Desenvolvimento de um Modelo de Fusão Intersocorporal Caudal de Rato: Um Estudo Piloto de Viabilidade

Resumo

Este estudo demonstrou a viabilidade técnica de um modelo piloto de fusão intercorporal caudal com rato-piloto usando fixação de gaiola posterior e placa. A análise histomorfométrica às 12 semanas confirmou a formação contínua de pontes ósseas e padrões distintos de maturação óssea intra-gaiola. Esse modelo técnico serve como base preliminar para futuros estudos em grande escala.

Resumo

As vértebras caudais de rato são amplamente utilizadas em pesquisas sobre regeneração óssea e fusão espinhal como locais convenientes para testar materiais de enxertos ósseos e implantes. Modelos anteriores de fusão de rabo de rato alcançaram fusão intervertebral por meio da remoção de discos e enxerto ósseo, ou com dispositivos de fixação externos. No entanto, nenhum modelo de pequeno animal foi desenvolvido que utilize uma gaiola de fusão intersomática análoga à utilizada clinicamente. Foi hipotetizado que um ambiente de fusão óssea valorável poderia ser estabelecido sem complicações neurológicas, realizando uma inserção posterior da gaiola que imita procedimentos clínicos, complementados com fixação de placas, nas vértebras caudais do rato. Este estudo piloto preliminar (n = 1) foi projetado para avaliar a viabilidade técnica. Foi desenvolvida uma abordagem cirúrgica na qual uma gaiola miniaturizada de titânio foi inserida com precisão no espaço do disco ressecado entre as vértebras caudais adjacentes, espelhando de perto o procedimento cirúrgico humano. O titânio foi selecionado para a gaiola devido ao seu amplo uso clínico e biocompatibilidade. Os resultados iniciais demonstraram a viabilidade técnica dessa abordagem. A gaiola implantada manteve a altura do disco e o alinhamento da coluna. Foi observado crescimento ósseo progressivo através da gaiola, culminando em confirmação de uma ponte contínua óssea através do espaço intervertebral até 12 semanas após a operação. A presença de estrutura trabecular contínua e a ausência de tecido fibroso intermediário foram confirmadas radiologicamente e histologicamente. No geral, este modelo de fusão de rabo de rato baseado em gaiolas oferece uma plataforma promissora para avaliar novos biomateriais e investigar mecanismos de fusão óssea intervertebral. No entanto, a ausência de um grupo controle e de uma análise estatística, devido ao desenho de um único sujeito, limita a generalização desses achados e exige validação adicional.

Introdução

A fusão intersombóloga é um tratamento cirúrgico estabelecido para vários distúrbios da coluna, incluindo instabilidade, espondilolistese e doenças degenerativas; Notavelmente, evoluiu ao longo de aproximadamente 70 anos como um procedimento^{padrão 1,2}. O procedimento envolve a remoção do disco intervertebral e a inserção de uma gaiola ou enxerto ósseo para promover a fusão sólida entre vértebras^{adjacentes 3,4}. Além disso, adicionar instrumentação posterior com gaiolas reduz as taxas de pseudartrose e amplia suas indicações^{clínicas 5}. No entanto, complicações como pseudartrose e subsidência da gaiola continuam sendo desafios clínicos significativos, exigindo o desenvolvimento confiável de modelos pré-clínicos para avaliar novos materiais e fatores promotores^{da fusão 6,7}.

Ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre fusão espinhal devido à sua viabilidade econômica, rápida reprodução, cicatrização rápida e facilidade de^{manuseio 8,9}. No entanto, os modelos existentes de fusão intercorporal de ratos apresentam limitações significativas. Especificamente, a abordagem de fusão intersomática lombar anterior (ALIF) em ratos requer manipulação importante de vasos e órgãos abdominais, resultando em alta invasividade cirúrgica e riscos substanciais de^{complicações 10,11}. A abordagem de fusão intersomática lombar posterior (PLIF) envolve um risco inevitável de lesão neurológica devido aos canais espinais e elementos neurais extremamente pequenos, tornando a retração neural quase^{impossível 12}. Consequentemente, a maioria dos estudos com ratos se limitou à fusão posterolateral (PLF), que estruturalmente falha em investigar os mecanismos da fusão óssea dentro da gaiola, um aspecto crítico em ambientes^{clínicos 13}. Além disso, embora existam modelos caudais, eles carecem de um sistema de avaliação que integre uma gaiola intersomática semelhante à clínica com fixação da placa posterior.

