Benzo[a]pireno e Artrite Reumatoide: Uma Investigação Computacional Integrada

Resumo

Este estudo utilizou uma abordagem integrada de toxicologia computacional para investigar sistematicamente a ligação entre a exposição ao benzo[a]pireno e a artrite reumatoide. A análise identificou cinco genes-alvo centrais, revelou seu enriquecimento em vias imunológicas chave e validou a ligação estável à proteína BaP, elucidando potenciais mecanismos moleculares para artrite reumatoide (AR) induzida por poluentes ambientais.

Resumo

Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), poluentes ambientais onipresentes, são considerados fatores ambientais significativos que contribuem para a patogênese da AR. Benzo[a]pireno (BaP), um componente chave dos PAHs, pode estar associado ao início da AR; No entanto, o mecanismo toxicológico subjacente ainda precisa ser totalmente esclarecido. Neste estudo, abordamos sistematicamente essa lacuna de conhecimento usando uma abordagem integrada que combina toxicologia de rede, aprendizado de máquina e acoplamento molecular. Inicialmente, foi realizada uma análise toxicológica em rede baseada na estrutura molecular do BaP. Ao integrar e selecionar informações alvo de múltiplos bancos de dados, 15 genes-alvo potenciais relacionados à AR de BaP foram finalmente identificados, e sua rede de interação foi construída. Análises de enriquecimento GO e KEGG revelaram que esses genes foram significativamente enriquecidos em processos biológicos como migração de leucócitos e transdução de sinais celulares imunes, e estavam associados às vias de sinalização dos receptores NF-κB e T, entre outros. Análises topológicas subsequentes usando o banco de dados STRING e o software Cytoscape filtraram cinco genes centrais (LCK, ZAP70, ITK, GZMA e ITGAL), cuja importância foi ainda mais validada por meio de aprendizado de máquina. Os resultados de acoplamento molecular e simulação de dinâmica molecular indicaram que BaP apresenta forte afinidade de ligação aos produtos proteicos desses genes-alvo, resultando na formação de complexos conformacionalmente estáveis. Em resumo, este estudo emprega uma abordagem computacional integrada para elucidar os potenciais mecanismos pelos quais o BaP pode contribuir para o desenvolvimento da AR, oferecendo assim uma base teórica para futuras investigações na prevenção e tratamento da AR associada a poluentes ambientais.

Introdução

A AR é uma doença autoimune comum caracterizada por sinovite crônica e formação de pannus, que impulsionam a destruição progressiva da cartilagem e da erosão óssea. Essas mudanças patológicas levam a disfunção articular, aumento do risco de fraturas patológicas e, por fim, incapacidade, prejudicando gravemente a qualidade de vida dos indivíduos^{afetados 1}. Embora a etiologia da AR não seja totalmente compreendida, sua patogênese geralmente é atribuída aos efeitos combinados de fatores genéticos (por exemplo, subtipos de genes HLA-DR4 e HLA-DR1) e ambientais (por exemplo, tabagismo, consumo de álcool, infecção pelo vírus Epstein-Barr, exposição à poluição do ar⁾². Estudos epidemiológicos estabeleceram uma associação significativa entre os HAPs causados pela poluição do ar e um risco aumentado de início da^{AR 3}.

Os PAHs são poluentes atmosféricos comuns originados da combustão incompleta de substâncias como carvão, petróleo, gás natural e tabaco, e são considerados importantes mediadores ambientais da patogênese da AR. Eles podem se ligar ao complexo receptor de hidrocarbonetos arílicos (RAH) nas células imunológicas, levando à exposição de sinais de localização nuclear e à consequente translocação do complexo ligante–RHA para o núcleo. No contexto da patogênese da AR, a RHA ligada à HAP atua como um sensor ambiental central que impulsiona a desregulação imune por meio de vias interconectadas. Após a ativação, a RHA forma heterodímeros com ARNT e modula a expressão do gene CYP, iniciando uma cascata^{inflamatória 4}. Essa ativação do AHR simultaneamente interrompe o equilíbrio entre células T pró-inflamatórias e reguladoras: por um lado, ela aciona o eixo de sinalização AHR/Jag1/Notch, aumentando^{a liberação} 5 da citocina da célula Th17. Por outro lado, a AHR se liga diretamente ao promotor GOT1 para aumentar a expressão de GOT1, o que induz a hipermetilação do locus FOXP3 e suprime a diferenciação^{Treg 6}. O desequilíbrio resultante entre Th17 e Treg favorece um ambiente pró-inflamatório. Além disso, a ativação da RHA amplifica ainda mais as respostas do tipo Th2 ao aumentar a expressão de CCR8 e citocinas como IL-4 e IL-13, que coletivamente perpetuam inflamação sinovial e danos^{teciduais 7}. Assim, a ativação da RSA serve como um centro que liga a exposição ambiental à PAH à desregulação Th17/Treg/Th2, estabelecendo uma ponte mecanicista entre genótipo, fatores ambientais e patologia da AR.

