Agregados de Pseudomonas aeruginosa demonstram maior tolerância a antibióticos e células imunológicas. O papel da integridade da membrana na sobrevivência agregada está atualmente pouco explorado. Este estudo demonstra um método para quantificar mudanças na dinâmica da membrana celular dentro de agregados de P. aeruginosa, a fim de entender como a integridade celular pode impactar a viabilidade geral dos agregados.
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Artigo de método
Imagem em tempo real da resposta ao estresse induzido pelo hospedeiro em agregados de Pseudomonas aeruginosa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Infecções crônicas, como as da fibrose cística (FQ), são sustentadas por pequenos agregados altamente tolerantes de Pseudomonas aeruginosa que persistem apesar das pressões imunes e terapêuticas. Ao contrário dos biofilmes clássicos, esses agregados representam uma unidade patogênica distinta – comunidades organizadas espacialmente em microescala que mantêm integridade estrutural e homeostase fisiológica sob estresse induzido pelo hospedeiro. No entanto, os mecanismos que permitem que os agregados permaneçam intactos nessas condições, e se esses processos homeostáticos podem ser seletivamente interrompidos, permanecem pouco definidos. Uma barreira chave para preencher essa lacuna tem sido a falta de ferramentas capazes de capturar os processos dinâmicos e espacialmente resolvidos que ligam o estresse fisiológico à estabilidade estrutural e ao colapso em tempo real. Este estudo apresenta um fluxo integrado de imagem e análise para quantificar respostas agregadas a fatores de estresse relevantes para o hospedeiro. Utilizando o corante sensível à voltagem DiBAC4(5), a despolarização da membrana foi monitorada como um indicador precoce de perturbação fisiológica em agregados formados no meio sintético para fibrose cística do escarro (SCFM2). Microscopia confocal time-lapse de alta resolução permite a visualização de agregados tanto em estados estáveis quanto induzidos por estresse, enquanto segmentação de imagem e análise baseada em voxels fornecem mapeamento quantitativo da heterogeneidade espacial na integridade da membrana e desmontagem de agregados em resolução de célula única. Esse fluxo de trabalho estabelece uma plataforma reprodutível e adaptável para conectar o estresse fisiológico a resultados estruturais em agregados bacterianos multicelulares. Ao permitir a dissecação quantitativa dos processos que preservam – ou comprometem – a integridade dos agregados, essa abordagem fornece uma base crítica para identificar e direcionar os mecanismos homeostáticos que sustentam a resiliência dos agregados, avançando novas estratégias para interromper esse modo clinicamente significativo de persistência bacteriana.
Introdução
Infecções bacterianas crônicas geralmente são sustentadas não por grandes biofilmes presos à superfície, mas por pequenos agregados multicelulares que se formam em ambientes associados ao hospedeiro. Na fibrose cística (FQ) e em outras doenças crônicas das vias aéreas, Pseudomonas aeruginosa geralmente existe como agregados suspensos embutidos no muco ou no escarro, em vez de biofilmes clássicos ligados às superfícies epiteliais. Esses agregados representam um modo distinto de crescimento, caracterizado por organização espacial em microescala, heterogeneidade fisiológica pronunciada e tolerância excepcional a estressores imunes e antimicrobianos 1,2,3,4. Apesar de sua relevância clínica, os mecanismos que regem a estabilidade agregada, que neste protocolo é definida como a capacidade de manter a integridade da membrana e a organização espacial sob tais estressores, permanecem pouco compreendidos, com estudos anteriores focando mais nos componentes matriciais que suportam a formação de biofilmes acoplados à superfície 5,6.
Uma grande barreira para estudar eventos que contribuem para a desestabilização de agregados, como mudanças na despolarização de membranas e na arquitetura de agregados, é a falta de fluxos de trabalho experimentais que capturem mudanças fisiológicas e estruturais dinâmicas emtempo real 7,8. Ensaios tradicionais em massa e abordagens de imagem por ponto final não conseguem resolver como as respostas ao estresse surgem nos agregados, como essas respostas são distribuídas espacialmente ou como o enfraquecimento fisiológico, como a despolarização da membrana e a perda da homeostase iônica, se traduz em sinais precoces de estresse celular e eventual colapso físico. Embora a microscopia confocal tenha sido amplamente aplicada a biofilmes ligados à superfície, menos abordagens integram imagens resolvidas no tempo com análise quantitativa que liga diretamente a fisiologia celular à arquitetura agregada e à atividade membranária.