A coluna caudal dos ratos oferece vantagens únicas na pesquisa de fusão intersomitária. Os discos caudais apresentam fortes semelhanças geométricas, composicionais e mecânicas com os discos lombares humanos, tornando-os cada vez mais populares em pesquisas^{discais 14,15}. Além disso, a cirurgia da coluna caudal proporciona fácil acesso cirúrgico, custo-benefício e recuperação pós-operatória rápida em comparação com as abordagens^lombares. No entanto, até o momento, nenhum estudo relatou bem-sucedido a inserção posterior da gaiola na coluna caudal do rato, com uma avaliação histológica detalhada da formação óssea dentro e ao redor da gaiola.

A avaliação histológica, especialmente da histomorfometria óssea não calcificada, permanece como o padrão ouro para avaliar osseointegração e fusão^{óssea 17,18}. Especificamente, permite a análise quantitativa de parâmetros críticos da formação óssea, incluindo volume/volume do tecido ósseo (BV/TV), número trabecular e espessura trabecular, ao mesmo tempo em que possibilita avaliação qualitativa da maturidade óssea ao distinguir tecido do osso^{lamelar 19,20}. Uma avaliação histomorfométrica tão detalhada pode revelar os padrões de osteocondução espacial e temporal dentro da gaiola e nas interfaces gaiola-vértebras ^21,22. No entanto, falta uma avaliação histomorfométrica abrangente da osteocondução em gaiola em modelos de ratos.

Este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo piloto de fusão caudal intercorporal com rato, utilizando inserção posterior da gaiola e fixação suplementar de placas para demonstrar sua viabilidade técnica. Este estudo apresenta uma técnica cirúrgica detalhada e uma avaliação histológica abrangente da formação óssea dentro da gaiola e nas interfaces das placas finais vertebrais. Foi hipotetizado que um ambiente de fusão óssea valorável poderia ser estabelecido sem complicações neurológicas, realizando uma inserção posterior da gaiola que imita procedimentos clínicos, complementados com fixação de placas, nas vértebras caudais do rato. Esse modelo fornece uma plataforma eficiente para avaliar materiais de fusão intersomática e, na literatura existente, representa uma exploração técnica inicial da colocação bem-sucedida da gaiola posterior usando avaliação histomorfométrica da osteocondução em um modelo de ratos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Jikei (número de aprovação 2023–034C1). Este estudo foi projetado como um estudo piloto de viabilidade. Para avaliar a viabilidade técnica dessa inserção posterior altamente delicada e inovadora na coluna caudal do rato antes da validação em larga escala, um único animal (n = 1) foi utilizado, conforme as diretrizes éticas, para minimizar o uso animal durante a avaliação técnica inicial. Ratos machos de Sprague-Dawley (SD) foram selecionados como cepa padrão para pesquisas sobre fusão espinhal. Os critérios de inclusão foram machos saudáveis de 8 a 10 semanas, pesando entre 200 e 250 g, para garantir que a altura do disco intervertebral (1,8–2,2 mm) seja compatível com a gaiola de 2 mm. Animais que apresentaram > perda de peso de 10% durante o período de aclimatação, diminuição da atividade ou deformidades visíveis na cauda foram excluídos. Para este estudo, um rato macho de Sprague–Dawley (8 semanas, pesando 221,8 g; Japão SLC, Shizuoka, Japão) foi utilizada. O animal foi alojado em um ambiente controlado a 25°C e umidade relativa de 50% (faixa permitida de 30–70%), com um ciclo de 12 horas de luz/escuro, e recebeu acesso ad libitum à água e uma dieta padrão para roedores. Os ratos eram alojados em gaiolas de fundo sólido, equipadas com materiais para ninho e varas para enriquecimento ambiental. Foi implementado um período de aclimatação de 3 dias antes do procedimento cirúrgico. Para evitar que os companheiros de gaiola roessem os implantes da cauda, o rato foi mantido sob condições de alojamento único durante todo o estudo, o que foi um fator crítico nesse desenho experimental.