Na atmosfera, os PAHs existem como misturas complexas, com o BaP servindo como um constituinte chave. Nos macrófagos humanos, o BaP pode induzir a produção de CXCL8 (IL-8) promovendo a ligação da RHA ao promotor CXCL8, induzindo subsequentemente a expressão dos fatores quimiotáticos^{dos neutrófilos 8}. Além disso, o BaP pode aumentar a expressão de Slug em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS) de pacientes com AR de forma dependente de dose, o que agrava a progressão da^{artrite 9}. Em camundongos do tipo selvagem, o BaP promove ativação do osteoclast (OC) mediada pelo fator Receptor Ativador do fator nuclear kappaB (RANKL) ao induzir a atividade enzimática CYP1A1, levando finalmente à perda^{óssea 10}. No entanto, o mecanismo exato subjacente ao papel da toxicidade por BaP na patogênese da AR permanece incerto. Hipotetizamos que o BaP promove a patogênese da AR ao interagir diretamente com as principais proteínas-alvo relacionadas ao sistema imunológico e interromper múltiplas vias de sinalização envolvidas na ativação das células T, no equilíbrio Th17/Treg e na produção de citocinas inflamatórias, ligando assim a exposição ambiental ao BaP à inflamação sinovial e à destruição das articulações. A toxicologia de redes é mais adequada do que os métodos experimentais tradicionais de via única para este estudo, pois o BaP provavelmente atua em múltiplos alvos imunológicos e vias que se cruzam. Comparada às abordagens experimentais convencionais que normalmente examinam uma via ou alguns alvos por vez, a toxicologia de redes permite uma visão holística das interações multi-alvo e dos efeitos sistêmicos, embora suas previsões dependam do banco de dados e exijam validação experimental.

Pesquisas existentes sobre o papel do BaP na AR se limitam principalmente a caminhos únicos ou descrições mecanicistas lineares, carecendo de análise integrada das características regulatórias de redes multi-alvo e multinível. Pesquisas existentes sobre o papel do BaP na AR se limitam principalmente a caminhos únicos ou descrições mecanicistas lineares, carecendo de análise integrada das características regulatórias de redes multi-alvo e multinível. Portanto, abordagens holísticas como a toxicologia de redes são necessárias para desvendar a complexa ligação entre a exposição ao BaP e a patogênese da^AR 11,12,13. No entanto, há escassez de estudos toxicológicos em rede relacionados a doenças induzidas por poluentes ambientais. A novidade deste estudo está em integrar toxicologia de rede, aprendizado de máquina e acoplamento molecular para investigar sistematicamente a patogênese da AR mediada por BaP, em vez de focar em uma única via ou alvos isolados. Ele identifica genes-chave por meio de análise topológica combinada com aprendizado de máquina e, pela primeira vez, fornece validação em nível molecular dos modos de ligação e da estabilidade termodinâmica entre BaP e os produtos de cada gene central. Ao identificar sistematicamente os potenciais mecanismos moleculares pelos quais o BaP pode promover a ocorrência e o desenvolvimento da AR, este estudo computacional visa fornecer uma base teórica para entender os gatilhos ambientais da AR e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas. Comparado às análises tradicionais de via única, essa abordagem integrada permite a avaliação sistemática das interações multi-alvo, oferecendo aplicabilidade mais ampla no estudo de mecanismos complexos de doenças ambientais. Deve-se notar, no entanto, que nosso método prioriza genes hub de alta confiança por meio de análise de interseção e topologia, o que pode inadvertidamente excluir genes candidatos biologicamente relevantes que não atendam simultaneamente aos limiares de seleção. Estudos futuros poderiam explorar estratégias complementares, como aplicar aprendizado de máquina ao conjunto de alvos previstos de união, integrar outros dados de omics ou realizar validação experimental direcionada, para confirmar e expandir ainda mais nossas descobertas.