Alterações no potencial da membrana bacteriana fornecem um indicador precoce e sensível de estresse celular e perda de homeostase. Corantes sensíveis à tensão, como o ácido bis-(1,3-dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(5)) acumulam-se em células despolarizadas e oferecem uma leitura não destrutiva, baseada em fluorescência, da integridade da membrana. Embora corantes DiBAC tenham sido usados para avaliar a despolarização de membranas em culturas planctônicas e biofilmes ligados à superfície 9,10, sua aplicação a agregados multicelulares, especialmente sob condições de crescimento fisiologicamente relevantes e imagens em time-lapse, tem sido limitada.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado de imagem e análise que permite visualização e quantificação em tempo real da despolarização de membrana e da falha estrutural em agregados de P. aeruginosa. Agregados são formados em meio sintético para fibrose cística (SCFM2), um meio quimicamente definido que recapitula características-chave nutricionais e iônicas da via aérea da fibrose cística e apoia a formação espontânea de agregados sem superfícies ou fluxoimpostos 11,12. Nessas condições, P. aeruginosa forma agregados suspensos de tamanhos e heterogeneidade estrutural comparáveis aos observados em amostras de escarro e vias aéreas da FQ, fornecendo uma plataforma fisiologicamente relevante para estudar o comportamentoagregado 13.
Utilizando microscopia de varredura confocal a laser em time-lapse sob controle de temperatura e umidade, esse fluxo de trabalho captura tanto estados agregados estáveis quanto estados induzidos por estresse, marcados por aumento da despolarização da membrana e perda da homeostase celular ao longo de períodos de imagem prolongados. Ao combinar o relatório de potencial de membrana baseado em DiBAC com imagens z-stack de alta resolução, esse método possibilita a quantificação da fluorescência DiBAC₄(5) no nível de célula única, com valores mapeados e analisados dentro do contexto espacial de agregados individuais. A segmentação de imagens a jusante e a análise de superfícies baseada em voxels permitem quantificar em paralelo mudanças na arquitetura agregada e na despolarização da membrana.
Importante destacar que, embora esse protocolo seja demonstrado usando agregados de P. aeruginosa formados em SCFM2, o fluxo de trabalho é amplamente generalizável. A estratégia de imagem, a leitura fisiológica baseada em contraste e a estrutura analítica podem ser facilmente adaptadas a outras espécies bacterianas, meios promotores de agregados e estressores, incluindo agentes antimicrobianos, efetores imunes ou perturbações ambientais. Assim, essa abordagem oferece uma plataforma transferível e reprodutível para questionar a estabilidade das comunidades bacterianas em diversos contextos experimentais.
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Protocolo
Todo o trabalho com P. aeruginosa deve ser realizado sob condições adequadas de contenção BSL-2 e aprovações institucionais de biossegurança. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Geração de agregados de Pseudomonas aeruginosa em meio sintético para fibrose cística (SCFM2)
NOTA: Esta etapa descreve a preparação de culturas de P. aeruginosa e a formação de agregados multicelulares suspensos sob condições fisiologicamente relevantes que imitam o ambiente das vias aéreas da fibrose quística.
- Preparação de culturas bacterianas
- No dia anterior ao experimento, inocule o tipo selvagem de Pseudomonas aeruginosa PAO1 que transporta plasmídeo pMRP9-1 (GFP)14 de estoques congelados de glicerol em 5 mL de caldo de lisogênia (LB).
- Adicione carbenicilina (300 μg/mL) para manter a seleção de plasmídeos.
- Cultive as culturas durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm.
- Retrodiluição e preparação para formação de agregados
- No dia do experimento, diluir as culturas durante a noite 1:5 (1 mL durante a noite: 4 mL LB. Antibióticos não são readicionados nesta fase; a retenção residual é mínima e não afeta o crescimento).
- Cultive culturas por ~2 horas a 37 °C com agitação (200 rpm) para atingir a fase logarítmica.
