Um dispositivo milifluido contínuo para cultura para o estudo de Escherichia coli sob condições nutritivas baixas e flutuantes

Resumo

Apresentamos um protocolo para o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), que permite o cultivo de populações bacterianas sob condições constantes de baixo teor de nutrientes (até centenas de concentrações nanomolares) ou flutuações temporais de nutrientes em uma escala de tempo minuciosa.

Resumo

Habitats microbianos na natureza são frequentemente caracterizados por baixas concentrações de nutrientes mistos, heterogeneidade espacial e flutuações temporais. No entanto, os métodos tradicionais de cultivo laboratorial não conseguem replicar essas condições. Culturas em lote não conseguem sustentar o crescimento em ambientes pobres em nutrientes, enquanto os quimostratos mantêm crescimento em estado estacionário com um único nutriente limitante, mas são difíceis de implementar quando o objetivo é manter concentrações baixas definidas de misturas de nutrientes ou introduzir flutuações rápidas. Sistemas microfluídicos geram ambientes dinâmicos, mas produzem biomassa insuficiente para análises ômicas em nível populacional. Para enfrentar essas limitações, apresentamos o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), uma plataforma versátil para estudar respostas microbianas a condições nutritivas estáveis e flutuantes. O MCCD abriga populações bacterianas dentro de um filtro Sterivex (membrana filtrante porosa de fluoreto de polivinilideno [PVDF] de 0,45 μm), onde um fluxo contínuo de meio sustenta condições de cultura estáveis enquanto previne a depleção dos nutrientes. Um sistema de válvula solenóide de três vias, controlado por software personalizado da Matlab, permite flutuações precisas de nutrientes em escala minuciosa. Este protocolo fornece um guia passo a passo para operar o MCCD em dois modos: (1) condições constantes de baixo teor de nutrientes e (2) condições de nutrientes flutuantes. Usando esse sistema, Escherichia coli cresceu exponencialmente em uma mistura de aminoácidos e nucleobases presentes em concentrações de dezenas a centenas de nanomolares, atingindo concentrações celulares na ordem de 10,9 células/mL. Ao recriar características-chave de habitats microbianos naturais, o MCCD possibilita o estudo do crescimento e da fisiologia bacteriana sob condições controladas, porém ecologicamente relevantes, em E. coli e outras espécies microbianas.

Introdução

Bactérias em habitats naturais enfrentam uma paisagem de nutrientes que frequentemente varia tanto em composição quanto em concentração e pode flutuar em uma ampla gama de escalas de tempo 1,2,3,4. Em ambientes como^{oceano 5}, solo³ e^{intestino 6}, o crescimento microbiano é frequentemente limitado por um ou mais nutrientes essenciais, e a disponibilidade de nutrientes pode mudar devido a processos físicos, químicos e^{biológicos 4}. Essas misturas de nutrientes e suas flutuações impulsionam estratégias microbianas para sobrevivência e crescimento, moldando respostas em diferentes níveis de organização biológica⁴.

Adaptações microbianas à dinâmica dos nutrientes ocorrem em níveis de comunidade, população e célula única. No nível da comunidade, as flutuações podem promover a coexistência da espécie⁷, coordenar a composição da comunidade e a atividade metabólica com a variação temporal⁸, e criar oportunidades para novas espécies^{colonizarem 9}. No nível populacional, mudanças nas condições nutricionais podem acelerar a evolução ao selecionar para alterações genéticas¹⁰ ou induzir variabilidade fenotípica, incluindo estratégias de hedging¹¹, que melhoram a sobrevivência sob condições imprevisíveis. No nível unicelular, as bactérias ajustam sua fisiologia em resposta ao ambiente^{nutritivo 12,13}. Um exemplo recentemente relatado é uma fisiologia específica que confere às bactérias uma vantagem de crescimento sob condições^{flutuantes 14}. Como as bactérias frequentemente enfrentam limitações de nutrientes, estudar como respondem a condições de nutrientes baixos e variáveis — tanto como células individuais quanto dentro de populações ou comunidades — é essencial para entender seu comportamento em seus ambientes naturais.

Os quimostatos são bem adequados para estudar o crescimento sob limitação de um único nutriente, mas são difíceis de usar quando o objetivo é controlar as concentrações de múltiplos nutrientes em misturas de baixa concentração. Os quimostatos têm sido ferramentas valiosas para estudar a adaptação bacteriana à limitação de nutrientes, proporcionando um ambiente bem controlado e estável. No entanto, seu funcionamento os restringe inerentemente a condições em que o crescimento é limitado por um único elemento nutritivo essencial. Em um quimostato, a taxa de diluição é ajustada para que o crescimento celular equilibre o fornecimento de um nutriente limitante, fixando assim a taxa de crescimento em vez das concentrações^{individuais de nutrientes 15}. Esse arcabouço não se generaliza facilmente para ambientes que contenham misturas de nutrientes substituíveis — como múltiplas fontes de carbono — porque a taxa de diluição controla apenas a taxa de crescimento geral, e não as concentrações de cada componente no^{meio 16,17}. Como resultado, as concentrações de nutrientes individuais e seus padrões de coutilização surgem da utilização microbiana, em vez de serem prescritas^{externamente 16,17}.

