Triagem e validação de ingredientes ativos assistidos por computador do medicamento Dong para febre e tosse

Resumo

Aqui, construímos uma rede multidimensional de "componente-alvo-via-doença", integrando triagem de farmacologia em rede, acoplamento molecular e validação de modelos de camundongos induzida por LPS. Ao estabelecer parâmetros-chave claros, ele possibilita a identificação eficiente dos componentes ativos da medicina étnica Tong, Lengyuxiao Tang, e a verificação de um processo repetível.

Resumo

Para triar e verificar sistematicamente os componentes ativos da medicina étnica Dong Lengyuxiao Tang (LYXT; Sêmen Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe) para tratar febre e tosse, esse esquema estabeleceu um processo metodológico que integra a predição da farmacologia em rede e a verificação experimental. Primeiramente, utilizando o banco de dados e plataforma de análise de sistemas de farmacologia da medicina tradicional chinesa (TCMSP), com biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e semelhança com fármacos (DL) ≥ 0,18 como critérios, os principais componentes ativos do LYXT foram triados, e os alvos relacionados para febre e tosse foram coletados de múltiplos bancos de dados de doenças. Posteriormente, foi construída a rede de interação "componente-alvo-doença" e, por meio de análise topológica e ontologia genética (GO) e enriquecimento de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), foram identificados os principais alvos de ação (CYP3A4, POR) e as principais vias de sinalização (via MAPK). A tecnologia de acoplamento molecular foi usada para verificar a capacidade de ligação de componentes-chave aos alvos centrais. Por fim, foi estabelecido um modelo de bronquite crônica em camundongos por meio da instillação intranasal de lipopolissacarídeo (LPS), e a eficácia anti-inflamatória in vivo dos principais componentes ativos previstos foi verificada. Os resultados mostraram que componentes como β-caroteno e saparenol, triados por farmacologia em rede, apresentaram diferentes graus de efeitos anti-inflamatórios em experimentos com animais, e seus mecanismos podem envolver inibição da via de sinalização MAPK/p38. Esse esquema fornece um exemplo repetível para a triagem e pesquisa de mecanismos de componentes ativos em medicinas étnicas tradicionais.

Introdução

A medicina Dong é um sistema etnomédico dentro do âmbito da Medicina Tradicional Chinesa (MTC), praticado pelo grupo étnico Dong em Guizhou, Hunan e Guangxi. Representa seu conhecimento empírico acumulado, desenvolvido ao longo de gerações. Esse sistema integra fitoterápiat, acupuntura, fixação óssea, massagem, terapia alimentar e práticas espirituais. Suas características distintas surgem do isolamento geográfico histórico do grupo e da tradição oral, que fomentou uma farmacopeia única, baseada na prática, adaptada ao ambiente local e às crenças culturais.

Febre persistente, uma condição que se desenvolve quando o corpo não consegue controlar sua temperatura, é um sinal de que o corpo está disfuncional e uma função vital de autoproteção nas células^humanas. Existem muitos métodos diferentes para o tratamento de remédios para aquecimento da nacionalidade Dong. Entre elas, a febre é categorizada em febre interna e febre externa. Febre interna refere-se ao calor causado por doenças internas, e febre externa refere-se ao calor gerado pelo frio ou trauma². A febre exógena geralmente afeta a função gastrointestinal³. Os médicos nacionais de Dong usam terapia antipirética para o resfriado para tratar febre. Entre as várias receitas de medicamentos Dong, Lengyuxiao Tang (LYXT) é uma decocção padrão usada para febre e dor, composta por Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe, que são constantemente amassadas e misturadas com^{água 4}. É usado principalmente para febre e dor de cabeça causadas por um resfriado.

No entanto, os componentes ativos do LYXT e seus mecanismos moleculares subjacentes continuam sendo pouco compreendidos. Para suprir essa lacuna, o presente estudo utilizou uma abordagem de farmacologia em rede para prever potenciais ingredientes ativos e alvos. Para validar essas previsões, foi selecionado um modelo de camundongo bem estabelecido induzido por lipopolissacarídeos (LPS) para inflamação pulmonar, pois ele imita as principais respostas inflamatórias associadas à febre e tosse, incluindo infiltração leucocítica e produção de citocinas pró-inflamatórias.

