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Artigo de método

Sequenciamento Multi-Locus para Tipagem de Tensão de Toxoplasma gondii

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DOI:

10.3791/70645

⸱

26 de maio de 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar e genótipar rapidamente cepas de Toxoplasma gondii usando sequenciamento portátil por nanoporos de marcadores genéticos selecionados, permitindo a identificação escalável e direcionada de cepas em isolados mantidos em laboratório, com potencial aplicação futura em ambientes de vigilância.

Resumo

Toxoplasma gondii é um parasita apicomplexano distribuído globalmente, caracterizado por uma diversidade genética substancial, o que exige abordagens moleculares precisas para a discriminação de cepas. O objetivo deste protocolo é estabelecer um fluxo de trabalho reprodutível para genotipagem multi-locus direcionada de isolados cultivados de T. gondii . O procedimento envolve propagação in vitro de cepas representativas do Tipo I (RH) e Tipo II (ME49), extração de DNA genômico, amplificação específica do locus dos genes SAG2 e SAG3 , e análises baseadas em sequenciamento para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e eventos de inserção/deleção (INDEL). Os dados de sequenciamento são processados para gerar sequências de consenso de alta confiança e para realizar alinhamento comparativo para a identificação de polimorfismos específicos de várias ceps. A aplicação desse fluxo de trabalho a cepas arquetípicas demonstrou alta eficiência de mapeamento, profundidade de leitura consistente entre loci-alvo e recuperação precisa dos tamanhos esperados de amplicons, confirmando a detecção confiável da variação genética em nível de locus. Embora a atribuição abrangente de genótipos exija a inclusão de marcadores padronizados adicionais, esse protocolo fornece uma estrutura escalável e reprodutível para a caracterização genética direcionada de isolados de T. gondii mantidos em laboratório e suporta análise consistente de sequências multi-locus.

Introdução

Toxoplasma gondii é um parasita apicomplexano distribuído globalmente e uma grande ameaça zoonótica transmitida por alimentos e água, capaz de infectar praticamente todos os animais de sangue quente, com os felinídeos servindo como hospedeirosdefinitivos 1. A infecção em humanos e animais ocorre comumente por ingestão de cistos teciduais ou oocistos esporulados, e a capacidade do parasita de alternar entre os estágios de taquizoíto e bradicoíto permite persistência prolongada nos tecidos neurais e musculares, contribuindo tanto para a transmissão transmitida por carne quanto ambiental 2,3.

Embora três linhagens clonais (Tipos I, II e III) dominem na Europa e América do Norte, uma extensa diversidade genética, incluindo linhagens atípicas e recombinantes, foi documentada globalmente, especialmente em regiões com ricos reservatórios de vidaselvagem 4. A discriminação precisa das cepas é, portanto, essencial para elucidar dinâmicas de transmissão, investigar surtos e compreender a epidemiologia regional. Abordagens tradicionais de genotipagem, como PCR-RFLP, tipagem de sequência multi-locus baseada em Sanger (MLST) e análise de microssatélites contribuíram substancialmente para nossa compreensão da estrutura populacional de T. gondii , mas são limitadas em resolução, taxa de transferência e capacidade de detectar variação intra-genótipos. Essas abordagens frequentemente exigem múltiplas reações separadas e podem falhar em detectar inserções, deleções ou haplótipos complexos dentro do loci1 polimórfico. O sequenciamento de próxima geração (NGS) de leitura curta melhorou a detecção de variantes raras, mas permanece limitado na identificação de mudanças estruturaiscomplexas 4.

Plataformas de sequenciamento de leitura longa, particularmente a Oxford Nanopore Technologies, agora oferecem a capacidade de gerar leituras contínuas de alta precisão adequadas para resolver variantes estruturais e loci5 altamente polimórficos. Sua portabilidade, capacidade de análise em tempo real e compatibilidade com fluxos de trabalho baseados em amplicon os tornam ferramentas promissoras para aplicações de campo e investigações desurtos 6. Apesar dessas vantagens, fluxos de trabalho padronizados de leitura longa multi-locus para genotipagem rotineira de T. gondii continuam limitados.

Para suprir essa lacuna, estabelecemos um fluxo de trabalho escalável de sequenciamento de amplicões de leitura longa, direcionado a dois loci polimórficos (Figura 1). Combinado com um pipeline de polimento consensual e chamada de variantes, essa abordagem permite a detecção precisa de SNPs e INDELs, apoiando a discriminação por nível de deformação. O protocolo é adequado para laboratórios equipados para amplificação por PCR e sequenciamento de leitura longa, tendo sido validado usando isolados cultivados. Embora a adaptação a amostras clínicas ou ambientais primárias possa ser viável, tais aplicações exigem otimização e validação adicionais. No geral, esse fluxo de trabalho fornece uma estrutura estruturada para caracterização molecular direcionada e pode apoiar investigações epidemiológicas.

