Estabelecendo um pulmão em chip em cocultura epitelial-endotelial para investigação em condições saudáveis e de dobcólice

Resumo

Esse protocolo estabelece um sistema dinâmico de co-cultura pulmão em chip, combinando células epiteliais primárias das vias aéreas humanas e células endoteliais microvasculares pulmonares para dois modelos: modelo saudável e modelo de DPOC. O sistema reproduz as interações via aérea-vascular sob interface ar-líquido e fluxo, além de fornecer avaliação de barreira, fenotipagem celular e análise de RNA.

Resumo

Dois modelos dinâmicos de cocultura pulmão em chip foram desenvolvidos para recriar a interface via aérea–vascular, incorporando células epiteliais primárias das vias aéreas e células endoteliais microvasculares pulmonares. Um modelo utiliza células comercialmente disponíveis de doadores saudáveis, enquanto o outro emprega células derivadas de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), permitindo a comparação direta de condições saudáveis e doentes sob condições de cultura idênticas. Ambos os modelos suportam diferenciação epitelial sob perfusão contínua e condições de interface ar-líquido (ALI), resultando em uma barreira epitelial fisiologicamente relevante sustentada por uma camada endotelial subjacente. O fluxo de trabalho inclui revestimento de matriz extracelular, semeadura celular, estabelecimento de ALI, avaliação da função barreira, fenotipagem celular e extração de RNA específica por tipo celular. Ensaios de permeabilidade demonstraram robusta integridade de barreira em ambos os sistemas, enquanto a imunofluorescência confirmou a localização contínua de Zonula Occludens-1 (ZO-1) e da caderina endotelial vascular (VE-cadherina) nas junções celulares. A diferenciação epitelial foi confirmada por coloração β-tubulina IV e visualização do batimento ciliar. RNA de alta qualidade foi obtido separadamente de cada compartimento, apoiando análises moleculares específicas para tipos celulares. O modelo de DPOC recapitulou características chave da doença, notadamente o aumento da produção de muco, sem comprometer a função da barreira ou a viabilidade celular. O uso de células epiteliais e endoteliais derivadas do paciente preserva características patológicas individuais, permitindo a investigação dos mecanismos intercelulares na DPOC. Essa abordagem oferece uma alternativa fisiologicamente relevante aos modelos estáticos in vitro e animais e apoia estudos pré-clínicos de drogas inaladas, exposição a patógenos e interações epitelial–endotelial. Importante, os modelos saudáveis e de DPOC pulmão em chip podem ser usados tanto em combinação para estudos comparativos diretos quanto independentemente para investigações mecanicistas, testes terapêuticos e descoberta de medicamentos. O sistema também pode ser adaptado a outras condições respiratórias envolvendo compartimentos epiteliais ou endotelianos alterados, oferecendo uma plataforma versátil e translacional para pesquisa respiratória.

Introdução

A interação entre as células epiteliais das vias aéreas e as células endoteliais microvasculares pulmonares é essencial para manter a homeostase pulmonar e coordenar respostas a lesões, infecções e inflamações. Juntos, esses tipos celulares formam uma barreira funcional que regula a troca gasosa, a vigilância imune e a permeabilidade vascular. Sua diafonia dinâmica envolve sinalização paracrina, interações diretas célula-célula e respostas a estímulos mecânicos, todos críticos para a função pulmonar e integridade^{estrutural 1}.

Na doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), um distúrbio pulmonar progressivo caracterizado por inflamação crônica, remodelação das vias aéreas e destruição da interface alveolar–capilar, a função barreira tanto do epitélio das vias aéreas quanto do endotélio vascular pulmonar é prejudicada e acompanhada por liberação aberrante de citocinas e mecanismos de reparo tecidular^{desregulados 2,3}. No entanto, a interação entre células endoteliais epiteliais das vias aéreas e microvasculares pulmonares ainda é pouco compreendida. Essa limitação se deve em parte às deficiências dos modelos in vitro e in vivo existentes. Embora modelos animais tenham fornecido importantes insights sobre fisiologia e patologia respiratória, sua relevância é limitada por diferenças interespécies na função imunológica, arquitetura pulmonar, sinalização celular e metabolismo de fármacos, que podem dificultar a tradução para a biologia humana.

