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Artigo de investigação
Este estudo avalia a metaloproteinase da matriz sérica-12 (MMP-12) e a cadherina-tumoral (CDH13) como biomarcadores complementares no câncer de pulmão. Esses marcadores correlacionam-se com subtipos moleculares, resposta ao tratamento e sobrevivência, apoiando seu uso potencial em subtipagem, estratificação de tratamentos e avaliação prognóstica.
O câncer de pulmão continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, em grande parte devido à sua heterogeneidade biológica, diagnóstico frequente em estágios avançados e limitações em testes moleculares abrangentes. Biomarcadores únicos frequentemente são insuficientes para orientar a tomada de decisões clínicas, destacando a necessidade de indicadores complementares e clinicamente viáveis que integrem a biologia sistêmica e específica do tumor. Neste estudo de coorte de um único centro, 262 pacientes com câncer de pulmão foram inscritos. Os níveis de metaloproteinase da matriz sérica (MMP-12) foram medidos usando ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), e a expressão de cadherina-13 tumoral (CDH13) foi avaliada por imunohistoquímica (IHC) usando um escore imunorreativo validado (IRS). A subtipagem molecular foi obtida a partir de testes clínicos rotineiros, e associações com resposta ao tratamento e desfechos de sobrevivência foram avaliadas usando modelos logísticos multivariados e regressão de Cox. MMP-12 e CDH13 apresentaram distribuições inversas entre subtipos moleculares (P < 0,001), de modo que tumores alterados pelo receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)/linfoma quinase anaplásica (ALK) apresentavam níveis mais baixos de MMP-12 e CDH13 mais altos, enquanto tumores do tipo Kirsten sarcoma viral oncogene (KRAS) e tumores do tipo selvagem demonstravam o padrão oposto. Maior expressão programada do ligante de morte 1 (PD-L1) esteve consistentemente associada ao aumento do MMP-12 e à redução do CDH13 (todos os P < 0,05). MMP-12 elevado esteve independentemente associado a uma redução da taxa de resposta objetiva (ORR) (razão de chances ajustada [OR] = 0,662, P < 0,001) e uma sobrevivência pior (sobrevivência livre de progressão [PFS] razão de risco [HR] = 1,382; sobrevivência geral [OS] HR = 1,421; ambos P < 0,001), enquanto CDH13 mais alto previu melhora na resposta (OR ajustado = 1,201, P < 0,001) e na sobrevivência (PFS HR = 0,884; OS HR = 0,862; ambos P < 0,001). A assinatura combinada alta de MMP-12/CDH13 baixa identificou um subgrupo com desfechos significativamente piores (PFS HR = 2,281; OS HR = 2,506; P < 0,001). Esses achados sugerem que o MMP-12 sérico e o tumor CDH13 podem servir como biomarcadores complementares para subtipagem molecular, estratificação terapêutica e avaliação prognóstica no câncer de pulmão.
O câncer de pulmão continua sendo um dos principais fatos globais de saúde, representando quase 2,5 milhões de novos casos e cerca de 1,8 milhão de mortes no mundo em 2022. Apesar do progresso substancial em triagem, imagem e terapia sistêmica, a sobrevivência permanece limitada para muitos pacientes porque o câncer de pulmão é biologicamente heterogêneo e frequentemente diagnosticado em estágioavançado 2,3,4,5. A oncologia de precisão tornou-se, portanto, central para o cuidado contemporâneo do câncer de pulmão, especialmente para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), onde alterações acionáveis de condutores definem subconjuntos moleculares com histórias naturais distintas e sensibilidades aotratamento 6. As diretrizes de prática clínica recomendam um perfil molecular amplo em doenças avançadas, incluindo EGFR, ALK, KRAS, ROS1, BRAF, salto do exon 14 MET, RET, ERBB2 (HER2) e fusões NTRK, juntamente com a avaliação de biomarcadores imunológicos como PD-L1 7,8,9,10. Esses avanços transformaram os resultados para populações selecionadas, mas também criaram novos gargalos clínicos. O tecido pode ser insuficiente para testes abrangentes, o tempo de resposta pode atrasar decisões terapêuticas, e o acesso a sequenciamento de próxima geração de alta qualidade varia entre sistemasde saúde 7,9. Mesmo quando há testes moleculares disponíveis, a terapia guiada por biomarcadores permanece imperfeita porque o status molecular não captura totalmente os estados microambientais tumorais que influenciam a resposta e resistência ao tratamento. A expressão de PD-L1 é amplamente utilizada, mas possui limitações bem reconhecidas como preditor independente, e a carga mutacional tumoral apresenta variabilidade e incerteza substanciais em seu usoótimo 6,9,10. Essas realidades destacam a necessidade prática de biomarcadores complementares que sejam escaláveis, biologicamente informativos e capazes de enriquecer subtipagem molecular e estratificação de tratamentos quando as informações genômicas são incompletas, atrasadas ou ambíguas.