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Protocolo

Este estudo utilizou cepas de parasitas de laboratório já estabelecidas e linhas celulares de fibroblastos humanos obtidas comercialmente. Nenhum humano ou animal esteve diretamente envolvido.

NOTA: Salvo especificação em contrário, buffers e reagentes usados neste protocolo são fornecidos nos kits comerciais listados na Tabela de Materiais.

1. Seleção de biomarcadores

  1. Baixe sequências genômicas do SAG2 e SAG3 no formato FASTA do banco de dados genômico ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. Realize alinhamentos de sequência par a par usando EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Selecione regiões de amplicã ≤1.600 pares de bases (pb) para minimizar o tempo de sequenciamento e garantir uma amplificação eficiente por PCR.
  4. Certifique-se de que cada região contenha SNPs informativos ou polimorfismos INDEL para diferenciação de deformações.

2. Cultura e colheita de taquizoítos Toxoplasma gondii

  1. Manutenção de culturas celulares hospedeiras
    1. Obtenha fibroblastos do prepúcio humano (HFFs) de uma fonte comercial certificada e cultive-os em meio de crescimento completo composto pelo Meio Eagle Modificado da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
    2. Incubar culturas a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada.
  2. Manutenção e expansão de linhas parasitas.
    1. Infectar monocamadas de fibroblastos em 80–90% de confluência usando taquizoítos em uma multiplicidade de infecção de 1–3 parasitas por célula hospedeira. Para um frasco T25 contendo aproximadamente 1 × 106 fibroblastos, adicione 1–3 × 106 taquizoítos.
    2. Examine culturas diariamente usando um microscópio de luz invertida com ampliação de 20× ou 40×. Identifique a lise da célula hospedeira observando a disrupção generalizada de uma monocamada.
      NOTA: Não use culturas de fibroblastos além da passagem 20 para evitar artefatos relacionados à cultura.
    3. Colheita de taquizoítos.
      1. Colete culturas quando ≥90% da lise da célula hospedeira estiver visível.
      2. Centrifuge a 1.300 × g por 10 minutos a 4 °C.
      3. Resuspenda o pellet em 10 mL de soro salino estéril tamponado com fosfato por pipeteamento suave, e centrifuge novamente a 1.300 × g por 10 minutos a 4 °C. Repita mais uma vez.

3. Extração de DNA genômico e geração de amplicons

  1. Extraia DNA genômico usando um kit de purificação genômica baseado em coluna desílica 7. DNA eluto em tampão de elução de 50 μL.
  2. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
  3. Armazene o DNA a 4 °C para armazenamento de curto prazo ou a −20 °C para armazenamento a longo prazo.
  4. Prepare reações de PCR usando uma mistura mestre de DNA polimerase de alta fidelidade, primers específicos para o lugar (Tabela Suplementar 1) e água sem nuclease.
  5. Realizar amplificação por PCR usando um ciclador térmico calibrado sob as seguintes condições de ciclagem: (a) desnaturação inicial a 98 °C por 30 s, (b) 35 ciclos a 98 °C por 10 s; recozimento específico do locus: 60 °C para SAG2, 68 °C para SAG3, 30 s; 72 °C por 20 s, (c) Extensão final: 72 °C por 2 min.
  6. Verifique os produtos de PCR por eletroforese em um gel de agarose a 1,5%.
  7. Purifique os produtos de PCR usando um sistema de PCR em coluna e de extração em gel, conforme as instruções dofabricante 8. DNA de eluto em 15–20 μL de tampão de elução.
    NOTA: A eficiência e o rendimento da PCR podem ser reduzidos por baixa qualidade do molde de DNA, concentração ou condições de reação subótimas. Se o rendimento do amplicão for baixo, verifique a integridade do molde de DNA usando eletroforese em gel de agarose, além da concentração e pureza usando um espectrofotômetro. As temperaturas e concentrações de primer de recozimento por PCR também devem ser otimizadas para os pares de primer utilizados, e o número do ciclo de PCR deve ser aumentado conforme necessário.

