Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo LysoTracker de células vivas para medir a remodelação lisossômica durante a senescência em fibroblastos humanos IMR-90.

Resumo

A senescência celular é um estado estável de parada do ciclo celular associado a fenótipos característicos, incluindo morfologia celular aumentada, sinalização secretora alterada e remodelação lisossômica pronunciada. Células senescentes comumente exibem expansão do compartimento endo-lisossômico ácido, acompanhada por mudanças na acidez luminal e na capacidade degradativa, criando uma oportunidade para leituras simples de células vivas para a remodelação de organelos ligados à senescência. Este trabalho descreve um protocolo de imagem de células vivas que utiliza o LysoTracker Deep Red, um corante fluorescente acidotrópico, para fornecer um proxy indireto dependente do pH para o compartimento ácido do organelo como correlacionado da carga de senescência. O método é demonstrado em fibroblastos pulmonares humanos IMR-90 passando por senescência replicativa através da passagem seriada. O protocolo detalha cultura celular e rastreamento de passagem, coloração com LysoTracker, imagem por fluorescência e quantificação baseada em imagem da intensidade do sinal lisossômico e da área positiva para sinais por célula. A coloração associada à senescência com β-galactosidase (SA-β-Gal) em culturas paralelas está incluída como marcador confirmatório opcional, e não como padrão de referência. Desfechos representativos mostram sinal de corante fluorescente acidotrópico mais alto e regiões lisopositivas maiores em culturas de passagem tardia do que em controles de passagem precoce, consistente com a expansão do compartimento ácido do organelo durante a senescência. Como a leitura depende do volume compartimental, gradiente de prótons e disponibilidade de corantes, ela é melhor interpretada como um correlato indireto da remodelação lisossômica, em vez de uma medida direta do número de lisossomos ou biogênese. O protocolo é simples de adotar e pode ser adaptado a outros tipos celulares ou tensões que induzem senescência, fornecendo um complemento prático e quantitativo aos ensaios convencionais de endpoint.

Introdução

A senescência celular é um programa duradouro de parada do ciclo celular ativado por vários estresses e gatilhos relacionados ao^{envelhecimento} 1,2,3,4. As células senescentes são classicamente identificadas por uma constelação de marcadores, já que nenhum marcador único é completamente específico. As características incluem morfologia celular aumentada e achatada, atividade de β-galactosidase (SA-β-Gal) associada à senescência, formação de focos de dano ao DNA e perfil secretor pró-inflamatório (SASP^)2,4,5. Entre essas características, a remodelação lisossômica emergiu como uma característica proeminente e funcionalmente significativa da^{senescência 6,7}. As células senescentes apresentam profundas alterações lisossômicas, incluindo uma expansão dramática no tamanho e número lisossômico, juntamente com função alterada (frequentemente envolvendo neutralização parcial do pH lisossômico e acúmulo de material não degradado⁾6,7,8,9. Essa expansão lisossômica contribui para o aumento da atividade SA-β-Gal, um marcador de senescência estabelecido que reflete a atividade elevada da β-galactosidase lisossômica em células^senescentes 10,11,12. De fato, a coloração SA-β-Gal explora esse fenômeno usando uma incubação de pH subótima (6,0) para precipitar seletivamente o corante em lisossomos de células senescentes, que acumularam a enzima e apresentam pH mais alto do que as células jovens 10,12,13.

Lisossomos desempenham papéis centrais na renovação e sinalização proteica, e sua desregulação é agora considerada uma marca do envelhecimento e da^senescência 1,2,4,6. Células senescentes frequentemente apresentam disfunção lisossômica, evidenciada pelo pH luminal elevado, alteração da atividade enzimática e acúmulo de lipofuscina (um pigmento autofluorescente de macromoléculas oxidadas^)6,14. A biogênese lisossômica é frequentemente aumentada ou alterada por meio da rede coordenada de expressão e regulação lisossômica (CLEAR) sob o controle do fator de transcrição EB (TFEB) e fatores^{relacionados 6,7,15}. Esse processo pode aumentar a massa lisossômica nas células senescentes à medida que se adaptam ao estresse expandindo o compartimento^{degradativo 6,7,10}. Por outro lado, células senescentes também podem apresentar declínio funcional lisossomal (por exemplo, redução da acidez), o que pode impactar processos como autofagia e conferir resistência a certos estresses, incluindo a morte celular ferroptótica ^6,8. Medir o conteúdo e a função lisossômica é, portanto, central para entender e identificar a senescência ^6,16.