Além disso, embora flutuações nutricionais possam ser induzidas em quimostatos, flutuações rápidas ou mudanças únicas na escala de minutos são difíceis de alcançar devido aos volumes tipicamente grandes da cultura. Dispositivos microfluídicos surgiram como ferramentas poderosas para criar ambientes nutricionais precisos de baixa concentração e^{flutuações 14}. Quando combinadas com microscopia de vídeo, elas possibilitam a medição do crescimento de células únicas. Embora sistemas microfluídicos permitam quantificar a expressão de proteínas selecionadas usando repórteres fluorescentes, ao contrário dos quimiotastos, dispositivos microfluídicos típicos são pequenos demais para produzir a biomassa necessária para análises ômicas, por exemplo, para estudar o proteoma de uma população bacteriana. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD).

O MCCD possibilita o crescimento bacteriano sob condições controladas de nutrientes, incluindo condições constantes de baixo teor de nutrientes com pouca ou nenhuma depleção, bem como condições flutuantes de nutrientes, utilizando um sistema de cultura de fluxo contínuo capaz de gerar biomassa suficiente para análises a jusante. O MCCD utiliza um filtro PVDF de 0,45 μm como vaso de cultivo, no qual o meio é continuamente reabastecido por uma bomba peristáltica que entrega meio fresco de um reservatório (Figura 1A). A membrana porosa do filtro retém as bactérias enquanto permite um fluxo prescrito de nutrientes, o que previne a depleção de nutrientes mesmo em concentrações baixas (centenas de nanomolares a micromolares). Como a biomassa é retida enquanto o meio fresco flui continuamente pelo dispositivo, o MCCD compartilha semelhanças com os retentostatos¹⁸, nos quais as células são retidas enquanto o meio é renovado. No entanto, o MCCD difere dos retentostatos clássicos em sua arquitetura e modo de entrega de nutrientes. O retentostato normalmente opera como um reator a granel agitado, onde as células são suspensas em um volume de cultura bem misturado. Nessas condições, a disponibilidade de nutrientes depende do equilíbrio entre mistura, difusão e absorção celular, e podem ocorrer depleções ou gradientes locais, especialmente em baixas concentrações de nutrientes e altas densidades celulares. Em contraste, no MCCD, as células se montam diretamente na membrana dentro do cartucho de Sterivex de pequeno volume, formando camadas de apenas algumas células de espessura que são continuamente expostas ao meio em fluxo. Nenhuma mistura ativa é imposta dentro do cartucho; em vez disso, o meio é homogeneizado a montante e fornecido por fluxo contínuo. Os nutrientes são fornecidos por transporte convectivo através das camadas celulares finas e, como a distância de difusão é pequena e a taxa de fluxo alta, os gradientes locais de nutrientes são minimizados. Como resultado, as condições nutritivas experimentadas pela população são determinadas principalmente pela composição do meio de entrada, permitindo condições de baixo teor de nutrientes mais consistentes e bem definidas do que podem ser garantidas em sistemas de retenção agitados.

Figura 1: Dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD) para cultura bacteriana sob condições de baixa concentração ou flutuações de nutrientes. (A) Esquema do MCCD para condições constantes de nutrientes. Uma bomba peristáltica conduz o fluxo de meio fresco de um reservatório através de um filtro PVDF de 0,45 μm contendo células bacterianas. A membrana porosa no filtro retém as bactérias enquanto permite a passagem do meio por ele. O fluxo contínuo do meio mantém condições nutritivas constantes dentro do filtro, mesmo em concentrações muito baixas de nutrientes. (B) Esquema do MCCD para condições nutricionais flutuantes. Uma válvula solenóide de três vias controlada por software, a montante da bomba peristáltica, alterna o fluxo de médio entre dois reservatórios (por exemplo, alta concentração de nutrientes, C_Alta, e baixa concentração de nutrientes, C_Baixa). O software controla a posição do êmbolo da válvula para determinar a fonte ativa de entrada. (C) Montagem fluídica para condições constantes de nutrientes. Uma tampa com três tubos de silicone que a atravessam sela a garrafa contendo um meio fresco. Um tubo se conecta a um filtro de ventilação para aeração, enquanto os outros dois transportam o meio até os filtros. Conexões Luer Barb-to-Male conectam esses tubos ao tubo peristáltico e conectam cada tubo peristáltico a uma válvula de retenção unidirecional, servindo como ponto de entrada para o filtro. A saída do filtro também é equipada com uma válvula de retenção unidirecional. A imagem mostra duas amostras, cada uma contida em um filtro. (D) Montagem fluídica para condições flutuantes de nutrientes. A plataforma metálica abriga o microcontrolador e componentes eletrônicos que controlam duas válvulas solenóides por meio de software personalizado MATLAB. Conexões rosqueadas para Barb conectam tanto as entradas quanto as saídas das válvulas solenóides ao tubo. Cada válvula possui duas entradas para os dois meios alternativos, aqui um meio de alta concentração de nutrientes, C_Alto, tubos com rotulação vermelha, e um meio de baixa concentração de nutrientes, C_Baixo, tubos com rotulação azul. Os meios de comunicação estão contidos dentro de garrafas tampatas com um filtro de ventilação, como em (C). As saídas das válvulas solenóides conectam-se aos filtros por meio de tubos peristálticos, como no conjunto em regime permanente (C). A imagem mostra duas amostras, cada uma contida em um filtro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Além disso, a incorporação de uma válvula solenóide de três vias controlada por software, a montante do filtro Sterivex, permite ao usuário alternar o fluxo do meio entre dois meios contidos em reservatórios diferentes (Figura 1B). Como resultado, o dispositivo pode ser usado para estudar a resposta das bactérias a um ambiente estável em uma condição nutritiva constante (incluindo baixa concentração) ou a flutuações nutricionais, com escalas de tempo de variação de vários minutos ou mais.