A remodelação proteolítica da matriz extracelular e do microambiente tumoral é uma dessas dimensões biologicamente fundamentadas que é cada vez mais apreciada tanto como marca da malignidade quanto como determinante da resposta terapêutica. Metaloproteinases da matriz (MMPs) regulam invasão, angiogênese, tráfico celular imune e sinalização de citocinas, ligando assim os sistemas intrínsecos do tumor a contextos inflamatórios e estromais dohospedeiro 11. Entre essas enzimas, a metaloproteinase matricial-12 (MMP-12), também conhecida como elastase de macrófagos, tem atraído atenção no câncer de pulmão porque é expressa em um espectro de tumores pulmonares humanos e parece estar associada a fenótipos agressivos e pioresresultados 12. Além de sua expressão tecidual, o MMP-12 é mensurável em circulação, tornando-o atraente como biomarcador minimamente invasivo com potencial para monitoramentoserial 13. Análises recentes de múltiplos cânceres apoiaram ainda mais a relevância clínica do MMP-12 no adenocarcinoma pulmonar, sugerindo papéis preditivos e prognósticos que justificam uma exploração mais profunda em subgrupos clinicamenteacionáveis 14. Importante destacar que biomarcadores circulantes são cada vez mais usados para complementar os testes baseados em tecidos em oncologia, e há um interesse crescente em indicadores sanguíneos que refletem não apenas a carga tumoral, mas também as dinâmicas imunes e estromais que moldam a sensibilidade à terapiasistêmica 15. No câncer de pulmão, onde a imunoterapia e a terapia direcionada são frequentemente aplicadas, biomarcadores que refletem o microambiente tumoral podem ser particularmente valiosos para entender a heterogeneidade do tratamento, a resistência precoce e a necessidade de abordagenscombinadas 16. Esse contexto biológico e clínico motiva uma avaliação focada do MMP-12 sérico além de um sinal diagnóstico, especificamente como marcador candidato ligado a subtipos moleculares e trajetórias terapêuticas.
Paralelamente, a cadherina 13 (CDH13), também chamada de T cadherin ou H cadherina, representa um eixo mecanicamente distinto relevante para a diferenciação tumoral, sinalização de aderência e plasticidade epitelial. CDH13 é uma caderina atípica ancorada à membrana por meio de um grupo glicosilfosfatidilinositol e tem sido amplamente descrita como supressora tumoral em múltiplasmalignidades 17. No NSCLC, o silenciamento epigenético de CDH13 por meio da hipermetilação do promotor foi repetidamente relatado e esteve associado à progressão tumoral e a características clinicopatológicasadversas 18,19. Evidências meta-analíticas e integrativas também apoiam que a hipermetilação de CDH13 é mais frequente em NSCLC do que em tecido pulmonar normal e pode ter relevânciadiagnóstica 20,21. Além de seu valor como marcador de transformação maligna, o status de CDH13 pode, plausivelmente, interseccionar com a sensibilidade ao tratamento. Trabalhos experimentais relacionaram a metilação do promotor de CDH13 e a expressão alterada a fenótipos de resistência à cisplatina em modelos de câncer de pulmão, levantando a possibilidade de que CDH13 reflita programas biológicos relacionados à resposta terapêutica e à adaptação tumoral sob pressãode tratamento 22. Esses dados posicionam coletivamente o CDH13 como um biomarcador baseado em tecidos com potenciais implicações para a biologia do risco e estratificação terapêutica. Ao contrário dos ensaios multi-ômicos complexos, o CDH13 pode ser avaliado por imunohistoquímica em fluxos de trabalho rotineiros de patologia, permitindo a tradução prática se fornecer informações aditivas além dos marcadores clínicos e moleculares existentes.
Juntos, MMP-12 e CDH13 representam compartimentos e mecanismos biológicos complementares. O MMP-12 é uma leitura circulante que pode capturar a ativação imune e estromal, além da remodelação impulsionada por protease, enquanto o CDH13 é um marcador em nível tecidular que reflete a adesão supressora tumoral e a regulação epigenética. Hipotetizamos que integrar esses eixos pode melhorar a inferência clínica em dois domínios-chave que definem oncologia de precisão no câncer de pulmão. Primeiro, uma estrutura combinada de biomarcadores séricos e teciduais pode fornecer informações complementares para a subtipagem molecular, seja associando-se a alterações acionáveis de condutores e estados imunes de biomarcadores ou identificando fenótipos biologicamente coerentes que acompanham classes moleculares específicas quando os testes genômicos sãolimitados 2,6,8,10 . Segundo, a assinatura integrada pode informar a terapia personalizada ao melhorar a estratificação de risco e correlacionar-se com a seleção e os resultados do tratamento em paradigmas de terapia direcionada e imunoterapia, onde a resistência é multifatorial e marcadores únicos sãoinsuficientes 9,10,23. Nesse contexto, nossa abordagem é intencionalmente pragmática. Em vez de substituir os diagnósticos moleculares, busca complementá-los fornecendo medições escaláveis e compatíveis com clínica, que podem ser obtidas rapidamente e interpretadas junto com genótipo, PD-L1 e estágio. Essa estratégia pode ser particularmente útil em contextos reais, onde os tecidos são escassos, biópsias repetidas são impraticáveis ou a questão clínica não é apenas se um fator está presente, mas como antecipar a sensibilidade ao tratamento e o risco de progressão em um paciente individual.