LysoTracker Deep Red é uma sonda fluorescente permeável à membrana que se acumula seletivamente em organelas ácidas por meio de aprisionamento impulsionado por protonação na membrana^{lisossômica 16,17}. O sinal resultante reflete o volume combinado do compartimento ácido, a intensidade do gradiente de prótons e a disponibilidade local de corantes, em vez da massa lisossômica, e pode se deslocar com mudanças no pH lisossômico ou no estado da membrana que ocorrem independentemente do número total de^{lisossomos 6,16}. No contexto da senescência celular, as células apresentam compartimentos LysoTracker-positivos expandidos e marcados de forma mais intensa em comparação com os equivalentes pré-senescentes⁹, consistente com a expansão do compartimento do organelo ácido e o aumento da biogênese lisossômica relatados por estudos bioquímicos e^{ultraestruturais 6,7,10}. Essa abordagem de células vivas oferece várias vantagens em relação à coloração convencional de ponto final SA-β-Gal: permite análise quantitativa e espacialmente resolvida de células individuais, pode ser combinada com outros repórteres fluorescentes, não requer fixação e captura a heterogeneidade ao relatar características contínuas em vez de um ponto final^{binário 6,16}. Ao longo deste protocolo, o sinal do LysoTracker é usado como leitura do compartimento ácido do organelo nas células vivas, e as mudanças dependentes da condição são interpretadas de acordo, em vez de tratadas como uma medida absoluta do lisossomo^{número 6,16}.

Este protocolo detalha o uso do LysoTracker Deep Red para perfilar alterações lisossômicas em fibroblastos IMR-90 que passam por senescência replicativa. IMR-90 é uma linha normal de fibroblastos diploides humanos (feminina, de origem fetal pulmonar) amplamente utilizada em pesquisas sobre envelhecimento; como outros fibroblastos primários (por exemplo, WI-38), as células IMR-90 entram em senescência após ~50–60 duplicações populacionais (o limite de Hayflick) devido ao encurtamento dos telômeros e ao dano ao DNA^{que sinalizam 18,19}. O protocolo descreve como cultivar células IMR-90 para induzir senescência por meio de passagem seriada, verificar a senescência por morfologia e coloração SA-β-Gal, e colorir culturas vivas com LysoTracker Deep Red para imagens de^{fluorescência} 5,10,12,13. A aquisição e análise de imagens são incluídas, com leituras quantitativas como contagem lisossômica por célula, área lisossomal total por célula e intensidade média de fluorescência. Controles experimentais e considerações de segurança são enfatizados, incluindo o manuseio cuidadoso de corantes e fixadores, minimização da fototoxicidade durante a imagem e explicação da autofluorescência celular em células envelhecidas. O método é demonstrado usando senescência replicativa, mas pode ser adaptado a outros modelos, incluindo senescência induzida por medicamentos (por exemplo, tratamento com doxorrubicina ou etopósido) ou senescência prematura induzida por estresse (SIPS) por^oxidantes 2,3,4,19,20. Em cada caso, as leituras baseadas em LysoTracker devem ser comparadas com controles apropriados (células proliferantes ou em repouso) e, quando possível, validadas cruzadamente com pelo menos um marcador de senescência tradicional (como SA-β-Gal ou expressão p16INK4a)3,5,12,13.

O perfil lisossômico de células vivas preenche uma lacuna prática nos ensaios de senescência ao fornecer uma medição reprodutível e de resolução de célula única de um fenótipo-chave do organelo — a expansão lisossômica — diretamente ligada à função celular senescente (por exemplo, aumento da capacidade degradativa e da atividade secretora⁾2,3,4,6 . Como a coloração LysoTracker é compatível com imagens de alta taxa e citometria de fluxo, o protocolo pode ser escalado para aplicações como triagem de drogas (por exemplo, testes de senolíticos ou moduladores da função lisossômica^)2,3,6. Como direção futura, características lisossômicas por célula geradas por esse protocolo são passíveis de abordagens de classificação a jusante, incluindo modelos de aprendizado de máquina; O treinamento e validação desses classificadores estão além do escopo deste protocolo. No geral, esse método (Figura 1) permite a visualização e quantificação da dimensão lisossômica da biologia da senescência, fornecendo insights sobre como a biogênese e morfologia lisossômica mudam durante o envelhecimento ou o estresse, além de oferecer uma plataforma para testar intervenções direcionadas a lisossomos em células senescentes. O fluxo de trabalho de análise de imagens usado para segmentar núcleos, derivar regiões associadas a células, limiar e quantificar características do LysoTracker, e reproduzir as análises por poço e por célula apresentadas aqui, é implementado como um pacote complementar de código aberto (SenTrackLite v0.5.0), fornecido como Arquivo Suplementar 1 e arquivado com um DOI persistente para citação e reutilização²¹.