Este protocolo descreve a montagem e operação do MCCD para estudar bactérias sob condições de baixo e flutuante nutriente. Como exemplo, esse protocolo fornece um guia passo a passo para conduzir um experimento de crescimento usando Escherichia coli NCM3722 em dois modos de operação do MCCD: condições constantes de baixo teor de nutrientes e condições nutritivas flutuantes. O sistema MCCD pode ser facilmente adaptado a outras condições nutritivas e espécies microbianas, tornando-se uma plataforma versátil para estudar a fisiologia bacteriana em ambientes nutricionais típicos daqueles encontrados na natureza.

Protocolo

1. Crescimento bacteriano em condições constantes de nutrientes

NOTA: Este protocolo descreve o procedimento para realizar uma curva de crescimento de E. coli NCM3722 em uma condição muito diluída de Meio Definido Rico ("baixo RDM"). Essa curva de crescimento dura 12 horas, com uma amostra coletada a cada 2 horas (um total de 6 pontos de tempo). O princípio-chave desse protocolo é que cada ponto de tempo corresponde a um único filtro Sterivex (daqui em diante chamado de filtro PVDF de 0,45 μm). Para coletar uma amostra, a cultura dentro do filtro é retirada centrifugando-a de cabeça para baixo, o número da célula é quantificado e o filtro é descartado. Cada filtro PVDF de 0,45 μm gera apenas uma amostra. A preparação do experimento requer a definição de três parâmetros experimentais-chave: a vazão da bomba peristáltica, a duração do experimento e o número desejado de amostras (ou seja, o número de filtros PVDF de 0,45 μm). Defina a vazão inicial para 2 mL/min. Ajuste esse parâmetro conforme necessário (por exemplo, aumentar a vazão para manter o suprimento de um nutriente muito diluído).

1. Preparação do meio e dos materiais
   NOTA: Como cada filtro corresponde a uma única amostra de ponto temporal, o tempo de execução experimental de cada filtro PVDF de 0,45 μm varia dependendo do tempo de coleta (por exemplo, 2 h para o primeiro ponto de tempo, 4 h para o segundo ponto de tempo, e assim por diante).
   1. Estime o volume necessário de meio de cultura usando a fórmula
      ,
      onde n é o número de amostras (filtros PVDF de 0,45 μm), Q é a vazão (em mL/min) e t_i é o tempo de execução experimental (em minutos) para cada amostra.
   2. Multiplique por 1,2 para incluir um volume adicional de 20% para considerar a variação da taxa de fluxo. Para este exemplo, calcule
      