Sistemas convencionais in vitro, como culturas bidimensionais (2D) de linhas celulares epiteliais das vias aéreas imortalizadas, não conseguem recapitular características-chave do epitélio das vias aéreas, incluindo a diferenciação adequada e a resposta biomecânica. Embora as monoculturas tridimensionais (3D) de interface ar–líquido (ALI) de células epiteliais primárias melhorem a relevância fisiológica, elas permanecem estáticas e carecem de interações com outros tipos celulares e estímulos^{mecânicos 4}. O pulmão é um órgão dinâmico continuamente exposto ao fluxo de ar, estresse de cisalhamento, rigidez da matriz extracelular e estiramento cíclico gerado pela respiração. Esses fatores influenciam fortemente o comportamento celular e a remodelação dos tecidos⁵. Portanto, modelos estáticos são insuficientes para replicar processos como adesão de leucócitos, tráfico de células imunes e respostas em tempo real à exposição a medicamentos.

Para enfrentar essas limitações, plataformas organ-on-a-chip surgiram como sistemas avançados para modelar interações celulares complexas. Modelos pulmão em chip integram tecnologia microfluídica com células de origem humana para replicar características estruturais e mecânicas chave do microambiente pulmonar. Essas plataformas permitem a co-cultura de células endoteliais epiteliais das vias aéreas e vasculares pulmonares dentro de um ambiente tridimensional dinâmico que imita mais de perto condições in vivo ⁶. A incorporação de movimentos fisiológicos da respiração, fluxo de fluidos e monitoramento em tempo real aprimora o estudo da comunicação epitelial–endotelial sob condições normais e doentes^7–9.

Apesar desses avanços, a maioria dos sistemas de pulmão em chip existentes depende de células derivadas de doadores^{saudáveis 10}, limitando sua capacidade de modelar interações específicas da doença. Além disso, muitas plataformas não têm flexibilidade para incorporar células derivadas do paciente ou para recriar o complexo microambiente da DPOC. Além disso, protocolos detalhados para co-cultura de células endoteliais primárias das vias aéreas e microvasculares pulmonares — seja de fontes comerciais ou de pacientes com DPOC — utilizando revestimentos de matriz extracelular específica para tipo celular (ECM) continuam limitados.

Neste estudo, uma plataforma microfluídica de dois canais comercialmente disponível para pulmão em chip foi usada para estabelecer dois modelos de co-cultura, compostos por células epiteliais primárias das vias aéreas e células endoteliais microvasculares pulmonares. Um modelo saudável foi gerado usando células comercialmente disponíveis derivadas de diferentes doadores, enquanto um modelo de DPOC foi estabelecido usando células epiteliais e endoteliais das vias aéreas obtidas do mesmo paciente. Ambos os modelos utilizam um revestimento ECM específico para tipo celular para melhor imitar o microambiente pulmonar in vivo. Esses sistemas permitem a investigação de interações epiteliais–endoteliais sob condições fisiológicas e patológicas. Os modelos saudável e de DPOC podem ser usados tanto em combinação para estudos comparativos diretos quanto independentemente para investigações mecanicistas e testes terapêuticos.

Esse sistema de co-cultura reflete a organização anatômica do epitélio das vias aéreas e da vasculatura pulmonar, que funcionam como uma unidade integrada epitelial-endotelial. O epitélio das vias aéreas é uma camada pseudoestratificada composta por células basais, secretoras e ciliadas, localizada acima de uma camada vascularizada de tecido conjuntivo (lâmina própria) e separada do endotélio por uma membrana basal. Neste modelo, o revestimento de ECM (colágeno tipo I, fibronectina e laminina) aproxima a composição das membranas basales epitelial e endotelial. A membrana porosa que separa os dois canais imita o tecido conjuntivo subepitelial, embora não possua complexidade vascular. Múltiplos mecanismos contribuem para a comunicação epitelial–endotelial, incluindo sinalização paracrina, regulação coordenada da permeabilidade, recrutamento de células imunes e respostas a estímulos mecânicos como o estiramento induzido pela respiração, que influenciam a resistência vascular e as vias de mecanotransdução.

Este estudo metodológico descreve as etapas necessárias para estabelecer um epitélio totalmente diferenciado das vias aéreas, cultivado sob condições de interface ar-líquido (ALI) com um endotélio microvascular pulmonar subjacente. O sistema permite a avaliação qualitativa e funcional da integridade da barreira, alcançando valores reprodutíveis de permeabilidade aparente (Papp) ≤ 1 × 10⁻⁶ cm/s. Além disso, protocolos são fornecidos para fenotipagem celular e para a extração e quantificação de RNA de cada compartimento, produzindo consistentemente RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA > 7). Este método não se destina à análise quantitativa de mRNA ou à avaliação detalhada da produção de muco, nem investiga os efeitos do estiramento mecânico, embora tais aplicações sejam viáveis com esse sistema.