Protocolo

Declaração de ética
Este estudo não envolveu diretamente participantes humanos ou animais envolvidos.

Aquisição de alvos do BaP
O BaP foi caracterizado pela integração de dados de múltiplos bancos de dados. O banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) foi consultado usando a palavra-chave "Benzo[a]pyrene" para obter sua estrutura química e estrutura canônica 2D (string SMILES: C1=CC=C2C3=C4C(=CC2=C1)C=CC5=C4C(=CC=C5)C=C3)¹⁴. Os potenciais alvos de BaP foram recuperados dos bancos de dados ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/), SEA (https://sea.bkslab.org/) e PharmMapper (http://lilab-ecust.cn/pharmmapper)^{15, 16 e 17}. Todos os alvos previstos estavam restritos ao proteoma Homo sapiens. A lista completa dos alvos previstos de BaP (n = 474) é fornecida na Tabela Suplementar S1. O fluxo de trabalho analítico completo é representado esquematicamente na Figura 1.

Figura 1. Fluxograma da análise de conjuntos de dados neste artigo, ilustrando o fluxo de trabalho geral, incluindo aquisição de dados, pré-processamento, análise de expressões diferenciais, construção de redes e etapas de validação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Aquisição de alvos relacionados à RA
Neste estudo, cinco conjuntos de dados de AR foram adquiridos do banco de dados NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/) usando as palavras-chave "Artrite reumatoide" e "Homo sapiens^"18. Com base no tamanho do conjunto de dados e no desenho experimental, GSE77298 (RA: 16 amostras; Controle : 7 amostras), GSE1919 (AR: 5 amostras; Controle : 5 amostras), e GSE55235 (AR: 10 amostras; Controle : 10 amostras) formaram o conjunto de treinamento para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs), enquanto GSE12021 (AR: 24 amostras; Controle : 13 amostras) e GSE55457 (AR: 13 amostras; Controle: 10 amostras) serviam como conjunto de validação. Mais detalhes sobre esses conjuntos de conjuntos, como plataformas, amostras e séries GSE, podem ser encontrados na Tabela 1.

Os dados foram padronizados usando a ferramenta online GEO2R, gerando matrizes de expressão transformadas em log2 para análises subsequentes. Para eliminar interferência de diferentes lotes experimentais, vieses sistemáticos entre conjuntos de dados foram corrigidos usando a função ComBat do pacote SVA baseada em um framework empírico paramétrico de Bayes. A Análise de Componentes Principais (PCA) foi posteriormente usada para verificar o efeito de correção, mostrando uma melhoria significativa no agrupamento entre amostras em lotes e, assim, confirmando a remoção efetiva dos efeitos em lote. A matriz de dados fundida e corrigida foi usada para análises diferenciais subsequentes.

Série GSE	Samples	Plataforma	Grupo
GSE77298	16 controles RA e 7	GPL570	Coorte de treinamento
GSE1919	5 controles RA e 5 controles	GPL91	Coorte de treinamento
GSE55235	10 controles RA e 10	GPL96	Coorte de treinamento
GSE12021	24 controles RA e 13	GPL96	Coorte de validação
GSE55457	13 controles RA e 10	GPL9	Coorte de validação

Tabela 1: Resumo dos cinco conjuntos de dados GEO utilizados neste estudo.
A tabela fornece o número de acesso GEO (série GSE), composição amostral (número de pacientes com artrite reumatoide e controles saudáveis), identificador de plataforma (GPL) para cada conjunto de dados e atribuição à coorte de treinamento ou à coorte de validação.