   3. Arredonda o volume calculado para cima (por exemplo, prepare 6.200 mL neste exemplo).
   4. Prepare material para esterilização ( veja a Tabela 1).
      NOTA: Prepare e esterilize os materiais no dia anterior ao experimento para garantir a prontidão e minimizar atrasos. Autoclave desses materiais, exceto as válvulas Luer unidirecionais; Esterilize as válvulas com 70% de etanol.
      1. Conecte ambas as extremidades de seis tubos peristálticos de silicone a conexões plásticas "Male Luer to Barb" inserindo a extremidade Barb da conexão no tubo. Cubra as extremidades do Luer macho com papel alumínio para evitar contaminação.
         NOTA: Seis tubos peristálticos são preparados porque o experimento utiliza seis filtros PVDF de 0,45 μm. Todos os tubos serão posteriormente montados na mesma cabeça peristáltica da bomba para que todos os filtros recebam fluxo idêntico.
      2. Coloque o tubo dentro de um recipiente fechado e esterilizável.
      3. Coloque os filtros de ventilação dentro de um recipiente fechado e esterilizável.
      4. Coloque as tampas em tubo com tubos de silicone que passam pelas tampas dentro de um recipiente fechado e esterilizável.
         NOTA: As tampas de garrafa tubuladas usadas neste protocolo são equipadas com três tubos que atravessam as tampas: dois tubos de diâmetro igual para fornecer o meio aos filtros PVDF de 0,45 μm, e um terceiro tubo com diâmetro maior. Esses tubos são fixados firmemente às tampas e não podem ser removidos.
      5. Submerga 12 válvulas de retorno Luer unidirecionais em uma solução de etanol a 70% e deixe-as durante a noite para esterilizar.
         NOTA: (PONTO DE PAUSA) Materiais esterilizados podem ser armazenados submersos e selados em temperatura ambiente por até 24 horas antes do experimento. Antes do uso, remova as válvulas do etanol e enxágue com água ultrapura estéril para remover o etanol residual. Alternativamente, as válvulas de retenção podem ser impressas em 3D usando materiais autoclaváveis para permitir a esterilização por autoclave em vez de tratamento com etanol.
   5. Autoclave do tubo peristáltico, filtros de ventilação, tampas de garrafa, cilindro graduado e garrafas usando configurações padrão de laboratório.
   6. Prepare 6.200 mL de meio de baixa riqueza definida (RDM; veja Tabela de Materiais) misturando os reagentes listados na Tabela 2.
      NOTA: Prepare o meio no dia do experimento, durante o período de espera de aproximadamente 5 horas após o início da pré-cultura (veja o passo 1.2.1). Isso preserva a frescura média e minimiza o risco de contaminação.
2. Preparação de uma pré-cultura bacteriana
   NOTA: Use uma pré-cultura na fase exponencial para iniciar o experimento. Durante essa fase, as bactérias crescem em ritmo constante, sintetizando constituintes celulares de forma equilibrada e se dividindo em uma massa celular definida. Use células de fase exponencial para minimizar a variabilidade e padronizar o estado fisiológico inicial.
   1. No dia anterior ao experimento, prepare uma cultura (ON) durante a noite da seguinte forma: inocule 3 mL de MDR completo com um estoque congelado de glicerol de E. coli NCM3722 em um tubo estéril de cultura de 15 mL. Incube a cultura durante a noite (~16 h) a 37 °C, com agitação a 200 rpm em um incubador agitado.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) Uma vez que a cultura ON está na incubadora, não há mais passos neste dia. Retome o protocolo no dia seguinte seguindo para a etapa 1.2.2.
   2. No dia do experimento, prepare a pré-cultura da seguinte forma: Adicione 6 μL de cultura de ON a 6 mL de RDM completo. Divida igualmente em dois tubos de cultura de 15 mL e rotule os tubos como A e B. Incube ambos os tubos a 37 °C com agitação a 200 rpm.
      NOTA: A pré-cultura normalmente requer aproximadamente 5 horas para atingir a fase exponencial (OD₆₀₀ ≈ 0,5). Use esse período para preparar o meio fresco (veja o passo 1.1.6). Não prossiga para o passo 1.2.3 até que o OD₆₀₀ atinja aproximadamente 0,5.
   3. Monitore a densidade óptica (OD) a 600 nm usando o tubo B. Prossiga com o experimento quando o OD₆₀₀ atingir aproximadamente 0,5, indicando crescimento exponencial em RDM total para E. coli NCM3722 (veja a seção 1.4).
      NOTA: Inicie o experimento com células de fase exponencial para melhorar a reprodutibilidade e padronizar as condições iniciais.
3. Preparação de um experimento no MCCD com condições nutritivas constantes
   NOTA: Realize os passos 1.3.1 a 1.3.5 dentro de um gabinete de biossegurança estéril imediatamente após o pré-cultivo começar a crescer.
   1. Aloque o volume médio total para cada garrafa.
      NOTA: Use as garrafas como reservatórios médios. Use tampas de garrafa equipadas com dois tubos de entrega média, cada tubo fornecendo meio a um filtro PVDF de 0,45 μm. Aloque o volume total do meio (preparado na etapa 1.1.6) entre as garrafas com base na quantidade necessária por cada amostra em ponto de tempo (ou seja, cada filtro PVDF de 0,45 μm) ao longo do experimento.
      1. Use a fórmula fornecida no passo 1.1.1 para determinar o volume de meio necessário para cada filtro PVDF de 0,45 μm. Por exemplo, usando os seguintes termos:
         
