciais globais realizados usando software de ajuste de curvas não lineares. Painéis A–D reproduzidos de Podar PT et al.,²⁵ e compilados para o presente manuscrito sob CC BY-NC-ND 4.0. Direitos autorais © 2025 O(s) Autor(es). Publicado pela PNAS. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Sondagem do comportamento de canal único — traço de resposta atual para DIBs em C16 após estimulação PPF. (A) Exemplo 15 s de traço de corrente mostrando dados brutos (azul), filtrado com um filtro passa-baixa Bessel de 8 polos de 250 Hz (vermelho), e o traço idealizado (verde) usado para identificar estados de condutância. O nível estável mais baixo define o estado "fechado" de base. (B) Níveis representativos de subcondutância detectados entre o^2º e o^3º níveis de condutância completa, corroborados por picos intermediários distintos no histograma de amplitude (ver Figura 7A, laranja). Os tempos de permanência de condutância são extraídos da duração de cada nível de condutância identificado (excluindo o estado fechado) para gerar distribuições de vida útil N(t)/N(0). Reproduzido de Podar PT et al.,²⁵ sob CC BY-NC-ND 4.0. Direitos autorais © 2025 O(s) Autor(es). Publicado pela PNAS. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Após a PPF, as membranas C12/C16 exibem um deslocamento pronunciado para a direita nas distribuições de amplitude da condutância, indicando condutância aprimorada em canal único, acompanhado por um deslocamento para a esquerda nas distribuições de vida útil do estado de condutância, consistente com tempos de abertura do canal mais curtos. Essas mudanças são consistentes com o afinamento eletromecânico da bicamada C12/C16 durante a PPF, conforme apoiado por medições mecânicas diretas e de espessura relatadas na referência 25, que reduzem a barreira energética para o transporte de íons através do gA e aumentam o fluxo de íons por abertura, reduzindo a estabilidade do canal. Em contraste, as membranas C16 apresentam mudanças mínimas em ambas as distribuições, destacando sua adaptabilidade estrutural limitada. Em conjunto, esses resultados demonstram que a plataforma DIB captura tanto correlatos de conjunto quanto de canal único da adaptação eletromecânica da membrana, incluindo mudanças semelhantes a STP e LTP/LTD na condução iônica decorrentes da dinâmica dependente da composição da membrana (Figura 8).

Discussion

Na prática, esse método oferece três capacidades experimentais chave: variação controlável da composição em bicamada por meio da composição lipídica e fase oleosa, monitoramento óptico e elétrico simultâneo da reestruturação de membranas, e acesso a um regime de área de membrana que conecta a eletrofisiologia de canal único e a mecânica de membranas^{em mesoescala} 14,15,20,21,25 . Essas características tornam o método particularmente útil para estudos estrutura-função em sistemas simplificados de membranas, onde a eletromecânica de membranas, em vez da complexidade celular total, é a perspectiva experimental de interesse 14,15,20,21,25,39.

Este protocolo descreve a montagem e análise de DIBs dopados com gramicidina A em óleos alcanos para investigar a capacidade das membranas lipídicas de se reestruturarem sob estimulação elétrica fisiologicamente^relevante 14,15,25,35,38. Comparado às técnicas de pinça de patch²¹, a plataforma DIB interroga patches de membrana que são ordens de magnitude maiores, mantendo resolução suficiente para capturar eventos discretos de canais^iônicos 14,15,19,20,21,28,38 . Essa capacidade é particularmente valiosa para resolver remodelações eletromecânicas em mesoescala (por exemplo, eletroumedecimento e eletrocompressão) e vinculá-las ao comportamento dos canais microscópicos que, coletivamente, dão origem a fenótipos de condutância de membrana semelhantes a STP, LTP e LTD sob estimulação fisiologicamente^inspirada 13,25,27,38 . O sistema DIB atual não tem a intenção de replicar a complexidade molecular das sinapses^biológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Assim, termos como STP, LTP, LTD, PPF e PPD são usados em um sentido descritivo e baseado em analogias para denotar aumentos e diminuições em escalas de tempo curtas e longas na condução iônica de membrana sob protocolos de estimulação definidos. As principais descobertas deste trabalho são, portanto, interpretadas de forma mais direta em termos de eletromecânica de membranas, adaptação de condutância e reestruturação fora do equilíbrio dependente da composição em DIBs, o que pode oferecer analogias conceituais úteis e perspectivas físicas sobre plasticidade sináptica sem implicar equivalência mecanicista com circuitos neuronais ou regulação sináptica^bioquímica 10,11,25,38.