Protocolo

Todo o uso de células humanas primárias foi aprovado pelo Comitê Local de Ética de Pesquisa UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). Células bronquiais bronquiais humanas primárias (HBEC) e células endoteliais microvasculares pulmonares (HPMEC) disponíveis comercialmente foram obtidas de dois doadores não fumantes (Tabelas Suplementares 1, 2). Células primárias para o modelo de DPOC foram isoladas de tecido pulmonar explantado de três pacientes com DPOC com histórico de tabagismo (Tabela Suplementar 3), de acordo com um protocolo bem estabelecido (aprovação ética S51577) e armazenadas no biobanco BREATHE. Tanto HBEC quanto HPMEC foram obtidos do mesmo paciente com DPOC.

Para estabelecer o modelo saudável de pulmão em chip, foram usados HBEC e HPMEC comerciais. Para o modelo de DPOC, células endoteliais primárias do epitelio brônquico e microvascular pulmonar foram isoladas de tecido pulmonar explantado obtido do mesmo paciente após transplante pulmonar. O sistema pulmão em chip usado neste estudo é uma plataforma microfluídica de dois canais composta por microcanais paralelos das vias aéreas (superior) e vasculares (inferiores), separadas por uma membrana porosa revestida por matriz extracelular (Figura 1). O mesmo protocolo foi usado para construir modelos saudáveis e de DPOC. Os produtos químicos, reagentes e kits usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento dos modelos de cocultura pulmão em chip sob fluxo laminar