         Os volumes médios totais necessários para cada ponto de tempo, em ordem cronológica, são 288, 576, 864, 1152, 1440 e 1728 mL.
      2. Distribua os volumes médios calculados entre as garrafas, agrupando os volumes necessários para dois pontos de tempo em uma única garrafa. Por exemplo: ~900 mL em uma garrafa de 1 L (para os pontos de tempo 1 e 2), ~2.100 mL em uma garrafa de 2,5 L (para os pontos de tempo 3 e 4), ~3200 mL do meio em uma garrafa de 4 L (para os pontos de tempo 5 e 6).
   2. Fele cada garrafa com tampas tubulares (Figura 1C). Aperte as tampas com segurança para evitar vazamentos.
   3. Conecte um filtro de ventilação de 0,2 μm ao tubo de silicone mais largo que se estende a partir da tampa da garrafa tubular (Figura 1C). Isso permite a troca de ar estéril durante o experimento.
   4. Conecte uma extremidade de cada tubo peristáltico (com as conexões já fixadas; veja a seção 1.1.4 sobre preparação do material) aos tubos de silicone de menor diâmetro que se estendem das tampas tubuladas (Figura 1C). Garanta conexões seguras para manter a esterilidade. Deixe a tampa de papel alumínio no encaixe livre do Luer macho no lugar até o experimento começar para evitar contaminação.
   5. Coloque as garrafas com o tubo montado e a bomba peristáltica em uma incubadora ajustada a 37 °C. Fixe o tubo nos canais da cabeça da bomba peristáltica.
      NOTA: Todos os tubos peristálticos são montados na mesma cabeça de bomba de uma única bomba peristáltica, de modo que todos os filtros PVDF de 0,45 μm recebem meio da mesma bomba. Usar uma única bomba garante que a vazão seja idêntica entre os filtros e previne variabilidade que possa surgir das diferenças entre as bombas.
4. Protocolo de um experimento no MCCD com condições nutritivas constantes
   1. Dilua a pré-cultura (OD = 0,5) 1:10 adicionando 600 μL de pré-cultura a 5,4 mL de RDM baixo fresco.
   2. Usando uma pipeta de 1 mL, introduza 1 mL da pré-cultura diluída em cada um dos seis filtros PVDF de 0,45 μm.
   3. Enxágue as válvulas de retenção unidirecionais com água ultrapura autoclavada e conecte uma em cada extremidade de cada filtro PVDF de 0,45 μm.
   4. Remova as tampas de papel alumínio das conexões peristálticas dos tubos.
   5. Conecte cada um dos seis filtros PVDF de 0,45 μm a uma conexão Male Luer no tubo peristáltico (Figura 1C).
   6. Ajuste a vazão para 2 mL/min na bomba peristáltica e inicie o fluxo. Defina esse momento como tempo 0.
   7. Coloque um recipiente de resíduos abaixo dos filtros PVDF de 0,45 μm para coletar o fluxo de saída.
      NOTA: A Figura 2A mostra a montagem completa do experimento dentro da caixa da incubadora.
5. Coleta de amostras
   1. Após 2 horas, desconecte um dos dois filtros PVDF de 0,45 μm conectados à garrafa de 1 L.
   2. Desrosqueie as válvulas de retenção unidirecionais e coloque o filtro PVDF de 0,45 μm em um tubo centrífugo de 50 mL com a entrada voltada para baixo.
   3. Centrifuge o tubo da centrífuga contendo o filtro PVDF de 0,45 μm a 2.000 × g por 2 min.
   4. Usando um cortador de tubo, aplique uma pressão suave na carcaça plástica na extremidade mais próxima da saída para abrir o filtro PVDF de 0,45 μm.
      NOTA: Desinfete o cortador de tubos antes do uso (por exemplo, limpando com 70% de etanol) para evitar contaminação ao abrir o filtro PVDF de 0,45 μm.
   5. Libere o cilindro interno que contém a membrana porosa e descarte a seção do filtro que segura a membrana.
   6. Enxágue as paredes internas da carcaça do filtro PVDF de 0,45 μm (aquelas perpendiculares à direção do fluxo) com o meio de cultivo coletado no tubo da centrífuga.
      NOTA: Esta etapa garante que quaisquer células presas nas paredes durante a centrifugação sejam coletadas.
   7. Meça o volume total coletado usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
   8. Nos pontos de tempo subsequentes (4 h, 6 h, 8 h, 10 h e 12 h), desconecte os filtros PVDF correspondentes de 0,45 μm e repita os passos 1.5.2–1.5.6. Siga esta ordem específica:
      1. Às 4 horas, desligue o segundo filtro PVDF de 0,45 μm conectado à garrafa de 1 L.
      2. Às 6 h e 8 h, desconecte os filtros PVDF de 0,45 μm conectados à garrafa de 2,5 L.
      3. Às 10 e 12 horas, desligue os filtros PVDF de 0,45 μm conectados à garrafa de 4 L.
         NOTA: Siga esta ordem para alinhar os pontos de tempo de amostragem aos volumes médios distribuídos na etapa 1.3.1.
6. Análises a jusante
   1. Pegue três alíquotas de 100 μL de cada amostra e fixe com glutaraldeído até uma concentração final de 1,5%.
      ATENÇÃO: O glutaraldeído é tóxico, um irritante forte e um possível sensibilizador. Manuse-se dentro de uma capela química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas de nitrilo e óculos de proteção). Evite contato com a pele e a inalação. Descartar resíduos contendo glutaraldeído conforme as regulamentações institucionais de resíduos químicos perigosos.
   2. Use as amostras fixas para contar o número de células por microlitro com citometria de fluxo após a marcação com um corante fluorescente de DNA.
      ATENÇÃO: Corantes fluorescentes de DNA podem ser mutagenos. Use luvas e descarte resíduos contendo corantes conforme as regulamentações institucionais de biossegurança.
      NOTA: Como alternativa à coloração de DNA e citometria de fluxo, as densidades celulares podem ser estimadas ao revestir um pequeno volume da amostra em placas de ágar de meio rico (por exemplo, LB agar) e contar unidades formadoras de colônias (CFUs).
   3. Multiplique o número de células por microlitro pelo volume total medido no passo 1.5.7 para calcular o número total de células contidas no filtro PVDF de 0,45 μm.
   4. Centrifuge o volume restante em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a 10.000 × g por 4 minutos.
   5. Remova o sobrenadante.
   6. Armazene os pellets de células a -80 °C para análises futuras (por exemplo, transcriptômica).