Vários passos técnicos são críticos para obter resultados reprodutíveis. A preparação cuidadosa do eletrodo Ag/AgCl, incluindo fusão uniforme da ponta esférica de prata, cloração completa e uma camada fina e uniforme de agarose, garante fixação estável de gotículas e acoplamento eletroquímico^{de baixa impedância 20,35}. A confirmação visual do afundamento das gotículas e a correta orientação dos eletrodos minimizam a distorção óptica durante a gravação de vídeo e melhoram a precisão das medições da área da membrana. A calibração pós-aquisição em escala usando o diâmetro conhecido do fio de prata proporciona uma conversão robusta de pixel para mm, essencial para o cálculo confiável da área da membrana e do fluxo iônico. Neste trabalho, a condutância de membrana (fluxo) é definida como corrente por unidade de área (I/A), e como a área do DIB muda durante a eletroumedição, a quantificação precisa do fluxo requer medições de corrente e área de bicamada com correspondência^temporal 13,25,27,35.

Essa abordagem também suporta leituras complementares em nível de conjunto e canal único dentro da mesma plataforma^{14, 15, 20, 25, 35, 38}. No nível de conjunto, gravações sincronizadas de vídeo e elétricas quantificam mudanças dinâmicas em área (eletrowetação) e corrente, das quais é derivado o fluxo iônico (corrente/área). Sob estimulação elétrica, as membranas são conduzidas a estados estacionários fora do equilíbrio (NESS), onde a reestruturação dependente da composição gera respostas semelhantes à plasticidade em escala de tempo curta, que podem evoluir para comportamentos semelhantes a potenciação ou depressão em escalas de tempo mais longas ao longo de períodos prolongados (min^{)25,26,28,29,30,31,32,33,38}. No nível de canal único, a análise envolve idealizar trilhas de corrente em níveis de condutância em etapas (estados fechado, de canal único, multicanal e subcondutância). Ferramentas tradicionais de idealização de ondas quadradas normalmente resolvem apenas um número limitado de níveis discretos; para dados mais complexos ou barulhentos, métodos de idealização sem modelo, como JSMURF, são^{preferidos 37}. Potenciais de retenção DC breves analisados com JSMURF fornecem detecção estatisticamente rigorosa de eventos sob ruído heterogêneo, resultando em histogramas de condutância-amplitude (níveis inteiros e subcondutância) e distribuições de vida útil N(t)/N(0). A sobreposição de histogramas de amplitude idealizados e filtrados permite a validação cruzada visual e quantitativa das atribuições de estado de conduta, enquanto reconstruções convolutórias (trilhas idealizadas passadas pelo filtro passa-baixa conhecido) confirmam escolhas de parâmetros e fidelidade de eventos³⁷.

A composição da membrana, ajustada aqui através da fase oleosa ao redor (por exemplo, C16 vs C12/C16), deve modular a viscoelasticidade e a capacidade de reestruturação em duas camadas sob estimulação elétrica, consistente com medições diretas relatadas em trabalhos^anteriores 22,25,39. Membranas mais flexíveis devem apresentar maior afinamento causado pelo CE e melhor compatibilidade hidrofóbica com gA durante o PPF ^22,23,25, levando a um aumento da condutância e facilitação de canal único que podem se estabilizar como comportamento semelhante ao ^{LTP 25,38}. Por outro lado, membranas mais rígidas apresentam resposta estrutural limitada, mudanças menores de condutância durante PPF e PPD, e tendência para LTD sob pulsações prolongadas. Esses resultados dependentes da composição destacam como as propriedades materiais predispõem as membranas a regimes distintos e funcionalmente relevantes de longo^prazo 22,23,25,39.