NOTA: As células normalmente estão na fase exponencial inicial após ~2 horas nessas condições. Além disso, as células são posteriormente lavadas antes da inoculação no SCFM2 para minimizar qualquer remanescente de antibióticos.
- Preparação e equilíbrio do SCFM2
- Aproximadamente 30 minutos antes do fim do período de retrodiluição, aliquota pré-prepara SCFM2 em tubos estéreis e aquece até 37 °C.
- Para imagens em uma antena óptica de fundo de vidro de 4 poços, aloque 500 μL SCFM2 por poço. Prepare o volume excessivo para compensar o erro de pipeteamento.
NOTA: O SCFM2 é armazenado a 4 °C. O pré-aquecimento minimiza o choque térmico e melhora a reprodutibilidade da formação de agregados.
- Lavagem e padronização do inóculo
- Cultivo em pellets por centrifugação a 4200 x g por 4 minutos em temperatura ambiente.
NOTA: Se forem necessários cálculos até rpm, o raio do rotor do balde oscilante é de 172 mm. - Remova o sobrenadante e resuspenda os pellets em 3 mL de PBS estéril (pH 7,0).
- Repita os passos de lavagem mais duas vezes (total de três lavagens).
- Meça OD₆₀₀ e calcule o volume necessário para inocular SCFM2 a um OD₆₀₀₀ inicial de 0,05.
- Vórtice brevemente para homogeneizar células e inocular cada poço contendo 500 μL de SCFM2.
- Cultivo em pellets por centrifugação a 4200 x g por 4 minutos em temperatura ambiente.
- Formação de agregados sob condições estáticas
- Incubar o SCFM2 inoculado estaticamente a 37 °C por 4 horas para permitir a formação de agregados.
NOTA: Uma incubação de 4 horas reproduzivelmente produz agregados suspensos com tamanhos e heterogeneidade comparáveis aos observados em amostras de escarro e vias aéreas de FC, minimizando a maturação de biofilmes em estágiosposteriores 1,15.
- Incubar o SCFM2 inoculado estaticamente a 37 °C por 4 horas para permitir a formação de agregados.
2. Preparação de estressor imuno-associado (elastase neutrófila humana)
NOTA: Esta etapa descreve a preparação de um estressor derivado do hospedeiro usado para induzir estresse celular e desestabilização de agregados bacterianos.
- Reconstituição e armazenamento da elastase neutrófila humana (HNE)
- Reconstitua a elastase neutrófila humana conforme as recomendações do fabricante usando 50 mM de acetato de sódio, 200 mM de NaCl e água estéril.
- Prepare uma solução de coronha de 50 μg/L e esterilize com filtro usando um filtro de 0,2 μm.
- Aliquota em volumes de 50 mL e armazena a −20 °C.
- Na noite anterior ao uso, descongele uma aliquota a 4 °C.
NOTA: A aliquotação minimiza os ciclos de congelamento-descongelamento, o que pode reduzir a atividade enzimática e introduzir variabilidade. As aliquotas permanecem estáveis a 4 °C por aproximadamente 1 mês.
3. Preparação e aplicação do DiBAC4(5) para relatar a despolarização da membrana
NOTA: Esta etapa descreve a preparação e o uso de um corante sensível à voltagem para visualizar a despolarização da membrana dentro dos agregados.
- Preparação e armazenamento do DiBAC4(5)
- Comece preparando uma solução padrão de DiBAC4(5). Reconstitua o pó deDiBAC 4(5) em DMSO anidro para 1 mg/mL.
NOTA: A reconstituição do DiBAC4(5) no DMSO segue as recomendações padrão do fabricante. - Aliquota em volumes de 100 μL e armazenada a −20 °C protegida da luz.
- Use cada alíquota no máximo duas vezes.
NOTA: DiBAC4(5) é funcionalmente equivalente a DiBAC4(3), mas foi selecionado aqui para corresponder aos espectros de excitação/emissão GFP. Neste protocolo, o DiBAC4(3) é usado apenas para uma coloração adicional discutida na seção de resultados. O principal corante utilizado durante todo esse protocolo é o DiBAC4(5).