Figura 2: Montagem experimental do MCCD. (A) Fotografia do setup MCCD para condições constantes de nutrientes. O sistema é alojado em uma caixa incubadora para manter uma temperatura constante, com um recipiente de resíduos coletando o meio de fluxo. (B) Fotografia da configuração MCCD para condições nutricionais flutuantes. A garrafa rotulada com fita vermelha contém um meio de alta concentração de nutrientes (C_Alto), enquanto o frasco rotulado com fita azul contém um meio de baixa concentração de nutrientes (C_Baixo). A plataforma metálica no centro sustenta os componentes que controlam as flutuações de nutrientes, correspondentes aos descritos na Figura 1D. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Crescimento bacteriano em condições de nutrientes flutuantes

1. Montagem de um controlador para uma válvula solenóide
   NOTA: Controle a válvula solenóide de três vias usando um circuito de comutação baseado em microcontrolador conectado a um computador que roda uma interface gráfica personalizada (GUI) desenvolvida no MATLAB.
   1. Monte o circuito de controle da válvula solenoide (Figura 3A).
      1. Conecte um pino de saída digital do microcontrolador à base de um transistor NPN por meio de um resistor de 1 kΩ.
      2. Conecte o coletor do transistor ao terminal negativo da válvula solenóide.
      3. Conecte o emissor do transistor ao terra.
      4. Conecte o terminal positivo da válvula solenóide a uma fonte de alimentação DC externa compatível com a tensão da válvula.
      5. Coloque um diodo sobre os terminais do solenóide. Conecte o lado listrado do diodo à linha de alimentação positiva.
         NOTA: O diodo suprime picos de tensão gerados quando o solenóide é desligado.
   2. Conecte conexões plásticas "rosqueadas para a espiga de mangueira" nas válvulas solenoides, garantindo que a extremidade da espiga se estenda para fora.
   3. Instale o MATLAB R2022b ou versões posteriores em um computador com conectividade USB.
   4. Instale o pacote de suporte MATLAB necessário para comunicação serial com hardware de microcontrolador.
   5. Conecte a placa do microcontrolador ao computador usando um cabo USB para estabelecer a comunicação serial.
   6. Abra a interface gráfica baseada em MATLAB usada para gerar condições nutritivas flutuantes no MCCD (disponível no link https://github.com/juanitaLara/MCCD).
   7. Verifique a conexão entre as válvulas solenóides e a plataforma GUI do MATLAB:
      1. Abra a plataforma GUI no Matlab e clique no botão Conectar (Figura 3B). Espere até que a mensagem que o Controlador conectou apareça com sucesso na janela de comando.
      2. Insira um valor para o passo de tempo (por exemplo, 5 s para as fases Alta e Baixa) no painel de Operação Automatizada .
      3. Observe as válvulas solenóides e ouça o som de clique que elas produzem ao alternar entre os dois meios.
      4. Usando um relógio, confirme que as válvulas solenóides comutam exatamente no intervalo especificado (por exemplo, a cada 5 segundos).
         NOTA: Realize essa verificação antes de cada experimento para confirmar a comunicação e a comutação correta das válvulas. (PONTO DE PAUSA) Após verificar o funcionamento da válvula solenóide, o sistema pode permanecer montado dentro da incubadora por várias horas antes de iniciar o experimento.
2. Preparação de mídias e materiais
   NOTA: Este protocolo envolve alternar condições nutricionais entre RDM baixo e alto com um período de 1 h (30 min em RDM alto seguido de 30 min em RDM baixo). O experimento ocorre por três horas de flutuações, com duas amostras coletadas: (1) Às 3 h 1 min (fase RDM alta, imediatamente após a troca de baixa para alta) e (2) a 3 h 31 min (fase RDM baixa, imediatamente após a troca de alta para baixa).
   1. Estimar os volumes necessários de meios culturais por fases experimentais.
      1. Primeiro, calcule os volumes necessários para as primeiras 3 horas (três períodos completos de flutuação):
         baixo volume RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtros PVDF de 0,45 μm] = 432[mL]
         alto volume RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtros PVDF de 0,45 μm] = 432[mL]
      2. Calcule o volume necessário para a fase final de 30 minutos:
         alto volume RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[filtros PVDF de 0,45 μm] = 72[mL]
      3. Arredondar os volumes para valores convenientes (por exemplo, 500 mL de RDM baixo e 600 mL de RDM alto).
   2. Prepare os materiais para esterilização por autoclave ( veja a Tabela 3) seguindo os passos 1.1.4 – 1.1.5.