Figura 1: Visão geral do ensaio de senescência lisossômica de células vivas. (A) Fluxo de trabalho experimental. As células são coloridas vivas com LysoTracker Deep Red e um corante nuclear, imagens por microscopia de fluorescência padrão e, opcionalmente, processadas em paralelo para coloração SA-β-Gal para validação. (B) Medições por célula derivadas da imagem. O canal nuclear é usado para identificar células individuais, e a expansão ancorada no núcleo define uma região por célula para extrair medições associadas a lisossomos do canal LysoTracker. Medições representativas por célula incluem área lisossômica, intensidade média do LysoTracker e contagem de lisossomos. A coloração SA-β-Gal pode ser usada como rótulo de validação opcional ao gerar ou confirmar conjuntos de dados de referência. (C) Quantificação e saídas. Medições lisossômicas por célula são combinadas em uma única pontuação ou probabilidade de senescência por célula, usando uma abordagem simples de pontuação. Os resultados incluem valores por célula e resumos em nível de poço ou condição da carga de senescência, que podem ser comparados entre condições de indução de senescência ou tratamento senolítico. Criado com BioRender.com
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Protocolo

As células IMR-90 são uma linha celular estabelecida de fibroblastos humanos e não constituem pesquisa em sujeitos humanos. Não era necessário aprovar ou consentimento informado com aprovação ética. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de biossegurança da Universidade de Albany, State University of New York, para trabalho com linhagens celulares de origem humana sob condições de Biossegurança Nível 2 (BSL-2).