Assim, no presente estudo de coorte, avaliamos as implicações clínicas do MMP-12 sérico e do tumor CDH13 em subtipos moleculares de câncer de pulmão e vias de tratamento. Especificamente, examinamos se esses biomarcadores, individualmente e em combinação, estão associados às principais classes moleculares e grupos terapêuticos, e se eles adicionam informações prognósticas relevantes para o manejo personalizado. Também posicionamos esse trabalho dentro de um ecossistema mais amplo de abordagens alternativas, incluindo DNA tumoral circulante, perfil de metilação e modelagem multimodal que integra características clínicas, de imagem emoleculares 24,25. A novidade do nosso estudo não está em propor novos biomarcadores individuais, mas em integrar deliberadamente um sinal de protease circulante com um marcador de adesão e epigenético à base de tecido para abordar uma questão clinicamente acionável: como complementar a subtipagem molecular e a personalização da terapia usando medições viáveis na prática rotineira. Ao capturar dimensões complementares das interações sistêmicas tumor-hospedeiro e da biologia intrínseca tumor, essa estrutura integrativa vai além de estudos anteriores que avaliaram o MMP-12 ou CDH13 isoladamente. Tal abordagem pode fornecer uma ponte prática entre patologia diagnóstica e terapias de precisão, com aplicações potenciais na priorização de testes moleculares, contextualização da discordância de biomarcadores e refinamento do planejamento individualizado baseado em risco.
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Todos os procedimentos estavam em conformidade com regulamentos institucionais e nacionais e foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Popular de Xingtai (nº 2024-124). A exigência de consentimento informado por escrito foi dispensada porque dados clínicos coletados rotineiramente e amostras residuais eram utilizadas. Todos os dados foram anonimizados antes da análise.
Projeto do estudo, cenário e esquema geral
Este estudo foi conduzido como uma coorte observacional de centro único projetada para avaliar as implicações clínicas do MMP-12 sérico e do tumor CDH13, individualmente e em combinação, para subtipagem molecular do câncer de pulmão e terapia personalizada. O estudo foi realizado no Hospital Popular de Xingtai. Foram identificados pacientes elegíveis tratados entre janeiro de 2021 e junho de 2022, e 262 pacientes consecutivos que atenderam aos critérios pré-especificados de inclusão e exclusão foram inscritos.
O fluxo de trabalho geral do estudo está ilustrado na Figura 1. O esquema retrata todo o processo, desde a identificação do paciente até a análise, incluindo triagem e inscrição do paciente, caracterização clinicopatológica de base e perfilamento molecular derivados de testes clínicos rotineiros, coleta e processamento do soro pré-tratamento, preparação do tecido tumoral para imunohistoquímica do CDH13, quantificação do MMP-12 sérico, pontuação imunorreativa do CDH13, classificação da terapia de primeira linha e das vias de tratamento subsequentes, e desfecho longitudinal Verificação, incluindo resposta ao tratamento, sobrevivência livre de progressão e sobrevivência geral. O esquema distingue análises diagnósticas e de subtipagem molecular das análises de tratamento e desfecho e indica os momentos em que as bioamostras foram coletadas, os resultados moleculares foram gerados, a terapia foi iniciada e as avaliações de acompanhamento foram realizadas.
Triagem dos participantes, critérios de elegibilidade e abstração de dados clínicos
Pacientes potencialmente elegíveis foram identificados pelo sistema de informações hospitalares e pelo registro de patologia durante o período de inscrição pré-especificado (janeiro de 2021 a junho de 2022). O câncer primário de pulmão foi confirmado por histopatologia, complementado por revisão clínica multidisciplinar quando necessário. Pacientes adultos consecutivos que atenderam a todos os critérios de elegibilidade foram inscritos. Os critérios de inclusão incluíram câncer primário de pulmão confirmado histologicamente, disponibilidade de uma amostra sérica pré-tratamento obtida antes do início de qualquer terapia antitumoral (e antes da cirurgia em pacientes submetidos à resseção inicial), disponibilidade de tecido tumoral suficiente para a imunohistoquímica do CDH13 e disponibilidade de informações de subtipos moleculares geradas como parte do cuidado clínico rotineiro. Foram excluídos pacientes com histórico documentado de outro tumor maligno antes da inscrição, pacientes com volume sérico inadequado ou integridade da amostra comprometida, pacientes sem tecido tumoral avaliável para avaliação do CDH13 e pacientes que receberam terapia anticâncer sistêmica antes da coleta inicial de sangue.