1. Preparação de batatas fritas
   1. Coloque o suporte do chip em um prato de cultura celular quadrado de 120 mm, com os cantos voltados para cima, para garantir a orientação correta, e então coloque os chips no berço. Certifique-se de que todos os chips estejam posicionados corretamente antes da etapa de ativação (Figura 2).
   2. Prepare a solução de ativação dissolvendo o pó do reagente de ativação em seu tampão correspondente, ambos fornecidos pelo fabricante, para obter uma concentração final de 0,5 mg/mL.
   3. Ative as superfícies internas dos canais do chip para promover a fixação da matriz extracelular (ECM) introduzindo cuidadosamente aproximadamente 35 μL da solução de ativação pela entrada inferior do canal. Pipete até a solução começar a sair pela saída do canal inferior. Repita o procedimento introduzindo aproximadamente 50 μL da solução na entrada do canal superior.
      NOTA: O pó do reagente de ativação é sensível à luz. Prepare a solução de ativação imediatamente antes do uso e descarte qualquer solução restante 1 hora após a reconstitução.
   4. Remova todo o excesso de solução de ativação da superfície do chip por aspiração suave. Certifique-se de remover apenas a solução de ativação da superfície do chip — não a aspire pelos canais.
      NOTA: Antes da ativação do ultravioleta (UV), inspecione os canais ao microscópio para detectar bolhas. Se houver alguma, desaloje-as lavando suavemente com solução de ativação até que todas as bolhas sejam removidas.
   5. Expõe os chips a uma lâmpada UV por 10 minutos, depois lave cada canal duas vezes com 200 μL do buffer correspondente.
   6. Pipete uma solução de ativação fresca em ambos os canais conforme descrito acima e expõe os chips à luz UV por mais 5 minutos.
   7. Aspire completamente a solução de ambos os canais, lave cada canal duas vezes com 200 μL de tampão correspondente, depois lave cada canal uma vez com 200 μL de soro salino frio tamponado com fosfato estéril sem Ca²⁺ e Mg²⁺ (DPBS -/-).
   8. Prepare uma solução de revestimento ECM em DPBS (-/-) contendo colágeno humano tipo I (100 μg/mL), fibronectina humana (50 μg/mL) e laminina humana (50 μg/mL). Use 100 μL de solução como volume de referência por chip.
   9. Adicione 50 μL ao canal superior e 35 μL ao canal inferior, enquanto simultaneamente aspira a saída pelos portos de saída.
      NOTA: Inspecione os canais ao microscópio para detectar bolhas. Se houver, lave suavemente com a solução de ECM para removê-los.
   10. Deixe pequenas gotículas de solução de ECM tanto na entrada quanto na saída do canal para evitar a evaporação durante a incubação noturna (ON).
   11. Incube os chips ON a 37 °C com 5% de CO₂. No dia seguinte, aspire a solução de ECM e lave ambos os canais com 200 μL de DPBS pré-aquecido (-/-) a 37 °C.
2. Semeadura celular e cultura submersa
   Expanda a HBEC em frascos^{T25 cm 2} revestidos com colágeno humano tipo IV (150 μg/mL em DPBS (-/-)) usando meio de expansão celular epitelial das vias aéreas até atingir confluência de 60%–70%.
   Paralelamente, expanda HPMEC em^{T75 cm 2} frascos revestidos com gelatina (2 mg/mL em DPBS (-/-)) usando meio de crescimento de células endoteliais (CE) até atingir confluência de 90%–100%.
   Consulte a Tabela Suplementar 4 para a composição dos principais reagentes e meios de cultivo.
3. Semeadura HPMEC
   1. Aspire o meio. Lave as células com 10 mL DPBS (-/-).
   2. Adicione 3 mL de 0,25% de tripsina-EDTA (1X). Incube por 30 s em temperatura ambiente (RT).
   3. Adicione 12 mL de meio de crescimento EC (4× o volume de tripsina utilizado) para inativar a tripsina. Adicione 5 mL de meio de crescimento EC para coletar quaisquer células residuais (volume final = 20 mL).
   4. Confirme o descolamento celular completo ao microscópio.
   5. Use ~20 μL para contar células vivas usando o azul de tripano.
   6. Centrifuge a suspensão da célula remanente a 900 × g por 5 minutos em RT em tubo cônico de 50 mL.
   7. Resuspenda o pellet em meio de crescimento EC. Ajuste para 7 × 10⁶ células/mL.
   8. Semear HPMEC (passagem 5) no canal inferior (~20 μL; 1,4 × 10⁵ células/canal).
   9. Inverta imediatamente os chips e incube por 2 horas a 37 °C com 5% de CO₂ (Figura 3).
   10. Devolva os chips à orientação original.
   11. Lave com meio de crescimento EC morno de 200 μL.
   12. Verifique a fixação sob o microscópio. Estenda a incubação se necessário.
4. Semeamento HBEC
   1. Aspire o meio. Lave com 5 mL de DPBS morno (-/-).
   2. Adicione 1 mL de tripsina. Incube por 5 minutos a 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Monitore o descolamento sob o microscópio.
   4. Adicione 1 mL de inibidor definido de tripsina (DTI) em proporção 1:1 para inativar a tripsina.
   5. Adicione 8 mL de meio de expansão epitelial das células das vias aéreas (volume final = 10 mL).
   6. Transfira para um tubo de 50 mL.
   7. Tome ~20 μL para contagem celular usando o azul de tripano.
   8. Centrifuge a suspensão de célula restante a 200 × g por 5 minutos em RT.
   9. Descarte o supernadante.
   10. Resuspenda o pellet em meio de expansão celular epitelial das vias aéreas. Ajuste para 3,5 × 10⁶ células/mL.
   11. Suplemente o meio de expansão celular epitelial das vias aéreas com ácido retinoico sintético estável à luz e 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico humano recombinante (rhEGF).
   12. Semear HBEC (passagem 2) no canal superior (~35 μL; 1,2 × 10^{células de 5} células/canal).
   13. Incubar por 4 horas a 37 °C com 5% de CO₂ (Figura 4).
   14. Troque o médio em ambos os canais.
   15. Incubar durante a noite (ON) em condições estáticas a 37 °C com 5% de CO₂.
       NOTA: A partir dessa etapa, use apenas meio desgaseificado para todas as etapas. A desgaseificação deve ser realizada com uma unidade Steriflip conectada a um sistema de vácuo para minimizar o risco de formação de bolhas no chip.
5. Conexão com o fluxo
   1. Adicione um meio de expansão epitelial das vias aéreas quente (37°C) suplementado com ácido retinoico sintético estável à luz e rhEGF ao reservatório superior de entrada.
   2. Adicione meio de crescimento EC morno (37°C) ao reservatório inferior da entrada.
   3. Encha cada reservatório de entrada com meio de 3 mL e cada reservatório de saída com 300 μL.
   4. Coloque os módulos portáteis no módulo de cultura (Figura 5).
   5. Pressione o botão para selecionar o ciclo "Prime" usando o disco rotativo.
   6. Pressione o botão para iniciar o ciclo.
   7. Deixe o ciclo rodar (~1 min).
   8. Inspecione a parte inferior de cada módulo em busca de gotículas em todas as quatro portas fluídicas.
   9. Repita o ciclo "Prime" se as gotículas não estiverem visíveis.
   10. Lave ambos os canais de fragmentação uma vez com o meio apropriado.
   11. Deixe uma gota em cada entrada e saída para evitar a formação de bolhas.
   12. Segure o chip na mão dominante e o módulo portátil na outra.
   13. Deslize o chip para dentro dos trilhos até que esteja totalmente assente.
   14. Coloque a unidade montada no módulo de cultura.
   15. Ajuste a vazão para 30 μL/h para ambos os canais usando o mostrador rotativo.
   16. Manter condições de interface líquido-líquido (LLI).
   17. Mantenha os chips no módulo sob interface líquido-líquido (LLI) para permitir a formação uniforme das camadas epitelial e endotelial
   18. Troque o médio a cada 3 dias. Aspire o meio dos reservatórios de saída. Adicione 3 mL de meio fresco em cada reservatório de entrada.
       NOTA: Monitore bolhas no microscópio. Se houver, desconecte o chip, limpe os canais com o meio e reconecte.
6. Diferenciação celular epitelial e cultura da interface ar-líquido
   1. Monitore as células diariamente ao microscópio.
   2. Confirme a formação de uma camada celular epitelial homogênea sem lacunas (tipicamente de 3 a 5 dias).
   3. Estabeleça a interface ar-líquido (ALI).
   4. Aspire o meio dos reservatórios superiores de entrada e saída.
   5. Limpe o meio residual do canal superior aumentando a vazão para 600μL/h usando o mostrador rotativo
   6. Aspire rapidamente o meio a partir dos reservatórios superiores de saída.
   7. Aspire o meio dos reservatórios inferiores da entrada.
   8. Adicione 3 mL de meio diferencial epitelial suplementado com 10 ng/mL de fator endotelial vascular de crescimento (VEGF) e 1 μg/mL de vitamina C.
   9. Configure o canal superior para "ar" usando o disco rotativo.
   10. Ajuste a vazão inferior do canal para 30 μL/h.
   11. Mantenha a cultura ALI por 2 semanas.
   12. Observe o desenvolvimento da diferenciação epitelial ao microscópio.
   13. Confirme a formação de um epitélio pseudoestratificado. Monitore o batimento dos cílios e a produção de muco.
   14. Monitore a morfologia das células endoteliais nas regiões de entrada e saída.