No processo de descoberta de medicamentos, diversos estudos revelaram que compostos podem interagir com múltiplos alvos proteicos. Portanto, o paradigma de "um medicamento, um alvo biológico" está mudando para um paradigma de farmacologia de sistemas. Um composto que interage com várias proteínas biológicas-alvo de vírus ou bactérias pode fornecer efeitos farmacológicos^{úteis 5}. A análise de farmacologia em redes é uma forma viável e eficaz de mitigar o processo caro e longo de descoberta de medicamentos. Ela pode nos ajudar a compreender melhor as interações entre medicamentos, prever mecanismos que causam a doença, sugerir membros alternativos para os efeitos farmacológicos pretendidos sem efeitos colaterais e prever as bioatividades da medicina tradicional. Abordagens quimioinformáticas, acoplamento molecular e modelagem baseada em dados foram aplicados com sucesso para prever bioatividades e analisar mecanismos. Esses métodos facilitam a rápida descoberta de compostos antivirais e antibacterianos com potencial clínico, e também são usados para explicar a eficácia e os efeitos adversos dos^{medicamentos 6}. Por exemplo, o mesilato de imatinibe, uma pequena molécula, é um inibidor do agente causal na leucemia mieloide crônica, a proteína de fusão Bcr-Abl, mas também bloqueia a atividade de várias tirosina quinases, como Abl, Kit e PDGFR⁷. Portanto, a pesquisa na identificação de medicamentos e seus alvos ainda é crucial para potencialmente tratar doenças, o que nos ajuda a entender os mecanismos pelos quais os compostos farmacêuticos atuam para tratar doenças em nível molecular. As abordagens de modelagem computacional e análise de redes podem rastrear com precisão potenciais drogas e alvos, e a análise multiplicativa de interações pode fornecer uma base teórica e orientação prática para verificação experimental. Neste artigo, utilizando a ferramenta de busca para o rebindante de genes/proteínas interagentes (STRING), banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) e outros bancos de dados, combinados com análise dinâmica de ontologia gênica (GO) e análise de vias, foram coletados dados sobre ingredientes ativos e proteínas de ação relacionadas do medicamento Dong LYXT para febre e tosse, e foi explorado o mecanismo do tratamento combinado de ingredientes ativos. que pode fornecer uma referência teórica específica para pesquisas futuras sobre o medicamento Dong LYXT, fornece uma estratégia reprodutível para explorar os mecanismos farmacológicos das fórmulas etnomedicinais e oferece insights sobre o desenvolvimento de novos agentes anti-inflamatórios.

Protocolo

O programa de experimentos com animais foi revisado pelo Comitê de Ética Experimental de Animais da Universidade de Lanzhou (D2024-292). Ela está em conformidade com os princípios de proteção animal, bem-estar animal e ética, bem como às disposições relevantes da ética nacional experimental animal.