Os dados clinicopatológicos e de tratamento foram extraídos dos prontuários eletrônicos de saúde utilizando um formulário padronizado de relato de caso com definições de variáveis pré-definidas e regras de codificação. As variáveis registradas incluíram demografia (idade e sexo), exposição ao tabagismo, estado de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), comorbibilidades, achados de imagem basal, subtipo histológico, estágio tumor-lânglio-metástase (TNM) (de acordo com o sistema de estadiamento usado na prática clínica rotineira durante o período do estudo), parâmetros laboratoriais de base e informações detalhadas do tratamento (incluindo o regime de primeira linha, datas de início, modificações de dose e transições de tratamento). A exposição ao tabagismo foi quantificada em anos-macotilha da seguinte forma: Anos-macotilha = (cigarros por dia ÷ 20) × anos fumados. Quando o histórico de fumo é incompleto ou inconsistente entre registros, a variável de fumo foi classificada como desconhecida, e a fonte foi documentada como uma discrepância no registro de abstração; A falta foi tratada de acordo com o plano de análise estatística pré-especificado.
Coleta, processamento e armazenamento de espécimes
O sangue venoso periférico foi coletado no início do início antes do início de qualquer terapia antitumoral. O soro foi separado por centrifugação a 1.500 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante sérico foi transferido para crioviais de baixa ligação sem perturbar a camada celular. O soro foi aliquotado em porções de 200 a 500 μL para minimizar os ciclos de congelamento-descongelamento, e as alíquotas foram armazenadas a −80 °C até a análise em lote. O intervalo entre a coleta de sangue e o congelamento para cada amostra foi registrado, e amostras com tempo de coleta até congelamento superior a 2 horas foram excluídas.
Procedimentos pré-analíticos pré-especificados de controle de qualidade foram aplicados documentando hemólise e lipemia no processamento. Amostras visivelmente hemolisizadas foram excluídas da quantificação do ELISA. As alíquotas séricas foram descongeladas no gelo imediatamente antes do ensaio, misturadas por inversão suave e centrifugadas a 2.000 × g por 5 minutos para remover partículas quando necessário. Agitação vigorosa e vórtices foram evitados para evitar a formação de bolhas e artefatos ópticos durante as medições de absorvida.
Aquisição e preparação de tecido tumoral
Tecido tumoral proveniente de procedimentos diagnósticos rotineiros (biópsia, broncoscopia, biópsia por agulha do núcleo ou resseção cirúrgica) foi obtido. O tecido foi fixado em formalina neutra tamponada segundo a prática padrão da patologia e embutido na parafina. Seções (3–4 μm) foram preparadas em lâminas carregadas para imunohistoquímica. Lâminas não coradas eram armazenadas em ambiente seco à temperatura ambiente e coradas dentro de um intervalo pré-especificado para minimizar a degradação do antígeno. Foi mantido um registro de cadeia de custódia ligando identificadores de amostras a códigos de estudo desidentificados. O patologista que realizou a pontuação do CDH13 foi cegado para os valores séricos de MMP-12, subtipo molecular, tratamento e desfechos.
Quantificação sérica do MMP-12 por ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)
O sangue venoso periférico foi coletado antes de qualquer terapia antitumoral, idealmente dentro de 7 dias antes da biópsia ou início do tratamento. O MMP-12 sorológico foi medido usando um kit ELISA MMP-12 humano comercial. Cada alíquota sérica foi descongelada uma vez no gelo, misturada suavemente e testada em duplicado conforme as instruções do kit. Uma curva padrão era gerada em cada placa usando diluições seriadas do padrão recombinante fornecido, e a absorvância era lida a 450 nm com correção de referência usando um leitor de microplaca. As concentrações foram calculadas ajustando uma curva padrão de regressão logística de quatro parâmetros. Para garantir a robustez analítica, soros internos de controle de qualidade (QC) foram incluídos em cada placa e monitorados para precisão intra-ensaio e entre ensaios (coeficientes de variação alvo consistentes com a validação do ensaio). Se os resultados caíssem abaixo do limite inferior de quantificação, metade desse limite era atribuída para análise estatística; Se os resultados ultrapassassem o limite superior, a medição era repetida após diluição adequada. Para minimizar os efeitos em lote, amostras foram alocadas aleatoriamente entre as placas, e um conjunto idêntico de soros de QC foi incluído em cada placa para acompanhar a variabilidade entre placas. O pessoal do laboratório que realizava o ELISA estava cego para o agrupamento clínico e os resultados.
Tumor CDH13 imunohistoquímica e pontuação imunorreativa
A imunohistoquímica do CDH13 foi realizada em seções tumorais fixadas em formalina, embutidas em parafina, utilizando um anticorpo primário anti-CDH13 validado. Complexos antígeno–anticorpo foram detectados com um sistema de detecção baseado em polímero, e a coloração foi visualizada com 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Um fluxo de trabalho idêntico de coloração foi aplicado a todos os espetáculos de estudo; Os slides eram processados em lotes, e os controles apropriados estavam incluídos.