1. Preparação geral e visão geral do fluxo de trabalho

1. Defina o objetivo experimental como um ensaio de perfil lisossomal de célula viva usando coloração LysoTracker Deep Red e um corante nuclear vivo para quantificar a remodelação lisossômica como leitura contínua da carga de senescência em células IMR-90. Defina a comparação biológica primária como um dos seguintes desenhos:
   1. Indução de senescência vs. controle não induzido pareado.
   2. Condições de senescência alta vs. senescência baixa em uma dose ou série temporal.
   3. Condição de senescência alta tratada com um senolítico vs. Controle de senescência tratado por veículo.
   4. Séries de tratamento senolítico incluindo tanto um grupo com senescência baixa e um grupo com senescência alta.
2. Estabeleça a estrutura mínima de controle para todos os experimentos.
   1. Inclua um grupo controle de senescência-baixa compatível com densidade de placa, tempo de coloração e configurações de imagem.
   2. Inclua um grupo com alta senescência gerado por um gatilho de senescência definido ou por senescência replicativa de passagem tardia.
   3. Inclua réplicas biológicas por condição e realize coloração e imagem com o mesmo tempo em todas as condições.
3. Defina leituras de ensaio como medidas diretas baseadas em imagem da remodelação lisossomal:
   1. Meça a intensidade média por célula do LysoTracker dentro da máscara lysopositiva usando um limiar de intensidade consistente como leitura primária do ensaio. No nível de célula única, essa métrica separa as condições de senescência baixa das de alta senescência com maior tamanho de efeito e é insensível à densidade nuclear em nível de campo (Figura Suplementar 1).
   2. Registre as seguintes como leituras secundárias, que documentam a expansão do compartimento, mas são mais sensíveis a escolhas de segmentação ou densidade nuclear em nível de campo: área enriquecida com lisossomos por célula e intensidade integrada do LysoTracker por núcleo no nível do campo. A intensidade integrada por núcleo é informativa em campos bem povoados, mas se torna instável quando um campo contém um pequeno número de núcleos, à medida que a normalização por núcleo passa a ser dominada por células individuais.
   3. Registre métricas opcionais de contagem de pontos e tamanho dos lisossomos quando a resolução de imagem suportar a discriminação de pontos.
4. Use a coloração associada à senescência com β-galactosidase (SA-β-Gal) como uma etapa opcional de validação realizada em poços paralelos ou amostras pareadas, dependendo das restrições experimentais. Use essa validação para confirmar que culturas de passagem tardia apresentam aumento da positividade SA-β-Gal em comparação com culturas de passagem precoce.
5. Padronize o ensaio em diferentes condições fixando as seguintes variáveis antes da coleta dos dados:
   1. Concentração de trabalho do LysoTracker (75 nM) e duração de coloração (30 min).
   2. Identidade do corante nuclear e faixa de concentração de trabalho (por exemplo, Hoechst 33342 em 1 μg/mL a 2 μg/mL).
   3. Parâmetros de imagem, incluindo ampliação objetiva, tempo de exposição, intensidade de iluminação, binning e estratégia de foco.
   4. Formato de placa e configuração de imagem (placas de imagem com fundo transparente ou pratos de fundo de vidro), incluindo layout de poço replicado.
   5. Seleção de limiar e normalização de intensidade.
      1. Aplique um único limiar fixo de intensidade ao canal LysoTracker em todos os poços dentro de um experimento para definir a máscara lisopositiva.
      2. Selecione o limiar uma vez durante a configuração do ensaio usando um conjunto de campos de calibração que abrangam a faixa de intensidade esperada (por exemplo, dois campos de senescência baixa e dois de senescência alta), e mantenha-o constante em todos os poços dentro dessa sessão; permitir que o limiar varie por poço introduz uma dependência circular entre a medição e o resultado.
      3. Para comparações entre experimentos, adquira todas as condições em uma única sessão sob configurações idênticas de potência de laser, exposição e ganho e informe essas configurações na legenda da figura.
      4. Se forem necessárias comparações de intensidade absoluta entre sessões, inclua um padrão de referência fluorescente (por exemplo, uma placa de esferas de referência ou poço de referência fixo) e normalize as intensidades medidas de acordo.
         NOTA: Não compare valores brutos de intensidade entre sessões sem configurações idênticas de aquisição ou normalização baseada em referência.
   6. Normalização da densidade nuclear.
      NOTA: Como culturas senescentes tipicamente exibem redução da proliferação e menor densidade nuclear em tempos de semeadura comparáveis7,10, métricas em nível de campo baseadas na contagem absoluta de pixels (por exemplo, área total de lisospositivis) podem ser influenciadas pelo número de células por campo.
      1. Reporte valores brutos e normalizados por núcleo (valor bruto dividido pelo número de núcleos segmentados em Hoechst).
         NOTA: A normalização por núcleo controla para confundimentos relacionados à densidade e é a comparação apropriada para interpretação por célula. Para leituras baseadas em área, o valor normalizado serve como métrica primária, enquanto o total não normalizado é mantido para completude.
6. Adquira imagens sob condições que preservem a qualidade do sinal de células vivas e minimizem a variabilidade técnica. Mantenha as placas de passagem inicial e tardia protegidas da luz durante a coloração e transporte, e minimize o tempo fora das condições de cultura controlada durante a imagem.
7. Salve imagens de fluorescência como arquivos TIFF de plano único, canal único e sem perdas. Use um esquema de nomenclatura consistente que preserve o pareamento entre imagens nucleares e LysoTracker e mantenha a rastreabilidade para placar, poço, condicionar e replicar. Use um nome base compartilhado com sufixos de canal (por exemplo, _Hoechst.tif e _Lyso.tif). Armazene as imagens em uma pasta dedicada organizada por experimento, com subpastas conforme necessário.
   NOTA: Um ponto prático de pausa ocorre após estabelecer coortes de passagem precoce e tardia e confirmar que as culturas de passagem tardia apresentam crescimento mais lento e morfologia semelhante à senescência.
8. (Opcional) Inclua oxigênio como variável experimental mantendo coortes IMR-90 correspondentes sob condições ambientes e baixo oxigênio. Processe todos os grupos da mesma forma.