1. Preparação do banco de dados e do software

1. Triagem de ingredientes ativos e coleta de genes alvo
   1. Acesse o banco de dados e plataforma de análise farmacológica do sistema MTC (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) e realize buscas separadas usando os nomes latinos de cada erva na formulação LYXT, a saber, Sêmen Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe, como palavras-chave para recuperar todos os compostos químicos associados a cada erva.
   2. Aplicar os critérios de triagem para filtrar os compostos extraídos de cada erva da seguinte forma: para Verbena officinalis L., defina a biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30,1% e a semelhança do medicamento (DL) ≥ 0,12; para Zingiber officinale Roscoe, definir OB ≥ 60% e DL ≥ 0,13; para Farbitidas de Sêmen, defina OB ≥ 16,93% e DL ≥ 0,50. Depois, mescla as listas de compostos filtrados das três ervas e remove entradas duplicadas com base em identificadores TCMSP únicos para gerar a lista final de compostos ativos no LYXT.
   3. Exporte todas as proteínas-alvo associadas a esses compostos ativos do banco de dados TCMSP como uma tabela contendo identificadores de compostos e nomes de proteínas-alvo, então importe essa lista de proteínas-alvo para o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Use a ferramenta de mapeamento de ID UniProtKB para converter todos os nomes de proteínas-alvo em símbolos oficiais de genes humanos, com o conjunto de direções de mapeamento do nome da proteína para o nome do gene, e remova quaisquer entradas que não possuam um símbolo genético válido para gerar a lista final de genes-alvo associados aos componentes ativos do LYXT.
2. Coleta de genes alvo de doenças e análise de sobreposição
   1. Baixe genes relacionados à febre e tosse do banco de dados GeneCards (www.genecards.org) pesquisando separadamente com as palavras-chave "febre" e "tosse", mantenha genes com pontuação de relevância ≥ 5 e funde os resultados de ambas as buscas dentro do banco de informações.
   2. Baixe genes relacionados à febre e tosse do banco de dados terapêutico-alvo (TTD) (db.idrblab.net/ttd) pesquisando separadamente com as palavras-chave "febre" e "tosse", baixe todos os genes-alvo associados e junte os resultados de ambas as buscas dentro do banco de dados.
   3. Baixe genes relacionados à febre e tosse do banco de dados PharmGkb (www.pharmgkb.org) pesquisando separadamente com as palavras-chave "febre" e "tosse", baixe todos os genes associados e mesture os resultados de ambas as buscas dentro do banco de informações.
   4. Baixe genes relacionados à febre e tosse do banco de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (www.omim.org) pesquisando separadamente com as palavras-chave "fever" e "cough", baixe todos os genes associados e misture os resultados de ambas as buscas dentro do banco de informações.
   5. Baixe genes relacionados à febre e tosse do banco de dados DrugBank (go.drugbank.com)⁸ buscando separadamente com as palavras-chave "fever" e "cough", baixe todos os genes associados e funde os resultados de ambas as buscas dentro do banco de dados.
   6. Unir as listas de genes obtidas dos cinco bancos de dados em uma única lista abrangente e remover símbolos duplicados de genes para gerar a lista final de genes-alvo relacionados à febre e tosse.
   7. Compare a lista de alvos da doença do passo 1.2.6 com a lista de genes alvo do componente ativo do LYXT do passo 1.1.4 para selecionar os genes sobrepostos comuns a ambas as listas, e exportar essa lista de genes sobrepostos como um arquivo CSV.
3. Conversão de DI e análise de seção transversal
   1. Carregue a lista de genes sobrepostos do passo 1.2.7 no ambiente R e acesse o site da DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Envie a lista de genes sobrepostos para o DAVID com a espécie definida para Homo sapiens e o tipo de lista para símbolo do gene, então execute a ferramenta de anotação funcional para realizar a análise de seção transversal.
   3. Converta os IDs de símbolos das proteínas que se intersectam em IDs de conjunto usando a função de conversão de ID gênico dentro do DAVID, com a direção de conversão definida do símbolo do gene para o ID do conjunto.
   4. Exporte a lista convertida de ID de conjunto junto com os símbolos genéticos originais como um arquivo CSV para análise de enriquecimento posterior.

2. Triagem dos ingredientes ativos vitais e das proteínas-alvo

1. Construção de rede composta-alvo
   1. Carregue a lista de genes que se cruzam do passo 1.2.7 e a lista de genes alvo do componente ativo do LYXT do passo 1.1.4 no ambiente R, depois realize uma análise de comparação para identificar compostos associados tanto aos genes-alvo quanto aos genes que se cruzam.
   2. Importe os dados de relação composto-alvo para a versão 3.8.1 do Cytoscape e gere o diagrama da rede "LYXT-Fever and cough-target" para visualizar as interações entre os ingredientes ativos e seus alvos associados.
2. Aquisição de dados de interação proteína-proteína
   1. Importe o arquivo de identificação genética da interseção dos alvos de ingredientes ativos do LYXT e alvos de febre e tosse obtidos na etapa 2.1.1 no banco de dados STRING no https://stringdb.org/, selecione Homo sapiens como espécie e múltiplas proteínas como método de processamento de dados.
   2. Filtre as interações proteína-proteína definindo o limiar de confiança para ≥ 0,90 e isolando proteínas com correlação muito baixa, depois gere um arquivo TSV contendo os dados filtrados de interação para análise posterior.
3. Confirmação da análise de interseção
   1. Utilize a linguagem R para analisar a interseção entre as proteínas-alvo dos ingredientes ativos e as proteínas-alvo da febre e tosse, confirmando o conjunto genético sobreposto identificado no passo 1.2.7.
   2. Prepare este conjunto de genes sobrepostos confirmado para análise subsequente de interação proteína-proteína (PPI) em rede.

