Isolando Células Individuais de Embriões Precoces de Xenopus e Classificando-os por Tamanho

Resumo

Descrevemos um método para isolar células individuais de embriões iniciais de Xenopus laevis e separá-las pelo tamanho celular.

Resumo

A embriogênese precoce requer uma diminuição exponencial no tamanho celular, enquanto o embrião permanece constante em tamanho nos estágios mais iniciais do desenvolvimento. A importância funcional e os mecanismos pelos quais o tamanho das células impacta o desenvolvimento embrionário ainda são amplamente pouco estudados. O embrião inicial de Xenopus oferece um sistema único para preencher essas grandes lacunas. Comparado a outros organismos modelo, o embrião precoce de Xenopus é extremamente grande e contém um gradiente de tamanho celular, desde pequenas células no polo animal até grandes células no polo vegetal, em todo o embrião em estágios próximos à transição média-blastula. Aqui, descrevemos um protocolo para dissociar células individuais de embriões iniciais de Xenopus e separá-las por tamanho usando peneiras celulares com tamanhos variados de poros em malha. Conforme determinado por imagens e medições de tamanho, as células ordenadas estão dentro da faixa de tamanho esperada e podem ser usadas para análise ou sequenciamento de células vivas, ou fixas para imagens. Esse sistema lançará nova luz sobre a revelação de mecanismos regulatórios dependentes do tamanho durante o desenvolvimento inicial.

Introdução

A mudança no tamanho celular é uma característica comum da embriogênese precoce, quando o óvulo fertilizado passa por múltiplas rodadas de clivage, gerando um número crescente de células. Embora se saiba muito sobre o papel do tamanho celular como um dos principais parâmetros que controlam as funções^{celulares 1,2,3}, como o tamanho celular impacta o desenvolvimento inicial é menos conhecido. Trabalhos recentes em vários sistemas embrionários modelo sugerem que o tamanho celular regula a ativação do genoma zigótico (ZGA⁾⁴ e a especificação de destino celular⁵, apoiando um papel importante para o tamanho celular nas decisões de^{desenvolvimento 6,7}.

O embrião precoce de Xenopus é um modelo importante para estudar a tomada de decisão de desenvolvimento regulada pelo tamanho celular. Como o embrião inicial de Xenopus é grande (~1,2 mm de diâmetro), é fácil manipular seu tamanho fisicamente, tornando-o útil para avaliar as consequências diretas da mudança no tamanho celular. Por exemplo, mini embriões de tamanhos variados podem ser gerados pela constrição de embriões de célula 1 usando os laços^{capilares 4,8}, demonstrando a ZGA dependente^{da dose 4}. Além disso, o embrião inicial de Xenopus contém um gradiente de tamanhos celulares ao longo do eixo animal-vegetal, com as menores células no polo animal e as maiores células no polo vegetal, demonstrando uma diferença de mais de 100 vezes no volume⁴. Importante, ao visualizar e quantificar diretamente transcritos nascentes em células individuais de embriões de montagem inteira, identificamos um limiar de tamanho celular que regula o^{ZGA 4}. Além disso, o isolamento de células individuais de embriões precoces de Xenopus e a separação por tamanho confirmaram a importância do limiar de tamanho celular^{ZGA 4}.

Aqui descrevemos os procedimentos detalhados para isolar células individuais de embriões iniciais de Xenopus laevis e separá-las por tamanho. Embriões iniciais de Xenopus podem ser dissociados em células individuais incubando-as em meio livre Ca²⁺, Mg²⁺ (CMFM⁾⁹, e essas células individuais podem ser posteriormente separadas usando peneiras celulares com tamanhos variados de poros de malha. As células ordenadas podem ser purificadas e usadas em diversas aplicações, incluindo análise de células vivas, sequenciamento ou ensaios de imagem.

Protocolo

O trabalho com animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Sul.

1. Preparação da solução

NOTA: Antes de iniciar o protocolo, prepare as seguintes soluções.

1. Prepare 20× MMR: misture 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM_{MgCl 2} e 40 mM_{CaCl 2}. Ajuste o pH para 7,8 com NaOH. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente.
2. Prepare Ca²⁺, Mg 2⁺-medium livre (CMFM): misture 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM_{Na 2}HPO₄, 0,9 mM KH₂PO₄, 2,4 mM_{NaHCO 3} e 1,0 mM EDTA. Ajuste o pH para 7,4, se necessário. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente.
3. Prepare um gel de agarose a 1,5% em placa de Petri de 60 mm: Adicione 0,75 g de agarose a 50 mL de CMFM. Aqueça para dissolver a agarose em um micro-ondas. Adicione 5-10 mL de gel de agarose para revestir uma camada fina em uma placa de Petri de 60 mm.
4. Prepare um meio com gradiente de densidade (wt/vol)/CMFM: Adicione lentamente 15 g de meio gradiente de densidade em 100 mL de CMFM. Para facilitar a dissolução, aqueça e mexa em uma placa até que o meio gradiente de densidade seja completamente dissolvido. Mantenha a solução a 4 °C até o uso.
5. Prepare 4% de PFA/1× MEM: Misture 1 frasco (10 mL) de estoque de paraformaldeído a 16% e 4 mL de 10× de MEM (1000 mM de pH 7,4 de MOPS, 20 mM de EGTA e 10 mM de_{MgSO 4}). Adicione água ultrapura a 40 mL.
   NOTA: Para obter embriões de Xenopus , siga um protocolo padrão para realizar fertilização in vitro (FIV) (por exemplo, veja Sive et al., 2007)¹⁰. O embrião deve estar em 0,1× MMR pronto para uso.