2. Cultura celular e indução da senescência replicativa

1. Descongelar fibroblastos pulmonares humanos IMR-90 de acordo com práticas padrão de cultura celular e expandir células em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal. Adicione penicilina-estreptomicina a 1% se consistente com a prática laboratorial e o desenho experimental. Mantenha as células a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Mantenha culturas em crescimento logarítmico e passagem antes de 70% a 80% de confluência. Use horários consistentes de manuseio e alimentação de mídia para reduzir a variabilidade entre as provas experimentais. Substitua todo o meio de cultivo a cada 2 a 3 dias entre as travagens.
   NOTA: Não permita que o meio permaneça inalterado por mais de 72 horas, pois a depleção de nutrientes e o acúmulo de fatores secretados podem promover fenótipos induzidos por estresse que confundem a senescência replicativa.
3. Defina o grupo basal de senescência baixa como culturas IMR-90 proliferantes ativas, mantidas sob condições que preservem o comportamento normal de crescimento. Ajuste a densidade e o manuseio das placas a todos os grupos experimentais.
4. Gerar um grupo com alta senescência usando uma das seguintes abordagens, escolhidas com base em objetivos experimentais.
   1. Induzir senescência replicativa por passagens seriadas com duplicação populacional até que proliferação lenta e morfologia associada à senescência sejam evidentes.
      NOTA: O nível de duplicação populacional (PDL) e o número de passagem são medidas distintas e são monitoradas separadamente. PDL refere-se a duplicações acumuladas pós-descongelação e é calculado em cada passagem como:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (células colhidas / células semeadas⁾¹⁸,
      enquanto o número de passagem conta o número de subculturas desde o degelo. Como as culturas são tipicamente divididas 1:4 em aproximadamente 70%–80% de confluência, cada passagem contribui com cerca de duas duplicações populacionais, então o número de passagem e o PDL acumulado não são intercambiáveis.
      NOTA: Culturas de alta senescência são tipicamente observadas em níveis avançados de duplicação populacional, quando a proliferação desacelera e a morfologia associada à senescência se torna evidente. Limiares exatos devem ser determinados empiricamente para cada lote IMR-90, pois os PDLs variam entre os fornecedores.
   2. Senescência induzida por estresse aplicando um gatilho de senescência definido e permitindo uma janela de desenvolvimento fenotípica apropriada.
   3. Senescência induzida pelo tratamento ao expor células à condição em estudo quando o objetivo é testar se essa condição induz senescência.
5. Valide que a abordagem selecionada produz um fenótipo de senescência alta usando pelo menos uma leitura ortogonal realizada em poços paralelos. Realize a coloração SA-β-Gal como método opcional de validação e documente a fração de células positivas por condição quando incluída.
   1. Uma cultura qualifica-se como alta de senescência quando pelo menos 50% das células apresentam coloração perinuclear azul inequívoca de SA-β-Gal após incubação de 12 a 16 horas no pH 6,0, enquanto o controle de senescência-baixa compatível mostra no máximo 10% de células positivas sob condições idênticas^{de coloração 13}.
   2. Valores fora desses limites indicam indução de senescência incompleta ou fundo elevado e justificam reotimização antes de prosseguir para a imagem.
      NOTA: Faça uma pausa após estabelecer coortes de senescência baixa e alta de senescência e confirmar uma diferença fenotípica clara por morfologia e coloração opcional de validação.
6. Opcional: Desenho de tratamento senolítico
   1. Condições de senescência baixa e alta em poços replicados permitem que as células aderam e se recuperem antes do tratamento.
   2. Trate poços de alta senescência com composto senolítico e inclua um controle de alta senescência tratado por veículo.
   3. Incluir um grupo de baixa senescência tratado com o mesmo veículo e, quando relevante, com a mesma concentração composta(s) para monitorar a sensibilidade não senescente.
   4. Proceda a usar LysoTracker e a coloração nuclear em um horário consistente após o tratamento em todas as condições.
7. Monitore as culturas durante a passagem tardia/progressão do tratamento e documente a morfologia e os padrões de crescimento. Identifique culturas senescentes por proliferação lenta, morfologia aumentada e achatada, e granularidade citoplasmática aumentada. Quando a parada do crescimento for evidente, mantenha a cultura como a coorte com alta senescência para coloração e imagem, em vez de passar mais longe.
8. Minimize fatores de estresse confusos durante a manutenção da cultura utilizando preparação consistente do meio, horários de alimentação consistentes e tempo de manuseio consistente fora da incubadora. Trate flutuações de temperatura, tempo prolongado fora de CO₂ controlado e aquecimento inconsistente do meio como fontes de variabilidade técnica evitável.
9. Opcional: Mantenha culturas compatíveis sob oxigênio ambiente e baixo oxigênio. Manter culturas abaixo de 21% de O₂ e abaixo de 5% de O₂ como coortes separadas e manter cada coorte sob sua condição de oxigênio atribuída durante o manuseio rotineiro da cultura, quando possível. Limite a exposição ao oxigênio ambiente durante transferências e preparação de imagens para coortes com baixo oxigênio.
   NOTA: Um ponto prático de pausa é após definir e estabilizar as coortes de passagem precoce e tardia, e confirmar que culturas de passagem tardia apresentam crescimento consistente e morfologia associada à senescência.