3. Triagem de proteínas alvo chave

1. Visualização de redes PPI
   1. Importe os dados filtrados de interação da etapa 2.2.2 para a versão 3.8.1 do Cytoscape e use a ferramenta de visualização de rede para desenhar o diagrama da rede PPI.
   2. Instale e abra o plugin CytoNCA dentro do Cytoscape, depois use esse plugin para realizar análise topológica calculando os seguintes parâmetros para cada nó na rede: centralidade de grau (DC), centralidade de intermediação (BC), centralidade de proximidade (CC), centralidade de vetor próprio (EC), centralidade da rede (NC) e conectividade média local (LAC).
2. Identificação de proteínas alvo-chave usando triagem baseada em mediana
   1. Exporte a tabela de parâmetros topológicos calculados do CytoNCA como um arquivo CSV contendo todos os identificadores de nós e seus correspondentes valores DC, BC, CC, EC, NC e LAC.
   2. Calcule o valor mediano da centralidade de grau (DC) em todos os nós da rede e identifique todos os nós com DC maior que o dobro do valor mediano.
   3. Calcule os valores medianos para centralidade de proximidade (CC) e centralidade entre os dois (BC) em todos os nós da rede, depois, a partir dos nós identificados no passo 3.2.2, mantenha apenas aqueles nós que simultaneamente satisfazem CC maior que o valor mediano e BC maior que o valor mediano, seguindo a abordagem de triagem descrita por Kibble et ^al.9.
3. Compilação final de alvos chave
   1. Compile os identificadores dos nós retidos do passo 3.2.3 em uma lista de proteínas alvo chave e exporte essa lista como um arquivo CSV.
   2. Aplique esta regra de triagem baseada em mediana (DC maior que o dobro da mediana, CC maior que a mediana e BC maior que a mediana) como único critério para identificação de alvos-chave em todo o manuscrito, garantindo consistência com a abordagem unificada de triagem estabelecida no protocolo.

4. Análise de enriquecimento GO e análise de vias KEGG

1. Análise de enriquecimento funcional usando o banco de dados DAVID
   1. Seguindo o método descrito por Tanabe et ^al.10, faça upload da lista de genes intersectantes do passo 1.3.4 no formato de símbolo gênico para o banco de dados DAVID em https://david.ncifcrf.gov/, defina a espécie para Homo sapiens e o tipo de lista para símbolo do gene.
   2. Realize a análise de enriquecimento GO selecionando GOTERM_BP_DIRECT para o processo biológico, GOTERM_CC_DIRECT para componente celular e GOTERM_MF_DIRECT para função molecular, e realize a análise de enriquecimento da via KEGG selecionando KEGG_PATHWAY.
   3. Defina o limite de significância para p < 0,05 e aplique a correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg (FDR) para múltiplos testes, depois baixe os resultados do enriquecimento como arquivos CSV contendo nomes de termos, contagem de genes, valores p, valores p ajustados por FDR e genes associados.
2. Geração de gráfico de bolhas usando a plataforma em nuvem OmicShare
   1. Importe os resultados de enriquecimento GO da etapa 4.1.3 para a plataforma em nuvem OmicShare na https://www.omicshare.com/tools e selecione a ferramenta de gráfico de bolha de enriquecimento GO.
   2. Faça upload do arquivo de resultados contendo nomes de termos, contagem de genes e valores p, então configure a ferramenta para exibir os 20 termos principais com os valores p mais baixos.
   3. Defina o eixo x para representar a razão de enriquecimento, o eixo y para listar os termos GO, o tamanho da bolha para representar a contagem de genes e a cor da bolha para representar o valor p.
   4. Gerar o gráfico de bolhas e baixá-lo como um arquivo de imagem em alta resolução.
3. Visualização de caminhos KEGG usando o mapeador KEGG
   1. Ordene os resultados do enriquecimento de caminhos KEGG por p-valor em ordem crescente e selecione os 20 melhores caminhos com os menores p-valores.
   2. Para cada caminho selecionado, acesse o banco de dados KEGG em https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html para obter o diagrama do caminho.
   3. Identifique as proteínas-alvo da lista de genes que se cruzam e que estão presentes em cada via cruzando com os conjuntos de genes das vias a partir dos resultados do enriquecimento.
   4. Acesse a ferramenta mapeadora KEGG no https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, selecione a função Caminho de Cor , insira a lista de símbolos gênicos que se intersectam e o identificador de vias KEGG, e gere um diagrama de caminhos codificados por cores com as proteínas-alvo identificadas destacadas em vermelho.
   5. Compile todas as saídas da análise de enriquecimento, incluindo os arquivos CSV de enriquecimento GO para três categorias, o arquivo CSV de enriquecimento de caminhos KEGG, a imagem do gráfico de bolhas e os diagramas de caminhos codificados por cores para as 20 principais vias, depois exporte esses arquivos para análise posterior.