Preparação de parafusos e placas

Materiais de fixação interna foram preparados antes do procedimento cirúrgico. Parafusos de aço inoxidável comercialmente disponíveis (diâmetro original: 1,2 mm, comprimento: 14 mm) foram cortados para um comprimento preciso de 6 mm usando um alicate (Figura 1A). Esses parafusos eram esterilizados por autoclave a vapor padrão a 121 °C por 20 minutos. Em uma placa interna de fixação de polioximetileno (POM) (18 mm de comprimento, 3 mm de largura, 1 mm de espessura), furos de parafuso com diâmetro de 1,2 mm foram perfurados em intervalos de 12 mm usando uma furadeira manual (Figura 1B–D). Subsequentemente, os cantos das placas POM foram arredondados usando um alicate de arame para minimizar a irritação dos tecidos moles ao redor (Figura 1E). As placas foram esterilizadas usando gás óxido de etileno (EtO) ou plasma gasoso de peróxido de hidrogênio, dada a sensibilidade térmica do polímero. A gaiola de titânio apresenta uma estrutura de treliça interligada com canais longitudinais medindo de 300 a 500 μm de diâmetro. Sua superfície foi preparada usando a Tecnologia Lamelar 3D de Titânio para alcançar uma rugosidade microsuperficial de 3–5 μm, o que facilita o crescimento ósseo direto.

Anestesia e procedimento cirúrgico

Não foi realizado jejum pré-operatório para evitar estresse metabólico desnecessário. A anestesia foi induzida por meio de uma mistura tripla de anestesia composta por medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) e butorfanol (2,5 mg/kg), administrada por injeção subcutânea no dorso usando uma agulha²³ calibre 25. O plano cirúrgico adequado de anestesia foi avaliado a cada 15 minutos, confirmando a perda do reflexo de retirada do pedal (beliscão do dedo), mantendo as membranas mucosas rosadas e monitorando a frequência respiratória (70–110 respirações/min). Posteriormente, foi realizado o procedimento cirúrgico para fusão intercorporal das vértebras caudais. O animal foi colocado em posição deitada (Figura 2A), e toda a cauda foi desinfetada seguindo um protocolo de esfregado alternado em três rodadas (70% etanol, esfoliação povidona-iodo e 70% etanol) para garantir um campo estéril. Para identificar as vértebras-alvo, foi realizada a palpação manual começando pelo sacro distalmente. A primeira articulação móvel foi identificada como a junção sacro-CO1, e o segmento imediatamente distal foi designado como Co2, definindo o local alvo Co2–Co3. Foi feita uma incisão longitudinal de aproximadamente 2 cm na face dorsal, abrangendo da segunda à terceira vértebra caudal (Co2–Co3) (Figura 2B), para expor a face posterior de cada vértebra. Durante a exposição, foi tomado cuidado para identificar e evitar danos à veia caudal dorsal; Dissecação contusa e eletrocauterização bipolar foram usadas para controlar sangramentos leves. Para preparar o local da fusão, o anel fibroso entre as vértebras de CO2 e CO3 foi inciso com um bisturi (Figura 2C). O anel fibroso e o núcleo pulposo foram então removidos meticulosamente por curetagem usando uma cureta e pequenas pinças (Figura 2D). Essa etapa foi realizada sob ampliação cirúrgica de alta potência (≥3,5x). A completude da remoção foi objetivamente definida pela confirmação visual do sangramento pontuado (o sinal do "placas finais sangrento") e pela total ausência de tecido mole residual. Dano inaceitável na placa final foi definido como erosões profundas envolvendo > 25% da área total ou penetração no osso esponjoso > 0,5 mm. Uma gaiola de titânio (seção transversal de 2 × 2 mm, 2 mm de altura) (Figura 2E) foi posteriormente inserida profundamente no espaço intervertebral até que um parado físico fosse atingido e o contato total da superfície com ambas as placas finais fosse confirmado visualmente, criando um encaixe firme de interferência (Figura 2F, 2G).