2. Dissociação de embriões precoces em células individuais

1. Adicione ~15 mL do CMFM a uma nova placa de Petri de 60 mm revestida com gel de agarose a 1,5%. Use uma pipeta plástica de transferência para transferir de 10 a 100 embriões (dependendo das necessidades experimentais) para o recipiente. Coloque a antena sob um estereoscópio.
2. Use uma pinça com as duas mãos para remover cuidadosamente a membrana da vitelina, prendendo-a na superfície dos embriões com uma pinça e descascando com a outra. Evite danificar os embriões durante o processo.
3. Incube os embriões devitellinados no CMFM por ~1 hora em temperatura ambiente. Agite o prato muito suavemente a cada 5 minutos para facilitar a dissociação das células. Verifique regularmente até que não sejam vistos pilhas de blastômeros (Figura 1).

3. Ordenar as células dissociadas por tamanho

1. Durante a dissociação dos blastômeros, submerga os coloridores celulares (40 μm, 70 μm e 100 μm) em placas de Petri individuais preenchidas com CMFM (Figura 2). Coloque os pratos na ordem da esquerda para a direita, conforme indicado. Também inclua mais dois pratos cheios de CMFM entre os grupos para uma lavagem rápida dos coloredores de células durante cada seleção.
2. Gire suavemente o prato contendo os blastômeros isolados para enriquecê-los no centro do prato. Transfira cuidadosamente os blastômeros para o colorador de 40 μm no CMFM.
3. Agite suavemente o escorredor algumas vezes para deixar os blastômeros < 40 μm se depositarem através do escorredor. Depois, mova rapidamente o coador de 40 μm para o recipiente preenchido com CMFM para uma lavagem rápida. Transfira cuidadosamente os blastômeros no filtro de 40 μm, que são > 40 μm, para o filtro de 70 μm.
4. Repita os passos até que os blastômeros estejam separados no filtro de 100 μm.
5. Misture suavemente cada prato com blastômeros separados para enriquecê-los no centro do prato. Transfira cuidadosamente os blastômeros (~4 mL) para o topo de 0,5 mL de meio com gradiente de densidade de 15% em um tubo de separação celular ativada por fluorescência (FACS) (Figura 3). Evite misturar.
6. Deixe o tubo descansar por 10 minutos. Os blastômeros intactos se depositam no fundo pela gravidade, separando-se dos glóbulos de gema dos blastômeros rompidos durante a separação e transferência (Figura 3).
7. Dependendo do objetivo dos experimentos a jusante, prossiga com a análise de células vivas, congele os blastômeros em nitrogênio líquido para trabalho com RNA ou fixe os blastômeros para imunocoloração (Figura 3).

Resultados

Embriões de Xenopus laevis (n = 50) no Estágio 9 foram incubados no meio CMFM para dissociar em blastômeros únicos seguindo esse protocolo (veja um exemplo na Figura 1). Os blastômeros simples dissociados foram ordenados sequencialmente usando os peneiros celulares de 40 μm, 70 μm e 100 μm, conforme descrito acima. A mistura controle não classificada e blastômeros individuais foram fixados em paraformaldeído a 4% e fotografados sob um microscópio de...

Discussão

O tamanho celular é fundamentalmente importante para as funções^{celulares 3}, e seu impacto no desenvolvimento inicial exige maior escrutínio em sistemas embrionários modelo. Aqui descrevemos os detalhes para isolar células individuais de embriões iniciais de Xenopus laevis e separar as células por tamanho usando peneiras celulares, potencialmente aplicável para estudos de tamanho celular. Esse método nos permitiu fornecer evidências diretas da ativação gên...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% Paraformaldeído (PFA)	EMS	15710-S	Para fazer a solução fixativa
Placas de Petri Descartáveis de 60 mm	VWR	25384-092	Para incubar embriões
Estereoscópios Zoom ACCU-SCOPE 3075	VWR	470351-130	Para visualizar embriões
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9414	Para revestir placas de Petri
Filtro de células, 100 e micro; m	VWR	76327-102	Para ordenar células por tamanho
Cell Strainer, 40 & micro; m	VWR	76327-098	Para ordenar células por tamanho
Filtro de células, 70 & micro; m	VWR	76327-100	Para ordenar células por tamanho
Pipetas de Transferência Descartáveis	VWR	414004-035	Para transferência de embriões
Pinça Dumont, Estilo 5	Ciências da Microscopia Eletrônica	72701-D	Para remover membrana vitelina
Placa de Petri de vidro, 60 e mais vezes; 15 mm	VWR	75845-542	Para incubar embriões