5. Verificação de acoplamento molecular

1. Baixe as estruturas 3D de proteínas vitais (como CYP3A4 e POR identificadas como alvos-chave na análise da rede) do banco de dados RCSB PDB em https://www.rcsb.org/, selecionando estruturas com resolução ≤ 2,5 Å do Homo sapiens que contenham um ligante co-cristalizado para definir o sítio ativo, e baixe os arquivos de dados estruturais dos compostos ativos (incluindo beta-caroteno, spathulenol, e beta-sitosterol) do banco de dados PubChem em formato SDF.
2. Prepare as estruturas proteicas usando o AutoDockTools removendo moléculas de água e o ligante co-cristalizado, adicionando hidrogênios polares e atribuindo cargas de Gasteiger, depois salve as proteínas preparadas no formato PDBQT, converta os arquivos SDF do composto para o formato PDB usando o Open Babel, detecte ligações rotativas para cada ligante no AutoDockTools e salve os ligantes no formato PDBQT.
3. Defina a caixa da grade de acoplamento com dimensões de 60 × 60 × 60 Å centrada nas coordenadas do sítio de ligação do ligante cocristalizado, então realize o acoplamento molecular usando o AutoDock Vina com exaustividade definida para 8 e num_modes para 10 para gerar 10 poses de ligação para cada par ligante-proteína.
4. Importar os arquivos de acoplamento resultantes e seus respectivos arquivos de destino para o PyMOL, identificar e salvar o modelo de acoplamento com a menor energia de ligação (valor mais negativo) como pose representativa.
5. Depois, submeta esse modelo ao banco de dados PLIP em https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ para analisar as interações entre pequenas moléculas e proteínas, incluindo ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, empilhamento de π e pontes salinas.
6. Calcule e compile as energias de ligação de todos os componentes ativos no LYXT contra as proteínas-alvo associadas à febre e tosse, depois gere uma tabela resumida contendo nomes de compostos, proteínas alvo, energias de ligação (kcal/mol) e tipos principais de interação para apresentação na seção de resultados.
   NOTA: O script R usado para análise de farmacologia de redes está disponível no Arquivo Suplementar 1.