Fixação e fechamento de feridas

Para facilitar a fixação das placas, a superfície óssea ao redor dos sítios designados dos orifícios nas vértebras de CO2 e CO3 foi achatada usando um roteador elétrico portátil operando a 7.800 RPM, equipado com uma rebarba esférica do tipo lima de 2,0 mm (Figura 2H). Furos de osso eram perfurados individualmente em intervalos correspondentes aos furos de parafuso da placa de fixação interna de plástico, usando uma furadeira manual equipada com uma broca de 1,2 mm de diâmetro (Figura 2I). Dois parafusos de aço inoxidável de 6 mm foram então pré-carregados nos furos. da placa plástica (Figura 2J). Os parafusos eram inseridos em um ângulo de 90° até uma profundidade padronizada de 5 mm com espaçamento centro-centro de 12 mm (Figura 2K). Por fim, a incisão cutânea foi fechada com pontos de nylon 4-0, e a cauda foi desinfetada novamente com etanol a 70% para completar o procedimento.

Manejo pós-operatório e eutanásia

Durante a fase imediata de recuperação (Dia 0), o animal foi monitorado a cada 15 minutos, e a temperatura retal foi mantida até atingir a reclinação esternal total e a caminhada intencional. Para avaliação de longo prazo (Semanas 1–12), foi implementado um sistema diário de pontuação baseado no Escore de Condição Corporal (BCS), status de higiene e atividade geral, além de monitoramento diário do local cirúrgico para infecção ou deiscência. Comida úmida foi oferecida no chão da gaiola durante as primeiras 48 horas. O peso corporal era medido semanalmente. Os critérios humanos para a eutanásia precoce foram estritamente definidos como: perda de peso ≥20%, BCS ≤2,0, incapacidade persistente de alcançar comida/água > 12 horas, sinais de dor/dispneia intensa ou complicações graves no local cirúrgico (por exemplo, necrose). Animais que atenderam a esses critérios foram eutanasiados humanamente em até 24 horas. O cuidado pós-operatório incluiu a administração de cefalexina (15 mg/kg) intramuscularmente imediatamente após a cirurgia e às 24 horas pós-operatórias para prevenir infecção. Para analgesia, o carprofeno (2 mg/kg) foi administrado por via subcutânea imediatamente após a cirurgia e às 12, 24 e 48 horas pós-operatórias, totalizando quatro doses. Às 12 semanas após a implantação, o rato foi eutanasiado por overdose de isoflurano. O segmento da segunda para a terceira vértebra caudal foi então colhido em bloco e fixado em 70% de etanol.

Recomendações de treinamento, solução de problemas e tamanho da amostra. Para facilitar a adoção bem-sucedida desse protocolo exigente, novos operadores devem realizar de 3 a 5 procedimentos de prática em cadáveres de ratos, alcançando proficiência quando três colocações consecutivas não apresentam desposicionamento radiográfico. A solução de problemas comum inclui pré-medir a altura do disco via raio-X para otimizar a seleção do tamanho da gaiola e reverificar a planitude do osso dorsal para evitar a migração da gaiola. Se a compra do parafuso for insuficiente, recomenda-se utilizar velocidades de furadeira mais baixas. Para estudos futuros de validação, recomenda-se um tamanho mínimo de amostra de n = 6 a 10 por grupo (com 10–20% adicionais para atrição) para alcançar poder estatístico suficiente. Além disso, estudos futuros devem incorporar grupos de controle (por exemplo, gaiola vazia ou autoenxerto) para validar o desempenho do biomaterial.