4. Preparação de bibliotecas para sequenciamento de leituras longas

  1. Reparo final e dA-tailing
    1. Descongele todos os reagentes e misture bem por vórtice. Dilua a amostra de controle de DNA com 10,5 μL de tampão de elução apenas durante o primeiro uso e mantenha-a no gelo.
      NOTA: Sempre faça as esferas magnéticas de vórtice cuidadosamente antes de cada uso.
      ATENÇÃO: Não faça vórtice na mistura enzimática de preparação final; Misture suavemente pipetando.
    2. Pipete 200 fmol (~130 ng para um fragmento de 1 kb) de cada amostra de DNA em tubos PCR de 0,2 mL e ajuste o volume para 11,5 μL com água sem nuclease.
    3. Adicione 1 μL de amostra de controle de DNA diluída por tubo e misture pipetando de 10 a 20 vezes.
    4. Prepare uma mistura master de preparação final por amostra contendo 1,75 μL de Tampão de Reação e 0,75 μL de Mistura de Enzimas (incluindo 5% de excesso).
    5. Adicione 2,5 μL de master mix a cada amostra, misture suavemente e desacelere brevemente.
    6. Incube em um termificador a 20 °C por 5 minutos, seguido por 65 °C por 5 minutos.
  2. Purificação do DNA preparado por extremidades
    1. Transfira a reação de 15 μL para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL com baixa ligação ao DNA.
    2. Adicione esferas magnéticas resuspensas de 15 μL, misture suavemente e gire brevemente.
    3. Incube as amostras em um misturador rotador por 5 minutos em temperatura ambiente.
    4. Prepare etanol fresco 80% para lavagem.
    5. Coloque os tubos em um suporte magnético até que as contas formem bolas e remova o sobrenadante com cuidado.
    6. Lave as esferas duas vezes com 200 μL de etanol 80%.
      NOTA: Deixe as esferas completas em pellets e depois remova cuidadosamente o etanol.
    7. Secar contas ao ar por ~30 s; Evite secar demais para evitar rachaduras.
    8. Ressuspenda as esferas em água livre de nuclease de 10 μL e incube por 2 minutos em temperatura ambiente.
    9. Coloque os tubos em um suporte magnético e transfira 10 μL eluato para um tubo de microcentrífuga limpo e com baixa ligação ao DNA.
    10. Meça a concentração de DNA usando 1 μL em um espectrofotômetro.
  3. Código de barras nativo
    1. Descongelar Mistura Master Ligase Blunt/TA, EDTA, Short Fragment Buffer (SFB) e códigos de barras nativos (NB01–NB24).
    2. Atribua códigos de barras individuais às amostras 1–24.
    3. Monte a reação do código de barras com DNA preparado na extremidade de 7,5 μL, código de barras nativo de 2,5 μL e mistura mestre Ligase Blunt/TA de 10 μL
    4. Misture bem pipetando de 10 a 20 vezes.
    5. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente e termine a reação com 4 μL de EDTA, misture bem pipetando e desfaça brevemente.
    6. Amostras codificaram em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL com baixo DNA e ligação ao DNA. Adicione esferas magnéticas a 0,4× o volume total de amostras agrupadas (por exemplo, adicione esferas de 230 μL a 575 μL de DNA agrupado). Misture bem pipetando e depois incube em uma batedeira rotativa em temperatura ambiente por 10 minutos.
    7. Lave as esferas com 700 μL de Short Fragment Buffer (SFB). Faça um movimento das esferas para resuspensão, gire para baixo, depois retorne a amostra ao suporte magnético e deixe as esferas se transformarem em pellets. Remova o buffer usando uma pipeta, depois descarte-o.
    8. Repita o passo anterior.
    9. Vire e coloque o tubo de volta no suporte magnético. Pipete qualquer buffer residual.
    10. Remova o tubo do suporte magnético e resuspenda o pellet em 35 μL de água sem nuclease, batendo suavemente.
    11. Incube a 37 °C por 10 minutos com mistura intermitente, depois transfira o eluato para um tubo de microcentrífuga limpo e de baixa ligação ao DNA.
  4. Ligação de adaptadores e limpeza da biblioteca
    1. Montar a reação de ligação com DNA agrupado com código de barras de 30 μL, adaptador nativo de 5 μL, tampão de ligação de 10 μL (5×) e ligase de DNA T4 de 5 μL.
    2. Misture bem a reação, pipetando suavemente e girando brevemente para baixo. Incube a reação por 20 minutos em temperatura ambiente.
    3. Adicione 20 μL de esferas magnéticas ressuspensas à reação e misture pipetando. Incube em um batedeiro rotador por 10 minutos em temperatura ambiente.
    4. Centrifuge a amostra e o pellet no suporte magnético. Mantenha o tubo no ímã e a pipeta fora do sobrenadante.
    5. Lave as esferas adicionando 125 μL de Short Fragment Buffer (SFB). Faça um movimento nas esferas para resuspender, gire para baixo, depois volte o tubo para o suporte magnético e deixe as esferas se transformarem em pellets. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e depois descarte-o.
    6. Repita o passo anterior.
    7. Vire para baixo e coloque o tubo de volta no ímã. Faça uma pipeta para remover qualquer supernadante residual. Remova o tubo do suporte magnético e ressuspenda o pellet em um Buffer de Elução (EB) de 15 μL.
    8. Centrifuge e incube por 10 minutos a 37°C. Agite a amostra a cada 2 minutos batendo suavemente por 10 segundos para estimular a elução do DNA.
    9. Faça pellets nas contas em um ímã até que o eluado fique claro e incolor, por pelo menos 1 minuto.
    10. Remova e retenha 15 μL de eluato contendo a biblioteca de DNA em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL, com baixa ligação a DNA.
    11. Quantifique a biblioteca final usando um espectrofotômetro.