Análise ponderada de redes de coexpressão gênica (WGCNA)
O WGCNA foi usado para avaliar as características da rede de coexpressões dos DEGs associados à^{AR 19}. Com base na matriz de expressão corrigida por efeito em lote, o pré-processamento dos dados foi realizado primeiro: genes de baixa variância com desvio padrão inferior a 0,5 foram removidos, enquanto a qualidade da amostra e do gene foi avaliada usando uma função para avaliar boas amostras e genes. Subsequentemente, foi aplicado agrupamento hierárquico para identificar e remover amostras de valores atípicos. Para construir uma rede de coexpressões ponderadas, foi empregada uma função para avaliação sistemática dos valores de potência de limiar suave para avaliar sistematicamente valores de potência de limiar suave variando de 1 a 20. A potência = 12 foi selecionada como o limiar suave ótimo (índice de ajuste da topologia livre de escala R2 = 0,90), garantindo que a topologia da rede seguisse um critério livre de escala. Com base nesse valor de potência, foi construída uma matriz de adjacência e calculada a matriz de sobreposição topológica (TOM). Os genes eram agrupados hierarquicamente, e um algoritmo dinâmico de corte em árvore era usado para identificar módulos iniciais de genes. Subsequentemente, módulos semelhantes foram fundidos por meio do agrupamento dos autogenes dos módulos, resultando em uma rede robusta de módulos gênicos. Todas as análises foram realizadas com um pacote dedicado R para análise ponderada de redes de coexpressão, a fim de garantir a confiabilidade e reprodutibilidade da construção da rede. Foi realizada uma análise da interseção entre genes centrais DEGs/WGCNA e alvos previstos de BaP para identificar alvos centrais de BaP associados à patogênese da AR, que foram visualizados usando o software de diagrama de Venn.

Identificação de alvos associados a BaP associados à patogênese da AR
A análise de interseção foi realizada usando um pacote R para diagramas de Venn para identificar alvos de BaP que se sobrepõem à patogênese da AR. Esses foram importados para o banco de dados STRING para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI), com a espécie definida como "Homo sapiens" e a pontuação de confiança de interação definida para > 0,7 para garantir alta confiabilidade da^{rede 20}. Esse limite foi escolhido porque corresponde a um nível de "alta confiança" no banco de dados STRING, que equilibra a retenção de interações biologicamente relevantes enquanto minimiza falsos positivos tipicamente associados a pontuações de confiança mais baixas. Um corte de > 0,7 tem sido amplamente adotado em estudos de toxicologia em redes para priorizar associações proteicas robustas e reprodutíveis. O arquivo TSV resultante foi baixado do banco de dados de interação proteína-proteína (STRING) e importado para um software de visualização de rede (Cytoscape) para visualização de rede. As proteínas centrais na rede foram identificadas com base nos resultados de classificação gerados pelo algoritmo Degree no plugin CytoHubba e foram usadas para análises subsequentes.

Análise de enriquecimento KEGG e GO
As abreviações dos genes associados tanto à modulação de BaP quanto à patogênese da AR foram convertidas em IDs de Entrez usando o "org. Pacote de anotação Hs.eg.db" em R. Posteriormente, a análise de enriquecimento de vias KEGG foi realizada usando a ferramenta clusterProfer, com o limiar de significância definido em 0,05. Enquanto isso, a anotação funcional GO cobria as três principais categorias de GO: Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF), e era realizada usando a função enrichGO, com cortes tanto de valores P quanto de valores q definidos em 0,05. Deve-se notar que nenhuma correção por testes múltiplos foi aplicada, pois o objetivo principal desta análise exploratória era maximizar a descoberta de vias biológicas potencialmente relevantes e termos funcionais, gerando assim um conjunto mais amplo de hipóteses testáveis para validação experimental futura. Por fim, os resultados da análise de enriquecimento foram exibidos graficamente usando as funções de barra e dotplot do pacote enrichplot.