Os blocos de parafina foram seccionados a 3–4 μm, desparafinizados em xileno e reidratados por etanol graduado até água destilada. A recuperação de epítopos induzida por calor foi realizada em tampão de citrato (10 mM, pH 6,0) usando um micro-ondas a 95–100 °C por 15 minutos, seguida de resfriamento até a temperatura ambiente por 20 minutos. A atividade endógena da peroxidase foi extinta com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos em temperatura ambiente, e o bloqueio proteico foi realizado usando solução bloqueadora sérica normal por 20 minutos em temperatura ambiente. As cráteas foram incubadas com o anticorpo primário anti-CDH13 durante a noite a 4 °C. Após a lavagem, o reagente secundário de detecção à base de polímero foi aplicado por 20–30 minutos em temperatura ambiente, seguido pela visualização com cromógeno 3,3′-DAB por 3–5 minutos sob monitoramento microscópico. As seções foram contra-tingidas com hematoxilina, desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno e montadas com meio de montagem permanente.
Controles internos de qualidade estavam incluídos em cada envernização. Uma seção de tecido conhecida para CDH13 positiva foi processada em paralelo como controle positivo, e o anticorpo primário foi omitido no controle negativo. Uma execução foi aceita apenas quando o controle positivo demonstrou o padrão de coloração esperado com intensidade apropriada, e o controle negativo não mostrou coloração específica. A coloração foi repetida em execuções com excesso de fundo em fundo, falha no desempenho de controle ou com um sinal inespecífico que compromete a interpretação.
A expressão do CDH13 foi quantificada usando um escore imunorreativo (IRS) derivado da intensidade da coloração e da proporção de células tumorais positivas. Dois patologistas treinados pontuaram todas as lâminas de forma independente, enquanto cegas, para medições de biomarcadores séricos, subtipo molecular, tratamento e desfechos. As pontuações discrepantes foram resolvidas por revisão conjunta em um microscópio multicabeça, e o IRS avaliado foi registrado. A intensidade da coloração foi atribuída como 0 (sem coloração), 1 (fraca), 2 (moderada) ou 3 (forte). A proporção de células tumorais positivas foi atribuída como 0 (0%), 1 (1–10%), 2 (11–50%), 3 (51–80%) ou 4 (81–100%). O IRS foi calculado da seguinte forma: IRS = escore de intensidade × pontuação de proporção. Os valores do IRS variaram de 0 a 12. A baixa expressão de CDH13 foi definida como IRS ≤ 3, com base em um limiar comumente usado para pontuação imunorreativa. O IRS foi mantido tanto como variável contínua quanto como categoria dicotomizada para análises a jusante, incluindo comparações de subgrupos e modelagem combinada de biomarcadores. A concordância entre observadores foi avaliada em uma amostra aleatória pré-especificada, compreendendo 30% dos casos, utilizando uma estatística kappa ponderada, e o procedimento de amostragem, estimativa de concordância e decisões de adjudicação foram documentados em uma trilha de auditoria.
Subtipagem molecular e classificação de tratamentos
As informações sobre subtipos moleculares foram obtidas por meio de testes clínicos de rotina realizados em tecido tumoral diagnóstico. Os resultados foram gerados por ensaios clinicamente validados implementados em cuidados padrão, incluindo testes direcionados baseados em PCR, painéis de sequenciamento de próxima geração direcionados, imunohistoquímica e hibridização in situ por fluorescência. Para cada paciente, foram registrados o tipo de ensaio, a fonte da amostra, a declaração de adequação da amostra e a data do relatório. Os pacientes foram classificados de acordo com o status de alteração acionável do driver, incluindo mutações ativadoras de EGFR, rearranjos ALK, rearranjos ROS1, mutações KRAS, mutações BRAF, alterações pulando o éxon MET 14, rearranjos RET, alterações ERBB2 e fusões NTRK. A pontuação de proporção tumoral de PD-L1 foi registrada onde foi realizada, e a expressão de PD-L1 foi categorizada de acordo com os estratos usados na prática rotineira durante o período de estudo. Todas as categorias de subtipagem molecular foram pré-especificadas antes da análise. Quando mais de uma alteração acionável foi relatada, os pacientes foram designados de acordo com uma regra hierárquica de classificação pré-definida, priorizando alterações com implicações terapêuticas dirigidas ao genótipo estabelecido na seguinte ordem: mutações EGFR, rearranjos ALK, rearranjos ROS1, mutações BRAF, alterações de pulo do MET exon 14, rearranjos RET, alterações ERBB2, fusões NTRK e mutações KRAS.