6. Experimento com animais

1. Linha do tempo experimental
   1. Aclimatar os animais por 1 semana, depois realizar LPS ou administração de soro fisiológico no dia 0, administrar tratamentos medicamentosos diários do dia 7 ao dia 20 por 2 semanas e realizar a eutanásia com coleta de amostras no dia 21.
2. Aquisição e agrupamento de animais
   1. Compre 60 machos adultos C57BL/6 camundongos pesando 25 ±± 4 g, alimente os camundongos por 1 semana e depois divida-os aleatoriamente em um grupo normal de soro fisiológico (6 camundongos) e um grupo de lesões LPS (54 camundongos).
   2. No dia 7 antes do início do tratamento, divida-se aleatoriamente o grupo lesionado por LPS em sete subgrupos com 6 camundongos cada: grupo modelo, grupo positivo (dexametasona, 50 mg·^kg-1·^d-1), grupo de tratamento com LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupo beta-caroteno (50 mg·^kg-1·^d-1), grupo espatulenol (50 mg·^kg-1·^d-1), e grupo beta-sitosterol (50 mg·^kg-1·^d-1).
      NOTA: A administração do tratamento e as avaliações de resultados foram cegas.
3. Modelo de inflamação pulmonar induzida por LPS
   1. Administrar 2% de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal em uma dose de 60 mg/kg para anestesia. Confirme uma profundidade moderada de anestesia pela ausência de resposta de pinça na cauda. Por fim, com base no peso corporal registrado, calcule o volume necessário de injeção de LPS em uma concentração de 10 mg/mL.
   2. Prepare-se para a administração nasal puxando o volume precisamente calculado da solução de LPS para dentro da pipeta. Segure firmemente o rato segurando a base da cauda com a mão direita, enquanto usa o polegar e o indicador da mão esquerda para prender delicadamente a cabeça pelas orelhas.
   3. Expulse o líquido lentamente até que uma pequena gota (aproximadamente 2 μL) se forme na ponta da pipeta. Leve cuidadosamente a gota perto da narina direita do rato até que ela faça contato. Imediatamente e rapidamente levante a mão esquerda 30–40 cm para cima, depois devolve-a suavemente junto com o mouse para a posição inicial.
      NOTA: É necessário prestar atenção às narinas do rato para manter o estado de cima.
   4. Use o mesmo método para injetar pequenas gotas líquidas na narina esquerda do rato e adicioná-las sucessivamente nas narinas esquerda e direita até que a infusão líquida seja concluída.
   5. Depois, solte o mouse, fixe o mouse na placa com fita adesiva e mantenha a posição com o abdômen levantado e a cabeça inclinada por mais de 4 horas. Depois que o camundongo acordar, coloque-o de volta na gaiola para observação, seguindo o método descrito por Lorenz et ^al.11.
4. Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar
   1. Separe aleatoriamente os camundongos do grupo lesionado por LPS em sete grupos: grupo controle negativo, grupo modelo, grupo positivo (dexametasona, 50 ^mg.kg-1.d-1), grupo de tratamento com LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), grupo beta-caroteno (50 ^{mg.kg-1.d-1),} grupo espatulenol (50 ^mg.kg-1.d-1) e grupo beta-sitosterol (50 ^{mg.kg-1.d-1),} com seis camundongos em cada grupo.
      NOTA: Prepare o LYXT da seguinte forma: misture Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe em pó de massa de 5:3:2.  Misture o pó com água a 1:30 (g/mL) e refluxo a 80 °C por 2 horas. Filtre e concentre a solução (30 °C, 0,01–0,08 MPa) e dissolva-a em água para preparar uma solução de 2 g/mL. Beta-caroteno, beta-sitosterol e espatolenol foram usados como padrões de referência para validação experimental. Administre os medicamentos a cada grupo uma vez por dia durante 2 semanas, começando 1 semana após o tratamento com LPS. Eutanasiem os animais por overdose de tiopental (100 mg/kg), segundo Jin et ^al.12.
   2. Intube o ventrículo com uma cânula nº 23. Em seguida, injete lentamente 10 mL de PBS no tecido pulmonar sob pressão de 25 cm de H₂O, e repita essa lavagem aproximadamente 6 vezes para obter fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), seguindo o método descrito por Pinheiro et ^al.13.
5. Análise de leucócitos e citocinas em BALF e soro
   1. Centrifuge o BALF coletado a 500 × g por 10 minutos a 4 °C. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS, dilua 1:10 com azul de tripano e conte leucócitos totais usando um hemocitômetro sob microscópio óptico a 400× de ampliação.
   2. Colete o supernadante BALF e amostras de soro da punção cardíaca.
   3. Meça as concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-18 usando kits ELISA comerciais de acordo com as instruções do fabricante, lendo absorvância a 450 nm com um leitor de microplacas e calculando concentrações a partir de curvas padrão. Determine a concentração de proteína no BALF usando o ensaio BCA.
6. Validação dos componentes ativos por análise de HE e WB
   1. Para identificar componentes ativos que contribuem para a eficácia do LYXT, restabelecer o modelo de inflamação pulmonar induzida pelo LPS seguindo a seção 6.3.
   2. Compre 60 camundongos, se aclimate por uma semana e divida aleatoriamente em cinco grupos (n = 12 cada): grupo modelo, grupo LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupo beta-caroteno (50 mg·^kg-1·^d-1), grupo espatulenol (50 mg·^kg-1·^d-1) e grupo combinado (25 mg·^kg-1·^d-1 cada).
   3. Administre LPS no dia 0 e tratamentos do dia 7 ao dia 20, conforme descrito no passo 6.3. No dia 21, colete tecido pulmonar¹⁴.
7. Análise histológica
   1. Fixe o lobo superior do pulmão esquerdo em paraformaldeído a 4% por 24 horas, insome na parafina, corte seções de 5 μm e realize coloração por hematoxilina e eosina (HE).
   2. Examine seções sob microscópio óptico com ampliações de 200× e 400× para avaliar a infiltração inflamatória de células e o espessamento da parede alveolar. Capture imagens representativas.
8. Análise do Western blot
   1. Homogeneize tecido pulmonar em um tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) com inibidores de protease e fosfatase. Centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C e determine a concentração de proteína usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
   2. Carregue 30 μg de proteína por poço sobre géis de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), transfira para as membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e bloqueie com leite desnatado a 5%.
   3. Incubar com anticorpos primários contra p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 e β-actina durante a noite a 4 °C, depois com anticorpos secundários conjugados com HRP.
      NOTA: A diluição dos anticorpos está fornecida na Tabela de Materiais.
   4. Visualize bandas usando substrato ECL, capture imagens e quantifique intensidades usando ImageJ. Normalize a expressão da proteína-alvo para β-actina ou total de p38.