5. Preparação de células de fluxo e sequenciamento de nanoporos

  1. Preparação da célula de fluxo
    1. Inspecione a célula de fluxo e confirme ≥80 poros ativos.
    2. Prepare a mistura de priming combinando 117 μL de solução de lavagem com 3 μL de solução de amarração em um tubo de microcentrífuga para um volume total de 120 μL. Misture suavemente pipetando para evitar a introdução de bolhas de ar. Carregue lentamente toda a mistura de priming de 120 μL na porta de priming da célula de fluxo, garantindo que nenhuma bolha de ar seja introduzida durante a carga.
  2. Carregamento e sequenciamento de bibliotecas
    1. Prepare a mistura de sequenciamento combinando 15 μL de Buffer de Sequenciamento (SB), 10 μL de Esferas de Biblioteca (LIB) e 5 μL de biblioteca de DNA. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo de 3 a 5 vezes para evitar que elas formem bolhas. A mistura resultante de 30 μL está pronta para carregar ou pode ser ajustada para 45 μL, se necessário.
    2. Carregue lentamente 30–45 μL da mistura de sequenciamento na porta da amostra da célula de fluxo, dispensando a solução em gota.
      ATENÇÃO: Evite introduzir bolhas de ar e não permita que a ponta da pipeta toque a membrana. Feche a porta de carregamento com segurança após a dispensação.
    3. Comece a sequenciar com a chamada de base em tempo real ativada e monitore a atividade dos poros.
    4. Continue sequenciando até que ≥500× de cobertura por amplicon seja alcançada (recomendada ≥1000×), para garantir profundidade de leitura suficiente para chamadas de base precisas, geração confiável de sequências consensuais e detecção confiante de variantes de baixa frequência.
      NOTA: Se houver baixa cobertura de sequenciamento, garanta entrada de amplicã de alta qualidade na concentração requerida, poros ativos suficientes da célula de fluxo e estenda o sequenciamento para alcançar a cobertura recomendada.

6. Processamento de dados e análise de variantes

  1. Chamada de base e desmultiplexação
    1. Realizar chamadas de base de alta precisão usando softwares de chamada de base associados à plataforma com configurações padrão de alta precisão para gerar arquivos FASTQ por amostra. O demultiplex lê por código de barras e mantém apenas as leituras, passando pelos filtros de controle de qualidade.
  2. Mapeamento de leitura e processamento BAM
    1. Baixe o Toxoplasma gondii reference genoma assembly GCF_000006565.2 (TGA4) do banco de dados genômico do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Extrair o cromossomo VIII (NC_031476.1) para análise SAG2 e cromossomo XII (NC_031480.1) para análise SAG3 . Indexe as sequências de referência usando ferramentas SAMs e gere um índice de alinhamento usando um construtor de índice de alinhamento de leitura longa.
    2. O mapa lê para o genoma de referência indexado usando um algoritmo de alinhamento de leitura longa otimizado para dados de sequenciamento nanopore (por exemplo, preset para mapeamento de leitura longa; -ax map-ont).
    3. Converta a saída de alinhamento para formato BAM, ordene e indexe arquivos BAM usando SAMtools. Adicione informações de grupo de leitura a cada arquivo BAM usando ferramentas Picard. Calcule a cobertura média por locus usando estatísticas de profundidade e gere estatísticas de mapeamento usando métricas flagstat.
  3. Geração de sequências consensuais
    1. Gerar sequências de consenso por amplicon usando um algoritmo de polimento por consenso baseado em rede neural com parâmetros padrão. Exporte sequências de consenso no formato FASTA para análise a jusante.
    2. Realize alinhamento baseado em referência e análise comparativa de sequências usando bancos de dados genômicos públicos disponíveis. Visualize alinhamentos de leitura e posições polimórficas usando software de visualização do genoma.
  4. Chamada variante
    1. Realize a detecção de variantes usando um algoritmo de chamada de variantes baseado em consenso. Separe polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e eventos de inserção/deleção (INDELs) usando ferramentas de seleção de variantes (Arquivo Suplementar 1).
    2. Aplique limiares de filtragem de qualidade. Para SNPs, variantes de filtro com, por exemplo, QD < 2.0, FS > 60.0 ou MQ < 40.0. Para INDELs, variantes de filtro com, por exemplo, QD < 2.0 ou FS > 200.0.
    3. Comprimir e indexar arquivos VCF filtrados usando ferramentas padrão de processamento de VCF. Gerar estatísticas variantes usando utilitários resumidos VCF.
  5. Atribuição de genótipos
    1. Extrair variantes específicas do locus das regiões SAG2 e SAG3 e comparar perfis polimórficos com sequências de estirpes de referência para atribuir genótipos de T. gondii .