As informações do tratamento foram extraídas dos prontuários médicos, incluindo o regime de primeira linha, datas de início e parada, e linhas subsequentes de terapia. O manejo inicial foi classificado em categorias de tratamento mutuamente exclusivas definidas a priori: terapia direcionada ao genótipo, terapia baseada em inibidores de checkpoint imunológico, terapia baseada em quimioterapia e manejo multimodal incorporando cirurgia ao tratamento sistêmico perioperatório, conforme aplicável. A data índice foi definida como o início da terapia sistêmica de primeira linha; Para pacientes tratados com resseção inicial, a data índice era a data da cirurgia, e a terapia sistêmica subsequente foi classificada como adjuvante de acordo com o prontuário clínico. Para análises que abordaram a terapia personalizada, os pacientes foram estratificados conjuntamente por subtipo molecular e categoria de tratamento, e as concentrações séricas de MMP-12 e a expressão tumoral de CDH13 foram comparadas entre doença condutor-positiva e condutor-negativa, bem como entre grupos de tratamento baseados em terapia direcionada e inibidor de checkpoint imunológico.
Definições de resultados e acompanhamento
A data índice foi definida como a data de início da primeira linha da terapia antitumoral. Para pacientes tratados com resseção cirúrgica antecipada, a data índice foi definida como a data da cirurgia; A terapia sistêmica subsequente foi classificada como adjuvante ou paliativa de acordo com o prontuário médico. Cada paciente foi acompanhado desde a data índice até a morte, a data do último contato confirmado ou a data de censura administrativa, o que ocorrer primeiro. A duração do acompanhamento foi registrada em meses e, para cada endpoint, o indicador do evento e a data correspondente do evento ou censura foram mantidos. Os resultados foram determinados por meio da abstração estruturada do prontuário eletrônico, incluindo relatórios de radiologia, documentação da clínica oncológica, prontuários de internação e acompanhamento telefônico quando necessário. Um formulário de relatório de caso pré-especificado foi utilizado, e regras uniformes de hierarquia de fontes foram aplicadas. Quando datas ou classificações diferiam entre os registros, as discrepâncias eram resolvidas priorizando relatórios de radiologia contemporâneos e anotações de decisão de tratamento; O valor final adjudicado e suas fontes de apoio foram documentados. Foi mantido um registro de acompanhamento registrando datas de imagem, transições de tratamento, hospitalizações e tentativas de contato para minimizar a perda para o acompanhamento e garantir a rastreabilidade.
A resposta tumoral foi avaliada em pacientes com doença mensurável de acordo com a versão 1.1 do RECIST. A melhor resposta geral foi classificada como resposta completa, resposta parcial, doença estável ou doença progressiva. A taxa de resposta objetiva foi definida como resposta completa ou parcial, e a taxa de controle da doença como resposta completa, resposta parcial ou doença estável. As datas de resposta e progressão foram atribuídas com base nas evidências documentadas mais antigas.
A sobrevivência livre de progressão (PFS) foi definida como o intervalo desde a data índice até a primeira ocorrência de progressão da doença ou morte por qualquer causa, o que ocorrer primeiro. A progressão foi determinada principalmente a partir de relatórios radiológicos que documentam a progressão de acordo com o RECIST 1.1. Quando a radiologia não está disponível no momento da deterioração clínica, a progressão documentada pelo clínico foi aceita se estiver explicitamente ligada ao agravamento da carga tumoral e provocar uma mudança no manejo anticâncer. Pacientes sem evento na data da última avaliação objetiva foram censurados, confirmando a ausência de progressão. Se uma nova linha de terapia sistêmica fosse iniciada sem documentação explícita de progressão, a imagem era revisada e a documentação clínica contemporânea era fornecida. Se a progressão não pudesse ser confirmada, os pacientes eram censurados na última avaliação radiográfica antes da mudança de tratamento, e a regra de decisão aplicada era registrada.
A sobrevivência geral (SO) foi definida como o intervalo desde a data índice até a morte por qualquer causa. O estado vital foi determinado usando registros hospitalares e anotações de acompanhamento ambulatorial, complementados por confirmação estruturada por telefone quando necessário. A data do falecimento foi registrada conforme documentada no prontuário médico ou, quando inexistente, como a data confirmada pela família durante o contato de acompanhamento, com documentação de apoio registrada no registro de acompanhamento. Pacientes que estavam vivos na data do último contato confirmado foram censurados.
Foi implementado um fluxo de trabalho padronizado de acompanhamento, alinhado com as rotinhas de cuidado. Durante a terapia sistêmica ativa, avaliações clínicas em cada ciclo de tratamento foram documentadas, e reavaliações radiográficas em intervalos regulares determinadas pelo protocolo clínico foram registradas, com modalidade e data de imagem registradas para cada avaliação. Após a conclusão da terapia de primeira linha ou durante a vigilância pós-operatória, as visitas de acompanhamento e avaliações de imagem foram registradas de acordo com o cronograma institucional. Quando o acompanhamento presencial não pôde ser concluído, foi realizado um acompanhamento telefônico estruturado para confirmar a continuação do tratamento, documentar hospitalizações em intervalos, confirmar o status da doença conforme documentado por imagens externas, quando aplicável, e confirmar o status de sobrevivência. Todas as visitas perdidas, tentativas inacessíveis e motivos para a interrupção do acompanhamento foram documentados. Antes de classificar um paciente como perdido para o acompanhamento, foi tentada contato pelo menos mais 2 vezes em dias diferentes, e cada tentativa foi registrada.