Resultados

O banco de dados TCMSP foi usado para coletar 409 ingredientes ativos do LYXT. Dessas, 58 ingredientes vieram da Verbena officinalis L., 86 da Semen Pharbitidis e 265 ingredientes ativos vieram da Zingiber officinale Roscoe. Vinte e seis ingredientes ativos principais foram avaliados de acordo com o índice: OB ≥ 30,1% e DL ≥ 0,12 para Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, DL ≥ 0,13 para Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93% e DL ≥ 0,50 para Sêmen Farbiti...

Discussão

Este artigo identificou com sucesso 26 ingredientes ativos e 207 potenciais alvos do LYXT, uma decocção tradicional do Dong usada para febre e tosse. Os principais achados incluem a identificação do CYP3A4 como proteína alvo crítica por meio de análise de topologia em rede, e a validação experimental de LYXT, beta-caroteno e espatulenol como compostos ativos com efeitos anti-inflamatórios significativos em um modelo de inflamação pulmonar induzida por LPS. Essas descobertas foram alcança...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, China	27095-1-AP	Policlonal de coelho, 1:500
Anti-IL-1 e beta;	Proteintech, Wuhan, China	66737-1-IG	Monoclonal de camundongo, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, China	14064-1-AP	Policlonal de coelho, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, China	28796-1-AP	Policlonal de coelho, 1:1000
Anti-TNF-& alpha;	Proteintech, Wuhan, China	80258-6-RR	Coelho monoclonal, 1:500
Anti-β-actina	Proteintech, Wuhan, China	66009-1-IG	Monoclonal de camundongo, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Versão 1.5.6	Software de acoplamento molecular
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Versão 1.5.6	Ferramenta de preparação de acoplamento molecular
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	23225	Para determinação da concentração de proteínas
Beta-caroteno	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	83-46-5	Padrão de alta pureza, >95%
Beta-sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	83-46-5	Padrão de alta pureza, >95%
C57BL/6 camundongos	Centro de Animais Médicos da Universidade de Lanzhou 	-	Homem adulto, 25 anos e mais; 4 g
Citoscape	https://cytoscape.org/	Versão 3.8.1	Software de visualização e análise de redes
Dexametasona	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	D4902	Controle positivo
Substrato ECL	MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA	WBKLS0500	Para detecção de Western blot
ELISA Kits
GraphPad Prisma	https://www.graphpad.com/	Versão 8.0 ou superior	Software de análise estatística e gráficos
Hematoxilina e Eosina (H&; E) Kit de Tingimento	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, China	G1120	Para coloração de tecido pulmonar
Histologia
Anti-mouse conjugado com HRP	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7G	Anticorpo secundário, 1:5000
Anti-coelho conjugado com HRP	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7H	Anticorpo secundário, 1:5000
IL-18 ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, China	SEKH-0016	Para medir IL-18 em BALF e soro
IL-1 e beta; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, China	SEKM-0004	Para medir IL-1 e beta; no BALF e no soro
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Versão 1.53	Software de análise de imagens
Lipopolissacarídeo (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	L2630	From  Escherichia coli  O111:B4
Matérias-Primas da LYXT	Universidade Huaihua	-	Mistura em pó de  Pharbitis nil  (L.) Escolha,   Verbena officinalis L., and  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, la/la/la)
Outros Materiais
Pentobarbital sódico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	P3761	Solução 2% para anestesia
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Perfilador de interação proteína-ligante
Membranas PVDF	MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA	IPVH00010	Para transferência de manchas ocidentais
PyMOL	https://pymol.org/	Versão 2.5	Software de visualização molecular
R	https://www.r-project.org/	Versão 4.0 ou superior	Software de computação estatística e gráficos
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUA	HY-N1205	Padrão de alta pureza, >95%
STRING	https://stringdb.org/	-	Ferramenta de busca para a recuperação de genes/proteínas interagentes
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Banco de Dados de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa
Tiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	T102	Para eutanásia
TNF-&alfa; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, China	SEKM-0034	Para medir TNF-&alfa; no BALF e no soro
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Banco de dados de sequências e anotações de proteínas