Validação baseada em aprendizado de máquina dos genes centrais
Para avaliar a capacidade preditiva dos genes centrais associados ao BaP e à AR, e para manter a transparência do modelo, implementamos um fluxo de trabalho sistemático de aprendizado de máquina. Usando os perfis de expressão dos genes centrais selecionados, modelos preditivos foram construídos com 11 algoritmos distintos de aprendizado de máquina: regressão de laço (LR), Máquina de Vetores de Suporte (SVM), floresta aleatória (RF), glmBoost, Modelo Linear Generalizado por etapas (GLM), regressão de crista, rede elástica (Enet), Máquina de Aumento de Gradiente (GBM), Análise Discriminante Linear (LDA), Aumento de Gradiente EXtreme (XGBoost) e Bayes naïve. Os hiperparâmetros foram otimizados por meio de validação cruzada de cinco vezes, com amostragem estratificada usada para dividir os dados em conjuntos de treinamento e validação interna. Uma semente aleatória fixa (set.seed(123)) foi usada em todo o fluxo de trabalho de aprendizado de máquina para garantir a reprodutibilidade da divisão de dados, dobras de validação cruzada e treinamento de modelos. Os hiperparâmetros-chave para cada algoritmo são fornecidos na Tabela Suplementar S2. O desempenho do modelo foi avaliado usando múltiplas métricas, incluindo área sob a curva (AUC), precisão e pontuação F1. Para enfrentar as limitações inerentes às abordagens de modelo único, aplicamos uma estratégia de conjunto empilhante que integrou previsões dos modelos base de melhor desempenho. Reconhecendo a natureza "caixa-preta" de muitos modelos de aprendizado de máquina, empregamos o algoritmo SHapley Additive ExPlanations (SHAP) para quantificar a contribuição de cada gene para as previsões. A magnitude e a direção dos valores do SHAP foram usadas para interpretar a importância dos genes nas decisões de classificação, aumentando assim a interpretabilidade dos resultados dos modelos.

Acoplamento molecular de BaP com alvos centrais
Para investigar as características de ligação entre BaP e os produtos gênicos centrais, foram realizadas simulações de acoplamento molecular. A estrutura tridimensional do BaP (ligante) foi obtida no formato SDF a partir do banco de dados PubChem. As estruturas proteicas correspondentes aos alvos centrais foram recuperadas do Banco de Dados de Proteínas (https://www.rcsb.org/) do RCSB no formato PDB, selecionadas de acordo com seus identificadores UniProt, com preferência dada a estruturas contendo ligantes cocristalizados ou coordenadas de alta resolução. Antes do acoplamento, a preparação de proteínas foi realizada usando PyMol, durante a qual moléculas de água, ligantes cocristalizados e componentes não proteicos como íons foram removidos para evitar^{interferência 21}. Para proteínas com ligantes co-cristalizados em suas estruturas originais de PDB, o centro do sítio ativo foi definido usando as coordenadas atômicas do ligante ligado. Para proteínas sem ligantes cocristalizados, o centro do sítio ativo foi determinado com base nas coordenadas dos principais resíduos, relatados na literatura como críticos para atividade catalítica ou ligação a inibidores. A grade de acoplamento estava centralizada nas coordenadas definidas do local ativo, com uma caixa cúbica de dimensões de 25 × 25 × 25 Å aplicada a cada alvo. Esse tamanho padrão de caixa de 25 Å garante cobertura total de cada local ativo com margem suficiente para amostragem de ligantes, evitando custos computacionais excessivos. Todos os cálculos de acoplamento eram executados com o AutoDock Vina (versão 1.2.5). A conformação que apresentava a pontuação de Vina mais favorável foi selecionada como modo de ligação representativa, e a energia correspondente de ligação foi registrada. Posturas de ligação tridimensionais foram geradas usando PyMol (versão 2.5.7), e diagramas de interação bidimensional foram produzidos usando o Discovery Studio (versão 2021) para visualizar interações-chave, incluindo ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos.