A separação procedimental entre avaliação de biomarcadores e determinação de resultados foi mantida. O pessoal que realizou a medição sérica de MMP-12 e a pontuação de CDH13 foram cegos quanto aos resultados clínicos. A abstração de resultados foi realizada sem acesso aos resultados dos biomarcadores sempre que possível. Foi aplicado um processo de adjudicação em duas etapas para os endpoints de progressão e resposta. Um abstratário treinado atribuía classificação e datas de eventos usando as regras pré-especificadas, após as quais um clínico sênior revisava as tarefas de forma independente. As discrepâncias foram resolvidas por meio de uma revisão conjunta do relatório radiológico original, das anotações oncológicas e do cronograma do tratamento, e foi mantido um registro de auditoria de todas as decisões de adjudicação.
Foram realizadas verificações de consistência para identificar sequências improváveis, incluindo eventos datados antes da data do índice, transições de tratamento sem avaliações correspondentes ou datas de óbito sem documentação de apoio. Os casos sinalizados foram conciliados retornando aos documentos de origem e atualizando o conjunto de dados com uma nota de correção datada que especifica o motivo da mudança e as evidências de apoio.
Análise estatística
Análises estatísticas foram realizadas usando SPSS (versão 26.0) e R (versão 4.3.0). As variáveis contínuas foram apresentadas como média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), conforme apropriado, e variáveis categóricas foram apresentadas como contagens e percentagens. Comparações em grupos usaram testes paramétricos ou não paramétricos conforme apropriado, com testes qui-quadrados ou exatos de Fisher para dados categóricos. Todos os testes foram bilaterais, com P < 0,05 considerado estatisticamente significativo.
Covariáveis foram selecionadas a priori com base na relevância clínica e nas evidências prévias, e o mesmo conjunto de covariáveis foi aplicado entre modelos relacionados para apoiar a comparabilidade. As variáveis centrais de ajuste incluíram idade, sexo, exposição ao tabagismo, estágio TNM, desempenho ECOG e subtipo histológico, com ajuste adicional para o grupo de tratamento quando o alvo da análise é o subtipo molecular dentro das populações tratadas. A multicolinearidade foi avaliada usando fatores de inflação da variância, e a colinearidade problemática foi tratada usando regras pré-especificadas de redução de variáveis. Foram reportados índices ajustados de odds ratios com intervalos de confiança de 95% e valores P de dois lados. O número de covariáveis incluídas nos modelos logístico multivariável e de regressão de Cox foi pré-especificado e restrito em relação ao número de eventos de desfecho para minimizar o risco de superajuste. A razão de eventos por variável permaneceu aceitável (≥10) para todos os modelos. Para desfechos de subtipos moleculares multicategoria, foram ajustados modelos de regressão logística multinomial ou um conjunto de comparações logísticas binárias usando uma categoria de referência pré-especificada, e a estratégia de modelagem foi claramente declarada.
A sobrevivência livre de progressão e a sobrevivência geral foram analisadas usando estimativas de Kaplan–Meier, e curvas de sobrevivência foram comparadas usando o teste log-rank. As associações entre biomarcadores e desfechos foram quantificadas usando a regressão proporcional de riscos de Cox, relatando razões de risco com intervalos de confiança de 95%. Modelos de Cox multivariáveis foram construídos usando covariáveis clinicopatológicas pré-especificadas, incluindo subtipo molecular e categoria de tratamento, para avaliar as implicações para a terapia personalizada. A suposição de riscos proporcionais foi verificada usando diagnósticos de resíduos de Schoenfeld e gráficos log-menos log-survival. Se a suposição de riscos proporcionais fosse violada para uma covaria, a questão era tratada usando uma abordagem pré-especificada, como estratificação nessa covariável ou inclusão de um termo de interação dependente do tempo, e a especificação final do modelo era reportada.
Os dados ausentes foram tratados usando uma estratégia pré-especificada. Quando a ausência era mínima, eram realizadas análises completas do caso; caso contrário, foi usada imputação múltipla com equações encadeadas, incluindo todas as variáveis nos modelos analíticos. Dez conjuntos de dados imputados foram gerados, e estimativas agrupadas foram calculadas usando as regras de Rubin. Para análises envolvendo múltiplas comparações de subtipos ou múltiplos desfechos, a taxa de falsas descobertas foi controlada usando um procedimento pré-especificado, ou as análises foram claramente designadas como exploratórias para garantir transparência quanto à multiplicidade.