A plataforma DIB também possui limitações^{importantes 21}. A interpretação mecanicista apresentada aqui é que diferenças na composição do óleo alteram propriedades dos materiais em duas camadas e a suscetibilidade à reestruturação eletromecânica, o que, por sua vez, modula a condução A^{da gramicidina A} 22,23,25. Essa interpretação é apoiada pelo estudo anterior, que mediu diretamente a viscoelasticidade da membrana, a tensão interfacial, bem como as mudanças dinâmicas na espessura da membrana sob essas condições e^{estimulação 22}. No presente trabalho, entretanto, essas propriedades do material não foram medidas simultaneamente em cada experimento e, portanto, são usadas aqui para apoiar as diferentes respostas estruturais e mecânicas à estimulação elétrica de membranas em ambientes C16 e C12/C16, em vez de estabelecer independentemente a interpretação mecanicista dos dados. Além disso, corrente e fluxo de conjunto podem refletir tanto mudanças na condutância de canal único quanto mudanças no número de canais condutores, que podem variar com a área da membrana, difusão peptídica e dimerização sob condições fora do^equilíbrio 17,18,22,23. A fase oleosa ao redor também pode infiltrar-se ou recuar dinamicamente do núcleo bicamada durante a estimulação, contribuindo para a deriva de base em registros de canal único e mudanças graduais na composição da membrana ao^{longo do tempo 13,21,25}. Juntos, esses fatores limitam o uso de gravações de tensão constante de longa duração para definir propriedades estáticas de membrana e enfatizam que as DIBs se comportam como sistemas abertos e dinâmicos, e não como membranas de equilíbrio^fechado 13,21,25. Assim, embora o protocolo atual capture mudanças de condução dependentes da estimulação, semelhantes à plasticidade, ao longo das escalas de tempo experimentais^{previstas 25,38}, estudos futuros que combinem medições mecânicas diretas com gravações elétricas e ópticas simultâneas, potencialmente junto com imagens de molécula única baseadas em fluorescência, serão necessários para resolver de forma mais completa as respectivas contribuições da reestruturação de membranas, condutância de canais e população de canais^21,25.

Modos comuns de falha incluem fixação instável de gotículas, queda incompleta das gotículas, coalescência prematura de gotículas durante a formação da bicamada e má definição óptica da borda da bicamada durante a análise de área. A fixação instável de gotículas é frequentemente causada por geometria irregular de bola de prata ou revestimento irregular de agarose e pode ser reduzida verificando a simetria da bola e mantendo uma casca lisa de agarose. O carregamento de eletrodos também requer a deposição manual de gotículas aquosas do tamanho de nanolitros em uma cabeça de eletrodo submilimétrica, o que exige grande coordenação motor-mão e percepção de profundidade em meios de diferentes índices de refração (ar vs óleo). Como resultado, a ponta da pipeta pode inadvertidamente tocar a casca de agarose ou errar a cabeça do eletrodo durante a dispensação. Técnicas de aumento de estabilidade, como a aplicação de braçadeiras de punho, avanço lento da pipeta no óleo e segurar a respiração, juntamente com prática repetida, podem melhorar a proficiência na carga. Além disso, o afundamento incompleto ou a formação tardia de monocamadas podem resultar da heterogeneidade das vesículas, variação de temperatura ou topografia de agarose, podendo ser melhorado aumentando o tempo de espera após a deposição de^gotículas 15,20,35. A coalescência durante a formação de duas camadas está frequentemente associada a área de contato excessiva ou a uma estimulação elétrica excessivamente agressiva (> ± 200 mV) e pode ser mitigada usando áreas de contato inicial menores para gotículas, permitindo tempo adicional para estabilização da monocamada e verificando a resposta de capacitância de onda triangular de baixa amplitude antes de pulsar 25,35,38.