      NOTA: Prepare e esterilize os materiais no dia anterior ao experimento para garantir a prontidão e minimizar atrasos no dia do experimento (etapas 2.2.3 e 2.2.4). Esse montagem, em comparação com os experimentos de nutrientes constantes, requer tubos adicionais para conectar as garrafas de mídia diretamente à válvula solenóide (Figura 1B,D). Esses tubos requerem apenas uma conexão "Barb para Luer macho", pois as conexões da válvula solenóide são pré-montadas. Cubra as extremidades desses tubos com papel alumínio antes de autoclavar.
   3. Esterilize o tubo peristáltico preparado, os filtros de ventilação, as tampas, o cilindro graduado e as garrafas em um autoclave.
   4. Submerga 4 válvulas de retenção Luer unidirecionais em uma solução de etanol a 70% e deixe-as durante a noite para esterilizar.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) Válvulas de retenção esterilizadas podem permanecer submersas em etanol durante a noite e armazenadas seladas em temperatura ambiente por até 24 horas. Antes do uso, enxágue as válvulas com água Milli-Q estéril.
   5. Limpe e esterilize as válvulas solenóides lavando-as com etanol a 70% 3–5 vezes, seguidas de água ultrapura 3–5 vezes.
   6. No dia do experimento, durante o período de espera de aproximadamente 5 horas após a preparação pré-cultura (veja passo 2.3), prepare 500 mL de RDM baixo e 600 mL de RDM alto misturando os reagentes listados na Tabela 4.
      NOTA: Preparar a mídia no dia do experimento garante frescura e minimiza os riscos de contaminação.
3. Preparação de uma pré-cultura bacteriana
   1. Siga os passos descritos na etapa 1.2.
4. Preparação de um experimento no MCCD com condições de nutrientes flutuantes
   NOTA: Realize os passos 2.4.1–2.4.4 dentro de um gabinete de biossegurança estéril imediatamente após o pré-cultivo começar a crescer.
   1. Coloque cada médio em um frasco de 1 L.
   2. Sele as garrafas com tampas pré-montadas equipadas com três portas e tubos de silicone pré-instalados. Aperte as tampas com segurança para evitar vazamentos.
   3. Conecte um filtro de ventilação de 0,2 μm ao tubo largo de silicone que se estende de uma das portas de cada tampa de garrafa.
   4. Conecte o "tubo de entrada" (mostrado na Figura 1D) aos tubos de silicone que se estendem das tampas tubuladas antes de conectá-lo às válvulas solenoides:
      1. Prenda uma extremidade do tubo de silicone (com apenas um encaixe acoplado) ao tubo que se estende a partir da tampa baixa da garrafa RDM.
      2. Deixe a tampa de papel alumínio no encaixe livre do Luer Male até que as garrafas sejam levadas para a incubadora para evitar contaminação.
      3. Repita o passo 2.4.4.1 para a garrafa de alto RDM.
   5. Coloque as garrafas com seu "tubo de entrada" montado, a bomba peristáltica e as válvulas solenoides com o controlador dentro de uma incubadora ajustada para 37 °C.
   6. Conecte o "tubo de entrada" (fixado no passo 2.4.4) às entradas das válvulas solenoides da seguinte forma:
      1. Conecte os dois tubos da garrafa de baixo RDM a uma das duas entradas de cada válvula solenoide (tubos rotulados com fita azul na Figura 1D).
      2. Conecte os dois tubos da garrafa de alta frequência diária a uma das duas entradas de cada válvula solenoide (tubos rotulados com fita vermelha na Figura 1D).
   7. Conecte um tubo de silicone compatível com bomba peristáltica (com apenas uma conexão) à saída de cada válvula solenoide (Figura 1D). Deixe a tampa de papel alumínio no encaixe livre do Luer macho até que o experimento comece a manter a esterilidade.
5. Protocolo de um experimento no MCCD com condições de nutrientes flutuantes
   1. Verifique a conexão entre as válvulas solenoides e o software Matlab realizando a etapa 2.1.7.
   2. Insira os valores desejados de passos de tempo para as flutuações na plataforma GUI do Matlab: insira passos de tempo de 1800 s em RDM Alto (30 min) e 1800 s em RDM Baixo (30 min).
   3. Selecione Baixo no menu Start para começar na condição Low RDM (Figura 3).
   4. Seme os dois filtros PVDF de 0,45 μm conforme descrito no passo 1.4.
   5. Comece o experimento.
      NOTA: A Figura 2B mostra o conjunto fluídico completo deste experimento.
6. Coleta de amostras
   1. Colete amostras conforme na etapa 1.5. Colhe o primeiro filtro PVDF de 0,45 μm em 3 h 1 min e o segundo em 3 h 31 min.
      NOTA: Desconecte qualquer um dos filtros primeiro; ambos os filtros são alimentados pelo mesmo meio.
7. Análises a jusante
   1. Siga os passos descritos na etapa 1.6 para contar o número de células por meio da citometria de fluxo e processar e armazenar amostras para análises posteriores (por exemplo, transcriptômica).