- Comece preparando uma solução padrão de DiBAC4(5). Reconstitua o pó deDiBAC 4(5) em DMSO anidro para 1 mg/mL.
4. Imagem confocal em time-lapse da despolarização de membrana em agregados de P. aeruginosa
NOTA: Esta etapa descreve a aquisição de imagens confocais de alta resolução e resolução temporal para capturar mudanças fisiológicas e estruturais dinâmicas nos agregados.
- Microscópio e preparação de câmaras ambientais
- Instale um inserto de microplaca aquecida ou câmara ambiental no palco do microscópio confocal.
- Ative o controle de temperatura e umidade pelo menos 1 hora antes da imagem e ajuste para 37 °C.
- Na aba de Aquisição , localize a aba do Laser e, aproximadamente 1 hora antes do uso, ligue os lasers necessários para permitir aquecimento adequado (laser de argônio para GFP; DPSS 561-10 para DiBAC4(5)) (Figura Suplementar 1A).
NOTA: O controle ambiental estável reduz a deriva de foco e preserva a integridade dos agregados durante experimentos de longo time-lapse.
- Aplicação do estressor imunológico
- Após 4 h de formação de agregados, adicione HNE aos poços experimentais até uma concentração final de 20 μg/L16.
- Deixe os poços de controle sem tratamento.
- Transfira a antena de 4 poços para o palco do microscópio.
NOTA: A HNE foi preparada em concentrações fisiologicamente relevantes (μg/L), com base nos níveis relatados no escarro induzido, e não como um estoque concentrado. As concentrações usadas neste estudo podem ser encontradas em McGarvey et al.16 sob IS (escarro induzido), NE-AAT (complexo NE/a1-anti-tripsina) e HV (voluntário saudável).
- Identificação de regiões agregadas de interesse
- Usando a aba Localizar e um objetivo de 20×, ligue a Luz Transmitida para identificar regiões ricas em agregados usando imagens de campo claro (Figura Suplementar 1B).
- Enquanto ainda utiliza imagens de campo claro, navegue até a aba Aquisição e salve as coordenadas x, y e z usando o módulo Posições (Figura Suplementar 1C).
- Repita para múltiplas réplicas técnicas por poço.
- Aquisição de stack z de alta resolução e séries temporais
- Mova para uma posição salva e mude para um objetivo de imersão em óleo de 63×.
- Aplique óleo de imersão antes de posicionar o prato.
- Na aba Aquisição , configure canais usando Smart Setup (Figura Suplementar 1D): GFP (488/509 nm) – atribuir verde, DiBAC4(5) (591/615 nm) – atribuir vermelho.
- Navegue até a visualização ao vivo , depois usando o módulo Z-stack , identifique a parte inferior do coverslip ajustando o foco fino e então defina-a como a primeira posição z clicando em Definir Primeiro (Figura Suplementar 1E).
- Suba até que o Intervalo indique 60 μm e defina a posição final em z clicando em Definir Último (Figura Suplementar 1E).
- Desative a visualização ao vivo e ative o Foco Definido. Selecione Encontrar Superfície e, posteriormente, selecione Armazenar Foco apenas quando o status indicar Reflexo Encontrado (Figura Suplementar 1F).
- Repita a calibração de foco para cada posição salva usando os módulos Z-stack e Definite Focus .
- Configure a aquisição por séries temporais para imagear cada posição a cada 3 minutos durante 6 horas (Figura Suplementar 1G).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui para descongelar, adicionar e incubar o corante DiBAC4(5), e pode ser retomado após o período de incubação. - Selecione Iniciar Experimento.
NOTA: Intervalos de três minutos equilibram a resolução temporal com considerações de fototoxicidade e fotodescoloração.
- Adição e incubação de DiBAC4(5)
- Adicione DiBAC4(5) a cada poço até uma concentração final de 5 μg/mL9.
- Incube no escuro por 30 minutos antes de iniciar a imagem em time-lapse.
NOTA: Essa incubação permite o equilíbrio do corante enquanto minimiza a fluorescência de fundo.
5. Análise quantitativa de imagens da estrutura agregada e colocalização deDiBAC 4(5)
NOTA: Esta etapa descreve um fluxo de trabalho quantitativo para ligar a despolarização de membranas à arquitetura agregada e à desestabilização.