3. Coloração lisossômica e nuclear de células vivas com LysoTracker Deep Red e um corante nuclear

1. Placar células IMR-90 para todas as condições experimentais em placas de imagem de fundo transparente ou placas de fundo de vidro. Inclua uma condição controle de baixa senescência e pelo menos uma condição de senescência-alta gerada pelo gatilho selecionado, e inclua réplicas biológicas para cada condição.
2. Células semente para alcançar uma monocamada subconfluente no dia da coloração. Registre a densidade de semeadura e o tempo entre o revestimento e a coloração de cada experimento para apoiar a comparabilidade entre as fases.
3. Cultive com temperatura completa e quente até 37 °C. Prepare uma solução de trabalho LysoTracker Deep Red a 75 nM no meio aquecido e proteja-a da luz. A solução de trabalho é preparada diluindo o estoque LysoTracker Deep Red de 1 mM (fornecido pelo fabricante em DMSO) 1:13.333 em meio de cultivo completo aquecido (por exemplo, 0,75 μL de estoque de 1 mM por 10 mL de meio aquecido).
   NOTA: Células senescentes de passagem tardia e induzidas por estresse acumulam lipofuscina e outro material autofluorescente inespecífico que emite em amplas faixas de comprimentos de onda e pode contribuir para o sinal aparente do LysoTracker em controles não^{corados 14}. Para estimar a contribuição da autofluorescência em um determinado experimento, inclua pelo menos um poço não corado por condição e adquira-o sob configurações de imagem idênticas. Subtraia o sinal médio de poço não corado das medições de poços coloridos, ou reporte os valores brutos e subtraídos de fundo.
   NOTA: Na prática, o sinal não corado no canal LysoTracker em culturas IMR-90 é pequeno em relação ao sinal senescente corado (aproximadamente 5% a 10% da média senescente colorida no presente conjunto de dados), mas a contribuição aumenta com o número de passagens e pode se tornar substancial (mais de 20%) em culturas senescentes profundamente senescentes ou induzidas por^{oncogenes 6,14}. Sempre verifique a magnitude da autofluorescência ao adotar esse protocolo para um novo tipo de célula ou modelo de senescência-indução.
4. Prepare solução de trabalho LysoTracker suficiente para todos os poços que serão tingidos durante a passagem. Misture a solução de trabalho por inversão suave e mantenha-a protegida da luz até o uso.
5. Aspire o meio gasto de cada poço. Adicione a solução de trabalho LysoTracker suavemente ao longo da parede do poço para evitar perturbar a monocamada e manter um volume de tingimento consistente entre os poços.
6. Incube as células com LysoTracker por 30 minutos a 37 °C em 5% de CO₂. Mantenha todos os grupos experimentais sob a mesma duração e temperatura de incubação.
7. Adicione um corante nuclear vivo durante os últimos 10 minutos de incubação com LysoTracker. Adicione Hoechst 33342 diretamente ao meio contendo LysoTracker na concentração de trabalho recomendada pelo fabricante, por exemplo, 1 μg/mL a 2 μg/mL, e misture balançando suavemente a placa.
8. Remova o meio de mancha ao final da incubação. Enxágue as células uma vez com soro sério pré-aquecido com fosfato tamponado para reduzir a fluorescência de fundo.
9. Adicione um meio de cultura vermelho sem fenol previamente aquecido ou um tampão de imagem imediatamente após o enxágue. Prossiga diretamente para a imagem ao vivo e mantenha um tempo consistente entre a troca de buffer e a aquisição de imagem em todos os poços do experimento.
10. Proteja as placas da luz durante as transferências e a instalação de imagem. Minimize o tempo gasto fora das condições controladas de temperatura e CO₂ durante o manuseio e aquisição de imagens.
    ATENÇÃO: Manuseie corantes fluorescentes usando luvas e proteção para os olhos. Descarte líquidos contendo corantes e consumíveis contaminados conforme os procedimentos institucionais de segurança química.
    NOTA: Use um ponto de pausa após o Passo 3.9 se a imagem exigir a preparação de várias placas. Mantenha as placas protegidas da luz a 37 °C e retome a imagem o mais rápido possível para limitar a deriva de manchas.
    NOTA: Se o desenho experimental incluir oxigênio como variável, mantenha cada coorte sob sua condição de oxigênio atribuída durante a coloração e incubação, e registre o tempo de manuseio fora da condição atribuída.