Análise radiográfica e histológica

Tomografia microcomputadorizada (TC) e radiografia digital foram realizadas usando um sistema de microtomografia computorizada com tensão de tubo de 80 kV e corrente de 0,1 mA. Um filtro de alumínio de 1,0 mm de espessura foi utilizado durante a aquisição para minimizar artefatos de endurecimento causados pelo implante de titânio. Para avaliação longitudinal, a imagem in vivo foi realizada em 1 e 4 semanas pós-operatórias com tamanho voxel de 120 μm. Imagens ex vivo foram realizadas às 12 semanas pós-operatórias usando um suporte de amostra de 24 mm com tamanho voxel de 24 μm. Os dados de TC e imagens radiográficas foram reconstruídos usando um algoritmo padrão de retroprojeção filtrado e analisados usando um visualizador DICOM. Critérios quantitativos foram definidos para avaliar a união óssea. Radiologicamente, a fusão bem-sucedida foi confirmada quando uma estrutura trabecular contínua que conecta as placas finais craniana e caudal foi observada em pelo menos três cortes consecutivos na micro-CT. Um limiar global de 700 Unidades de Hounsfield (HU) foi aplicado durante a segmentação de imagem. Histomorfometricamente, uma proporção BV/TV de 70% ou mais dentro da gaiola foi considerada o limiar para o cumprimento físico espacial e a fusão. Histologicamente, a união óssea foi definida por uma ponte óssea completa do lado craniano para o caudal, sem a interposição de tecido fibroso. Para análise histológica, a marcação sequencial de fluorocromo foi realizada por injeção subcutânea de calceína (8 mg/kg) 2 dias antes da eutanásia para identificar a distribuição espacial da mineralização ativa no ponto terminal de 12 semanas. As vértebras caudais excisadas foram fixadas em 70% de etanol por 7 dias e coradas em bloco com mancha óssea de Villanueva. Os espécimes foram desidratados por graus crescentes de etanol, embutidos em resina de metacrilato de metil, e seccionados em sagital no centro geométrico preciso da gaiola, conforme determinado por guias Micro-CT pré-seccionadas, usando um micrótomo de serra diamantada. Amostras de solo não calcificadas (5 μm de espessura) foram preparadas no Instituto de Histomorfometria Óssea Ito (Niigata, Japão). As imagens foram obtidas usando um microscópio de campo claro e um microscópio confocal de varredura a laser para fusão de fluorescência. Exames adicionais foram realizados sob um microscópio de luz polarizada, e a análise histomorfométrica foi realizada usando um analisador de imagem computadorizado. A Região de Interesse (ROI) foi definida como o volume interno total da gaiola, excluindo os suportes metálicos, e foi subdividida em ROIs intragaiolas cranianos e caudais. O tecido ósseo foi identificado por sua cor roxa/magenta sob a coloração de Villanueva. O osso lamelar (Lm.V) era definido por sua estrutura altamente organizada e paralela lamelar sob luz polarizada, enquanto osso tecido (Wo.V) apresentava padrões desorganizados de fibras.

Resultados

Peso corporal (Tabela 1)

O peso corporal foi medido até 12 semanas após a operação, demonstrando um aumento constante (de 221,8 g para 346,8 g), indicando homeostase fisiológica e apoiando indiretamente a ausência de sofrimento crônico severo. Isso foi corroborado por avaliações multimodais diárias que confirmaram atividade normal e cicatrização simples de feridas.

Ferida (Figura 3)

Discussão

Aqui, foi estabelecido um novo modelo de fusão intersomática da coluna caudal do rato. Esse modelo envolve a inserção de uma gaiola de titânio por meio de uma abordagem posterior aumentada com fixação por placa e parafuso. Posteriormente, a formação óssea intra-gaiola foi avaliada por meio de análise histomorfométrica detalhada. As características distintas deste modelo são três: 1) ele imita de perto procedimentos clínicos de fusão intersomática lombar posterior ou transforaminal de fus...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A9% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%A3% E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%BC%E3% 82%BA-No-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A1% E3%83%AA%E3%83%A5 %E3%83%BC%E3%82% BF%E3%83%BC-%E3% 83%9F%E3%83%A9%E3 %83%A1%E3%83%87%E3 %83%AB%E7%94%A5%E5 %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%AF%E3%83%AD%E3%83%95%E3%83% 8B%E3%83%8A%E3%83%83%E3% 89%E3%83%88%E3%83%83%E3% 89%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%91%E3%83%83%E3% 89%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%97%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%83%E3%89% 84%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%91%E3%83%83%E3% 89%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%97%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%83%E3%89% 84%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%91%E3%83%83%E3% 89%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%97%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%83%E3%89% 84%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%91%E3%83%83%E3% 89%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%97%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%83%E3%89% 84%E3%83%84%E3%83%A9%E3% 8