Simulação de dinâmica molecular
Simulações de dinâmica molecular foram realizadas com o Gromacs 2025.3, usando os complexos derivados do acoplamento como estruturas iniciais. Os átomos de proteína foram modelados com o campo de força AMBER14SB, e moléculas de água foram representadas usando o modelo TIP3P. Cada complexo proteína–ligante foi solvado em uma caixa cúbica de água, com uma distância mínima de 1 nm entre a superfície da proteína e a fronteira da caixa. Íons de sódio ou cloreto eram adicionados conforme necessário para alcançar a eletroneutralidade do sistema. Uma minimização inicial de energia foi realizada usando uma combinação de algoritmos de descida mais íngreme e gradiente conjugado, cada uma com até 10.000 passos. Interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas pelo método Particle-Mesh Ewald (PME), enquanto uma distância de corte de 1,0 nm foi aplicada tanto a interações eletrostáticas de van der Waals quanto a interações eletrostáticas de curto alcance. Após a minimização de energia, os sistemas foram gradualmente equilibrados sob condições NVT (volume e temperatura constantes) e NPT (pressão e temperatura constantes). Séries de produção de 100 ns foram então realizadas sob temperatura e pressão constantes, com um intervalo de tempo de 0,002 ps (2 fs) e um total de 50.000.000 de etapas. Cada simulação foi realizada uma vez (sem réplicas), pois o objetivo principal era avaliar a estabilidade dos complexos de ligação sob condições padrão. A temperatura era mantida usando o termostato V-rescale, e a pressão era controlada com o barostato Parrinello–Rahman. Durante toda a simulação, um corte de 1,0 nm foi consistentemente aplicado para interações não ligadas. Para avaliar a estabilidade e flexibilidade estrutural, calculamos o desvio quadrático médio (RMSD) das posições atômicas, a flutuação quadrática média (RMSF) por resíduo, o raio de giro (Rg) como medida da compacidade estrutural e a área superficial acessível ao solvente (SASA). Todos os gráficos foram gerados usando o QtGrace.

Resultados

Aquisição de alvos do BaP
Dados sobre a estrutura molecular do BaP foram obtidos do banco de dados PubChem (Figura 2A). Os potenciais alvos biológicos do BaP foram sistematicamente previstos pela integração de informações de três bancos de dados complementares — ChEMBL, PharmMapper e SEA — resultando na identificação de 474 alvos potenciais (Figura 2B).

Discussão

A AR é uma doença autoimune complexa resultante da interação entre suscetibilidade genética e fatores ambientais. Entre os inúmeros fatores de risco ambientais, os PAHs, um dos poluentes atmosféricos mais comuns, são considerados um elo importante que conecta a exposição ambiental ao início da AR. Estudos anteriores revelaram preliminarmente que as HAPs podem influenciar o equilíbrio da diferenciação das células imunes por meio da via da RHA, além de induzir estresse oxidativo. O BaP, um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu	1.2.5 (SCR_011958)	Software de acoplamento molecular
clusterProfiler (pacote R)	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler	4.10.0 (SCR_016884)	Pacote R para análise de enriquecimento
CytoHubba (plugin do Cytoscape)	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	0.1	Plugin para identificação de genes hub (algoritmo de grau)
Citoscape	https://cytoscape.org	3.10.1 (SCR_003032)	Software de visualização de redes
Discovery Studio	Dassault Systè mes BIOVIA	2021	Software para geração de diagramas de interação 2D
enrichplot (pacote R)	https://bioconductor.org/packages/enrichplot	1.22.0 (SCR_021165)	Pacote R para visualização de resultados de enriquecimento
GROMACS	https://www.gromacs.org	2025.3 (SCR_014565)	Software de simulação de dinâmica molecular
limma (pacote R)	https://bioconductor.org/packages/limma	3.58.1 (SCR_010943)	Pacote R para análise de expressão diferencial
org. Hs.eg.db (pacote R)	https://bioconductor.org/packages/org. Hs.eg.db	3.18.0 (SCR_006442)	Pacote de anotação R para identificadores de genes humanos
PyMol	Schrö dinger, Inc	2.5.7 (SCR_000305)	Software de visualização molecular
QtGrace	https://sourceforge.net/projects/grace/	0.2.6	Ferramenta de plotagem para análise de trajetórias
R (ambiente de programação)	https://www.r-project.org	4.3.1 (SCR_001905)	Software de computação estatística
Banco de dados STRING	https://string-db.org	12 (SCR_005223)	Banco de dados de interação proteína-proteína
venn (pacote R)	https://cran.r-project.org/package=venn	1.11	Pacote R para geração de diagrama de Venn
WGCNA (pacote R)	https://cran.r-project.org/package=WGCNA	1,72 (SCR_003302)	Pacote dedicado R para análise de redes de coexpressões ponderadas