Figura 3: Controlador das válvulas solenóides para impor flutuações de nutrientes. (A) Diagrama de fiação do circuito eletrônico usado para controlar a válvula solenoide. O circuito consiste em uma placa microcontroladora, um transistor usado como elemento de comutação, um resistor conectado à base do transistor e um diodo flyback colocado sobre a válvula solenóide para proteger o circuito dos picos de tensão gerados durante a comutação da válvula. O microcontrolador controla o transistor, que por sua vez troca a energia fornecida para a válvula solenoide. Adaptado com permissão da referência ²⁰ . (B) Após conectar a placa do microcontrolador tanto ao computador que executa a interface gráfica quanto a uma fonte de energia com a voltagem exigida pelas válvulas solenoides, a comunicação é estabelecida clicando no botão Conectar . As válvulas podem ser operadas manualmente usando o painel de Operação Manual , onde o usuário seleciona o meio a ser voado (por exemplo, "Alto" ou "Baixo"). Alternativamente, o painel de Operação Automatizada permite que o usuário especifique o meio inicial e os passos de tempo (em segundos) para cada fase (Alto e Baixo), e inicie a operação clicando no botão Iniciar . O Monitor em Tempo Real exibe uma função de escalões (0 = Baixo, 1 = Alto) ao longo do tempo, indicando qual meio estava passando pelas válvulas solenóides até os filtros nos segundos anteriores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Neste estudo, usamos o MCCD para quantificar a taxa de crescimento da E. coli NCM3722 sob condições constantes de baixo nutriente em três concentrações de RDM. Essas concentrações foram derivadas da fórmula do meio rico definido (RDM) descrita por^{Neidhardt 19}, com os suplementos de aminoácidos e nucleobases diluídos para 0,5%, 0,25% e 0,01% da formulação original, respectivamente.

Experimentos de crescimento replicado foram rea...

Discussão

Métodos de cultivo bacteriano que capturam a complexidade nutricional dos ambientes naturais são essenciais para avançar o estudo da fisiologia microbiana além das condições laboratoriais simplificadas. Ecossistemas naturais contêm misturas de nutrientes que abrangem uma ampla faixa de concentração, que frequentemente não suportam taxas máximas de crescimento 1,3,4,21,22,23.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1K Ohm Resistor	BC Robotics	ELC-021	Power Rating: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A
3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubing	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatible with peristaltic pump used
3-way Solenoid valves	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminum foil			Suitable for autoclaving
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottles	Nalgene	2162-0531	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cap closure with three ports – for 4 L bottle	Nalgene	2162-0830	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge that fits 50 mL Falcon tubes
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Centrifuge that fits 1.5 and 2 mL eppendorf tubes
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon tube
Culture tubes (14 mL, sterile)	Greiner bio-one		Culture tubes
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Dilute to 70%
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Graduated cylinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	Or different company
Incubator box			Custom-built incubator box – contact corresponding authors for construction details
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Available at Darwin Microfluidics
Male Luer-to-barb fitting	Aldrich	Z277142	Male Luer-to-barb adapter compatible with 0.8 mm ID tubing (see Figure 1C)
Male Luer-to-threaded fitting	Aldrich	Z277142	Used to connect the solenoid valve to the "inlet tubing" (see Figure 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b or later	Software to run the custom-made software for the solenoid valves
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS medium for Enterobacteria
One-way Luer check valve	Masterflex	30505-92	Prevents backflow into medium reservoirs
Pipe cutter - 0-37 mm	KS Tools	2222051	Or different company
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 in	Nalgene	8060-0020	Inner diameter 1/16 in (1.6 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 in	Nalgene	8060-0030	Inner diameter 1/8 in (3.2 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Polypropylene copolymer bottle - 1 L	Nalgene	2126-1000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 2 L	Nalgene	2126-2000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 4 L	Nalgene	2126-4000	Or different company
Serological pipette - 5 mL	Corning	CLS4487	Or different company
Solderless Breadboard	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563	Nucleic acid stain for cell counting in flow cytometer
TIP120 Darlington Transistor	BC Robotics	TRN-005
Tubes - 1.5 mL	Eppendorf	3810X	Tubes for centrifuging cell cultures and storing pellets
Vent filter	Millex	SLFG05000	0.2 µm hydrophobic vent filter
Waste receptacle			Volume capacity should be at least the total media volume to be used in the experiment