4. Coloração SA-β-Gal para validação (opcional)

1. Use a coloração SA-β-Gal como etapa opcional de validação para confirmar que a condição de senescência alta apresenta aumento da atividade SA-β-Gal em relação ao controle de senescência baixa. Realize validação em poços paralelos processados no mesmo formato de placa e sob o mesmo cronograma de manuseio dos poços de imagem.
2. Imagem completa ao vivo para os poços de validação antes da fixação. Quando se deseja comparar o mesmo campo antes e depois da fixação (Figura 2), registre as coordenadas do estágio na aquisição, realoque manualmente cada campo após fixação e coloração, e verifique visualmente a posição nuclear e a morfologia celular para confirmar que os campos correspondem antes de incluí-los na análise a jusante.
3. Fixe as células usando a solução de fixação fornecida no kit de coloração SA-β-Gal preparado na concentração de trabalho recomendada de 1x, contendo 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído. Incube por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Para referência, a solução de fixação contém 2% (p/v) de formaldeído e 0,2% (p/v) de glutaraldeído em soro tamponado com fosfato. A solução de coloração SA-β-Gal no pH 6,0 contém 1 mg/mL de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) dissolvido em dimetilformamida imediatamente antes do uso, 40 mM de tampão de ácido cítrico / fosfato de sódio a pH 6,0, 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio, 150 mM de NaCl e 2 mM de ^{MgCl��12,13}. Kits comerciais que atendem a essas especificações podem ser usados de forma intercambiável, desde que o pH do tampão de coloração seja verificado em 6,0.
4. Remova o fixador e enxágue os poços duas vezes com soro tamponado com fosfato. Adicione solução de coloração SA-β-Gal a pH 6,0 contendo substrato de X galões em cada poço.
5. Sele a placa para limitar a evaporação durante a incubação. Coloque a placa em uma incubadora sem CO₂ a 37 °C por 12-16 horas.
6. Inspecione os poços por microscopia de campo claro e documente o padrão de coloração. Adquira imagens representativas para cada condição e informe a fração de células SA-β-Gal-positivas por poço ao validar os resultados.
   ATENÇÃO: Formaldeído e glutaraldeído são tóxicos e voláteis. Prepare e use solução de fixação em uma exaustão química e use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, proteção ocular e jaleco.
   NOTA: Se a coloração SA-β-Gal apresentar alto fundo no controle senescência-baixa ou coloração fraca na condição senescência-alta, repita a validação após ajustar a densidade de placagem, duração da fixação, duração da incubação e consistência da temperatura, mantendo o pH do tampão em 6,0.

Resultados

Aplicar esse protocolo a fibroblastos IMR-90 em condições de senescência baixa e alta resulta em leituras lisossômicas quantitativas que podem ser resumidas no nível de célula única e, quando desejado, no nível de campo inteiro.

O conjunto de dados representativo mostrado nas figuras e tabelas deriva de um único experimento biológico que comparou culturas IMR-90 na passagem 13 (P13; senescência-baixa, ~PDL 26) e na passagem 23 (P23; senescência-alta, ~PDL 46)....