Apesar dessas limitações, a plataforma DIB é altamente ajustável, escalável e reprodutível 14,15,20,21,25,35,38,40, e complementa a eletrofisiologia centrada em proteínas ao isolar a contribuição da mecânica lipídica para a condução 22,23,25. Ao unificar medições de conjunto e de canal único em um único sistema, esse protocolo oferece uma rota prática para dissecar como o trabalho elétrico e a viscoelasticidade da membrana se combinam para produzir comportamentos condutores semelhantes aos sinápticos (semelhantes a STP, LTP e LTD) em um modelo controlável, de baixo para cima^{, 25,29,30,31,32,33,38}. Assim, a metodologia oferece uma base para a exploração sistemática de regras de aprendizagem dependentes da composição em membranas e para quantificar como forças mecânicas e elétricas acoplam proteínas membranares à sua bicamada hospedeira em escalas temporais e^espaciais 21,22,23,25 . Coletivamente, essas capacidades posicionam as DIBs como uma estrutura poderosa para desconstruir comportamentos neurobiológicos complexos em mecanismos biofísicos tratáveis e^testáveis 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-difitanoi-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC)	Lípidos polares Avanti	850356P/850356C	Comprado como pó liofilizado (P) ou em clorofórmio (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarose (Comprimidos de Agarose 0,5g)	Referência	A2501	Você pode usar a forma em pó ou os comprimidos
Gerador de formas de onda Agilent Technologies 33522A	Keysight	–	Você pode usar qualquer gerador de forma de onda com saídas de cabo BNC
Gás Argônio (Ar)	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argônio comprimido; Ultra Alta Pureza
Balanço analítico	Mettler Toledo	Modelo: MS304S/03	Qualquer balanço analítico de nível laboratorial com precisão de 0,0001 g
Amplificador Axopatch 200B	Dispositivos Moleculares	–
BK Precision 4017B 10 MHz Gerador de Varredura/Função de DDs	Digi-Key	BK4017B-ND
Capilares de Vidro Borosilicato	Instrumentos de Precisão Mundial	1B100F-4
Suíte de Software Clampex pCLAMP 11	Dispositivos Moleculares	–
Sistema DigiData 1550B	Dispositivos Moleculares	–	Isso inclui um mini-extrusor, 2 seringas, 100 membranas PC, 100 suportes de filtro e 1 suporte/bloco de aquecimento
Dodecano, 99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
Conjunto de extrusores com suporte/bloco de aquecimento	Lípidos polares Avanti	610000
Software de Fiji	ImageJ	–
Freezer (-80 ° C)	Fisher Scientific	Isotemp; Modelo: 8964; Número de autor: 828278-21
Vidraria	VWR International	–
Gramicidina-A	Millipore Sigma	368020
Hexadecano, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Eliminador de Ruído de Insetos (60Hz)	Sistemas A-M	726300
Sistema de Microscópio Invertido (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Qualquer microscópio invertido ou vertical pode ser usado
Álcool isopropílico	VWR International	BDH1133-4LP
Suporte de Microeletrodo	Instrumentos de Precisão Mundial	MEH1S
Micromanipuladores	Instrumento Sutter	MP-285	Manipuladores manuais podem ser usados
Câmera de Microscópio	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Software de Câmera para Microscópio NIS-Elements	Nikon	–	Software de captura de câmera com capacidade de visualização ao vivo e/ou vídeo pode ser utilizado. Visualização ao vivo e gravação simultânea de tela podem ser usadas para substituir a captura de vídeo.
Filme de Laboratório Multiuso Parafilm M	Parafilm	PM999
Placa de Petri	-	-	O prato deve ser transparente na parte inferior e, idealmente, também na parede lateral
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Luvas de Exame de Nitrilo Mole Sem Pó	VWR International	CA89-38-272
Refrigerador (4 e degraus; C)	Fisher Scientific	CAT: 97-938-1; Modelo NO: 3556FS
Fio de prata	GoodFellow	147-346-94
Placa Quente de Mexida	Thermo Scientific & nbsp;	SP131325