- Importação de imagem e separação de canais
- Faça upload de arquivos de imagem (.czi ou equivalente) para o software Imaris x64 versão 10.2.0 ou superior.
- Verifique a calibração dos voxels verificando se as dimensões dos pixels x, y e z (tamanho do voxel) nos metadados da imagem refletem com precisão os parâmetros de aquisição confocal (objetivo, zoom, tamanho do passo z). Calibração incorreta levará a erros em medições espaciais e volumétricas.
- Renderização superficial de agregados bacterianos e sinal DiBAC4(5)
- Use o módulo Surfaces para renderizar agregados de P. aeruginosa :
- Em Configuração de Segmentação, selecione o canal GFP (Figura Suplementar 2A).
- Selecione habilitar Dividir Objetos Tocando Divididos (Crescimento da Região) e ajuste o Limiar de Intensidade para capturar totalmente os agregados (Figura Suplementar 2B).
- No módulo Filter Seed Points , mude o tipo de filtro para Número de Voxels Img = 1 e defina para 90% (Figura Suplementar 2C).
- Após o processamento da renderização, ajuste as superfícies para 100% (Figura Suplementar 2D).
- Complete a renderização e atribua coloração verde às superfícies bacterianas (Figura Suplementar 2E).
- Repita a renderização para o canalDiBAC 4(5) e atribua a coloração vermelha.
- Use o módulo Surfaces para renderizar agregados de P. aeruginosa :
- Colocalização e quantificação baseada em volume
- Selecione a renderização da superfícieDiBAC 4(5) (Figura Suplementar 3A) e determine em qual ponto de tempo a análise de colocalização será realizada.
- Navegue até Estatísticas > aba Detalhada > Valores Específicos (Figura Suplementar 3B).
- Defina colocalização selecionando objetos com menor distância às superfícies bacterianas de 0,00 (Figura suplementar 3B).
- Localize Edite e depois duplique esses objetos para gerar uma superfície que se sobrepõe a DiBAC com células (Figura Suplementar 3C). Certifique-se de renomear essa superfície para indicar suas qualidades sobrepostas.
- Na aba Detalhado em Valores Médios, registre os valores somados de volume em cada(s) ponto(s) de tempo selecionado(s) para: (1) sinal total de DiBAC4(5) (Figura Suplementar 3D); (2) Sinal DiBAC4(5) co-localizado (Figura Suplementar 3E).
- Calcule a porcentagem de sobreposição como:
NOTA: A sobreposição percentual reflete a proporção de sinal DiBAC₄(5) associado à célula dentro dos agregados, refletindo a despolarização da membrana em um dado ponto de tempo.
NOTA: Embora demonstrado usando agregados de P. aeruginosa em SCFM2 e estressado com HNE, esse fluxo de trabalho é amplamente adaptável a outras espécies bacterianas, meios promotores de agregados, repórteres fluorescentes e estressores, incluindo agentes antimicrobianos ou perturbações ambientais.
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Resultados
No protocolo descrito acima, está um método para acompanhar mudanças na dinâmica da membrana de agregados de P. aeruginosa modelados em um ambiente pulmonar de fibrose cística (Figura 1). Utilizando uma cepa tipo selvagem de PAO1 portadora de plasmídeo pMRP9-1 (GFP) (Figura 1A), HNE para simular estresse imunológico e corante de membranaDiBAC 4(5) (Figura 1C), fo...
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Discussão
O potencial de membrana serve como uma leitura sensível e precoce do estresse celular e da homeostase perturbada. Dentro dos agregados bacterianos multicelulares, essas mudanças fisiológicas ocorrem antes e podem levar à subsequente desestabilização estrutural. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho baseado em imagens que utiliza o corante de resposta lenta e sensível ao potencial bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(5)) para acompanhar a despolarizaç...