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Resultados

O DNA genômico de Toxoplasma gondii foi amplificado com sucesso por reação em cadeia da polimerase (PCR) que atingiu dois marcadores genéticos: SAG2 e SAG3 (Figura 2). Após a purificação, os produtos de PCR produziram bandas distintas dos tamanhos esperados na eletroforese em gel de agarosa, correspondendo a 639 pb (SAG2) e 1158 pb (SAG3). A clareza e consistência dessas bandas confirmaram a amplificação bem-suced...

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Discussão

Este estudo demonstra a utilidade do sequenciamento de leitura longa Oxford Nanopore combinado com uma abordagem multi-locus direcionada para genotipagem rápida e confiável de Toxoplasma gondii. Ao focar em dois loci de antígenos superficiais bem caracterizados, SAG2 e SAG3, estabelecemos uma prova de conceito para o sequenciamento multi-locus baseado em Oxford Nanopore por meio de análises comparativas das cepas RH (Tipo I) e ME49 (Tipo II), demonstrando a cap...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi financiado pelo Ministério do Ensino Superior e Pesquisa Científica do Egito, representado pelo Escritório Egípcio de Assuntos Culturais e Educacionais em Londres, e pelo UKRI MRC (MR/X502947/1). A Figura 1 foi criada com BioRender.com

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Para eletroforese em gel
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Meio de cultura celular
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AWorkflow Nextflow para processamento e análise de dados de sequenciamento de amplicons de nanopore; versão 1.2.1 foi usada para análise reproduzível de dados MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AWorkflow Nextflow para alinhamento de leituras de sequenciamento de nanopore a sequências de referência e visualização integrada usando IGV; versão 1.2.3 foi usada para análise reproduzível de dados MinION.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-FPara limpeza de contas
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Suplemento para cultura celular
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Lavagem do flow cell
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Confirmação de tamanho
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Fibroblastos dérmicos humanos isolados de prepúcio neonatal; usados para propagação de parasitas
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Flow cell para sequenciamento
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BSequenciador de nanopore; sequenciamento realizado usando o software MinKNOW (v25.09.16) para controle do dispositivo e chamada de base em tempo real.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ASoftware usado para controle do dispositivo MinION Mk1B, sequenciamento em tempo real e chamada de base; versão 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Barcode para amostras multiplexadas
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367Ligação de DNA
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Ligação de adaptador
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Usado na ligação de DNA
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Preparação de biblioteca
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581Grau de biologia molecular
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5Purificação do produto PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Mistura de antibióticos
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Buffer de lavagem
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SPolimerase de alta precisão
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504Extração de DNA
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Enzima de ligação de adaptador
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102Corante de coloração de DNA
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Carregando amostras no gel
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Para passagem de HFFs
1× TAE or 1× TBE buffer——Buffer de corrida
2× PCR premix——Mistura pronta para PCR

Referências

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  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Fluxo de Trabalho de GenotipagemExtração de DNA GenômicoAmplificação Específica de LocusGene SAG2Gene SAG3Polimorfismo de Nucleotídeo ÚnicoAlinhamento de Sequências
Sequenciamento Multi-Locus para Tipagem de Tensão de Toxoplasma gondii
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