Discussão

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de imagem de células vivas que mede a senescência por meio de remodelação lisossômica e gera leituras quantitativas por célula e por poço da carga da senescência. Vários passos são especialmente críticos para obter um ensaio confiável. Primeiro, o próprio modelo biológico deve ser bem controlado. A indução da senescência replicativa em fibroblastos IMR-90 requer acompanhamento cuidadoso das duplicações populacionais e manutenção paralela das c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Qualquer placa de cultura multi-poço de fundo transparente compatível com imagem de fluorescência de células vivas (por exemplo, placas de poliestireno TC-tratadas de 6, 12 ou 24 poços; placas de imagem de fundo de vidro podem ser preferidas para imagem de alta resolução).
Beta-galactosidase staining kit (ensaio de senescência)	Cell Signaling Technology	9860	Qualquer kit comercial de SA-β-galactosidase com tampão de coloração verificado a pH 6,0. Para referência, a solução de fixação contém 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído em PBS, e a solução de coloração contém 1 mg/mL de X-gal em DMF, 40 mM de citrato/fosfato pH 6,0, 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2.
BioRender (software de ilustração científica)	BioRender	N/A — aplicação web	Utilizado para criar figuras esquemáticas (Figuras 1–3). https://www.biorender.com
Carbon dioxide gas (CO2), compressed cylinder	Airgas (ou fornecedor similar)	N/A	CO2 de grau médico usado para manter atmosfera de 5% no incubador de cultura celular e na câmara de imagem em estágio.
Fetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Qualquer FBS de grau de cultura celular, inativado por calor a 56 °C; usado a 10% v/v no meio de cultura completo.
Fluorescence microscope with live-cell capability	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Qualquer microscópio de fluorescência de campo amplo ou confocal com controle de temperatura e CO2 para células vivas, conjuntos de filtros para canais de infravermelho distante (excitação ~647 nm / emissão ~670 nm) e DAPI/Hoechst (excitação ~405 nm / emissão ~460 nm), e uma objetiva de 20×-40× com NA suficiente para resolver características lisossômicas. O sistema de imagem EVOS M7000 foi usado neste estudo.
Hoechst 33342 nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	H3570	Corante de DNA permeável a células para coloração nuclear de células vivas (fluorescência azul, excitação ~405 nm). Não intercambiável com DAPI, que não é permeável às células sob condições fisiológicas.
Image analysis software	Python Software Foundation	N/A	Qualquer ambiente de computação científica que suporte segmentação do núcleo, expansão da região do núcleo para a célula, thresholding de intensidade e estatísticas básicas de imagem (por exemplo, Python com scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). O pipeline SenTrack (ver Arquivo Suplementar S1) foi desenvolvido para este estudo.
IMR-90 human lung fibroblasts (cell line)	ATCC	CCL-186	Linha de células de fibroblastos diploides fetais humanos normais usada para modelar senescência replicativa; qualquer linha de fibroblastos humanos com características semelhantes pode ser substituída.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Corante fluorescente acidotrópico para coloração de organelas ácidas em células vivas; fornecido como estoque de 1 mM em DMSO. A concentração de trabalho é de 75nM na mídia de cultura celular preparada.  A emissão de infravermelho distante (ex 647 nm / em 668 nm) minimiza a sobreposição com a autofluorescência da lipofuscina, mas não a elimina.
Minimum Essential Medium (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Meio de cultura basal para fibroblastos IMR-90; suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Qualquer formulação padrão de Minimum Essential Medium de Eagle com sais de Earle e L-glutamina pode ser substituída.
Penicillin-streptomycin solution (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Suplemento antibiótico para meio de cultura completo; usado a 1% v/v (concentração final 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina). Qualquer solução padrão de pen-strep pode ser substituída.
Phenol red-free imaging medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	DMEM ou HBSS sem fenol vermelho usado para imagem de células vivas para reduzir a fluorescência de fundo durante a aquisição. FluoroBrite DMEM é uma opção comumente usada; qualquer tampão de imagem sem fenol vermelho suplementado com 10% de FBS pode ser substituído.
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Tampão isotônico para lavagem celular e diluição de reagentes; qualquer PBS 1× estéril a pH 7,4 pode ser substituído.
SenTrackLite v0.5.0 (software)	Open-Source (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Aplicação Python / Tkinter de arquivo único de código aberto para análise de imagem de senescência lisossômica. Distribuído como Arquivo Suplementar S1. Arquivado em Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licença MIT. Fonte: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Stage-top environmental chamber	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	Câmara ambiental para imagem de células vivas em microscópio com controle de temperatura (37 °C) e CO2 (5%). O EVOS Onstage Incubator foi usado neste estudo; qualquer incubadora de topo de estágio equivalente pode ser substituída.