O conjunto de dados de análise foi bloqueado antes do ajuste do modelo, e um dicionário de dados abrangente foi mantido que definia cada variável, unidade, esquema de codificação e faixa permitida. Amostras duplicadas de controle de qualidade em placas de ensaio foram incluídas para quantificar a variabilidade entre placas e monitorar a deriva. Para a pontuação de imunohistoquímica, a rubrica de avaliação, procedimentos de cegueira e avaliação de concordância entre observadores foram documentados, e registros de adjudicação foram mantidos para casos discrepantes. Foram implementadas verificações programadas de intervalo e verificações lógicas de consistência entre variáveis-chave, incluindo data de indexação, data de coleta da amostra, data de início do tratamento e datas dos resultados. Todos os scripts estatísticos e logs de saída controlados por versão foram preservados para permitir a replicação completa do fluxo de trabalho analítico.
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Montagem de coortes e distribuição de subtipos moleculares
O fluxo de trabalho geral do estudo é resumido na Figura 1. No total, 262 pacientes consecutivos com câncer de pulmão foram incluídos e estratificados em quatro subtipos moleculares clinicamente relevantes: EGFR (n = 92), ALK (n = 48), KRAS (n = 54) e tipo selvagem (n = 68). As características clinicopatológicas basais diferiram entre os subtipos (Tabela 1). Pacientes com alterações de EGFR e ALK ...
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Este estudo avalia os papéis complementares do MMP-12 sorológico e do tumor CDH13 como uma abordagem integrada de biomarcadores para apoiar a interpretação clínica de subtipos moleculares e a estratificação terapêutica no câncer de pulmão. A hipótese central decorre dos papéis biológicos complementares desses dois biomarcadores: MMP-12, uma protease circulante que reflete a remodelação imuno-estromala e a agressividade tumoral, e CDH13, um supressor tumoral à base de tecido ligado à regu...
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Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Reconhecemos sinceramente as contribuições da equipe médica e de enfermagem do Hospital Popular de Xingtai pelo apoio no recrutamento de pacientes, coleta de dados clínicos e processamento de bioamostras. Este estudo foi apoiado pelo Projeto do Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Xingtai Key (nº 2024ZC116).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo, anti-CDH13 (T-cadherina) | Abcam, Cambridge, Reino Unido | ab15126 | Anticorpo primário para imunohistoquímica; validado para tecido FFPE |
| Centrífuga (refrigerada de alta velocidade) | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 5424 R | Usado para separação sérica e esclarecimento de amostras |
| Kit de Substrato DAB | ZSGB-Bio, Pequim, China | ZLI-9017 | Para detecção cromogênica em imunohistoquímica |
| Leitor de Microplacas ELISA | BioTek Instruments, Winooski, EUA | ELx800 | Usado para leitura de absorção a 450 nm com correção de referência |
| Formalina (10% tampão neutro) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Xangai, China | 10009218 | Para fixação de biópsias e amostras de tecido cirúrgico |
| Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina | Solarbio, Pequim, China | G1120 | Para contracoloração e controle de qualidade de lâminas IHC |
| Kit MMP-12 ELISA Humano | Abcam, Cambridge, Reino Unido | ab246533 | Medição quantitativa da metaloproteinase da matriz sérica-12 |
| Microscópio (campo claro) | Nikon, Tóquio, Japão | Eclipse E200 | Utilizado para avaliação da imunocoloração e pontuação de CDH13 |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha | RM2235 | Para seccionar tecido embutido com parafina em 3– 4 & micro; M espessura |
| Meio de Montagem | Solarbio, Pequim, China | S2100 | Para montagem permanente de lâmina após a coloração IHC |
| Estação de Incorporação de Parafina | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha | EG1150 | Para preparação de blocos de tecido FFPE |
| Soro Tamponado com Fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, EUA | 10010023 | Usado para lavagem durante a coloração do IHC |
| Sistema de Detecção de Polímeros | MXB Biotechnologies, Fuzhou, China | DAB-0031 | Kit de detecção secundária para IHC |
| Software Estatístico R | Fundação R para Computação Estatística, Viena, Áustria | Versão 4.3.0 | Usado para análise estatística e modelagem |
| Tubos Separadores de Soro | BD Vacutainer, Franklin Lakes, EUA | 367988 | Para coleta de sangue venoso periférico |
| Software de Estatísticas SPSS | IBM Corp., Armonk, EUA | Versão 26.0 | Usado para análise estatística de dados contínuos e categóricos |
| Crioviais de Armazenamento | Corning Inc., Corning, EUA | 430488 | Crioviais de baixa ligação para alicotação de amostras de soro |
| Banho-maria (para recuperação de antígeno) | Grant Instruments, Cambridge, Reino Unido | JBN26 | Mantém temperatura constante durante a coleta de antígenos |
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