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
O S.E.D. é apoiado por fundos iniciais fornecidos pelo Departamento de Medicina Molecular da Universidade do Sul da Flórida, além de bolsas de pesquisa da Fundação de Fibrose Cística (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(3)) | AAT Bioquest | 21411 | molécula lipofílica, aniônica |
| ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(5)) | AAT Bioquest | 21410 | molécula lipofílica, aniônica |
| Carbenicilina | Produtos de pesquisa internacional & nbsp; | C46000-5.0 | usado para seleção de cepas de expressão de GFP de PAO1 |
| Prato inferior de vidro Cellvis de 4 câmaras de 35mm | Fisher | NC0600518 | O prato de câmara inferior de vidro permite a manutenção de agregados suspensos em meio de crescimento durante a imagem |
| Centrífuga | Beckman Coulter Ciências da Vida | B06320 | pareado com o rotor de balde oscilante Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (número de peça B01425) |
| Microscópio de varredura a laser confocal (CLSM) | Zeiss | LSM 880 | o modelo de CLSM usado para os experimentos descritos neste protocolo não está mais disponível, mas o LSM 900 é uma opção equivalente atualizada |
| Tubos de Cultura | Genesee | 21-130 | estéril; polipropileno |
| DAPI | Thermo Fisher | 62248 | usado para aplicações futuras propostas de coloração de neutrófilos com DiBAC4(5) |
| Cuvettes descartáveis | Tecnologia de Marca | 759086D | 1,5mL, semi-micro |
| DMSO | Millipore-Sigma | 276855-100ML | usado para a reconstituição do DiBAC4(3,5) |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 65-0880-92 | usado para aplicações futuras propostas de coloração de neutrófilos com DiBAC4(3) |
| Câmara Ambiental para CLSM | PECON | LSM 880 | esse sistema foi feito exclusivamente para produtos Zeiss e é geralmente chamado de "Sistema de Incubação S", e todos os componentes podem ser encomendados pela Zeiss como um complemento ao sistema LSM 880 (ou similar) |
| Gentamycina sulfato | Fisher | BP918-1 | usado para seleção de RFP expressando cepas de PA1633 |
| Glicerol | Genesee | 18-205 | usado para congelar cepas para armazenamento de longo prazo em -80 ° C |
| Elastase Neutrófila Humana (HNE) | Millipore-Sigma | 324681-50UG | Uma vez reconstituído, permanece estável por 1 mês em 4 ° C ou 1 ano com 20 ° C |
| Software Imaris x64 | Oxford Instruments | Versão 10.2.0 | |
| Óleo de imersão | Ciências de Microscopia Eletrônica | 16919-12 | não secante; padronizado em 37 ° C |
| Incubador | Benchmark Scientific | H1001-M | capaz de tremer |
| Caldo de Lisogênica (LB) | Genesee | 11-118 | Mistura Miller |
| plasmídeo de cerejeira & nbsp; | obtido de um colaborador | ||
| PA1633 cepa mutante transposon | obtido de um colaborador | ||
| Soro Tamponado com Fosfato (PBS) | Thermo Fisher | 3002 | pH 7,0 |
| Acetato de sódio | Thermo Fisher | AM9740 | 3M; pH 5,5; Livre de RNase |
| Cloreto de sódio | Fisher | S271-500 | usado para a reconstituição da HNE |
| Espectrofotômetro | VWR | 634-0882 | usado para medir a densidade celular para inoculação de PAO1/PA1633 em SCFM2 |
| Estéril .22µ Filtro m | Genesee | 25-244 | Usado para purificar HNE reconstituído |
| Tubos de Microcentrífuga Estéreis | Genesee | 24-272LR | 0,6mL |
| Seringa Estéril | Fisher | 14955459 | Usado para purificar HNE reconstituído |
| SX4400 rotor de balde oscilante & nbsp; | Beckman Coulter Ciências da Vida | B01425 | emparelhada com a centrífuga Beckman Coulter Life Sciences (parte nº B06320) |
| Meio Sintético para Fibrose Cística do Escarro (SCFM2) | SyntheBiome | 10002-500 | Lote #: 001-CF2-0724 |
| Água Ultra Pura | Genesee | 18-195 | Usado para a reconstituição da HNE |
| Tipo selvagem de Pseudomonas aeruginosa PAO1 com plasmídeo pMRP9-1 | Este plasmídeo pMRP9-1 contém GFP e expressa resistência à carbenicilina | ||
| ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging software | Zeiss | compatível com o LSM 880 |
Referências
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