Figura 1: Plataforma microfluídica de pulmão em chip. Seção transversal (esquerda) e vista superior (direita) do dispositivo microfluídico de pulmão em chip de dois canais. As ilustrações esquemáticas são fornecidas apenas para fins ilustrativos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Posicionamento do chip no suporte do chip. Imagem representativa mostrando a orientação correta do suporte do chip e a posição do chip. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Semeadura de células endoteliais no chip microfluídico. Imagens representativas de campo claro das células endoteliais microvasculares pulmonares imediatamente após a semeadura (A) e após 2 horas de incubação (B). Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Semeadura de células epiteliais das vias aéreas no chip microfluídico.
Imagens representativas em campo claro das células epiteliais das vias aéreas imediatamente após a semeadura (A) e após 4 horas de incubação (B). Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Configuração do sistema microfluídico pulmão em chip.
A parte superior da figura mostra o módulo portátil com quatro reservatórios (duas entradas e duas saídas) usados para o fornecimento de meios e coleta de efluentes. O dispositivo microfluídico é conectado a um módulo de cultura que regula as vazões e a um módulo hub que fornece gás, ar e energia. A representação esquemática é fornecida apenas para fins ilustrativos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Avaliação da integridade da barreira

A integridade da barreira foi avaliada de duas maneiras: primeiro, funcionalmente, avaliando a permeabilidade ao dextrano marcado fluorescentemente ao longo do tempo (antes da ALI e após 10 dias de ALI), e segundo, qualitativamente, pela imunodetecção de Zonula Occludens-1 (ZO-1) no epitélio brônquico e da Endotelial-cadherina Vascular (VE-cadherina) no endotélio vascular pulmonar.

1. Função de barreira
   1. Sob o fluxo laminar, adicione 1 mL de meio de diferenciação epitelial suplementado com VEGF e Vitamina C e contendo 100 μg/mL de dextrano marcado fluorescentemente ao reservatório superior de entrada do canal das vias aéreas. Simultaneamente, adicione 1 mL de meio sem traçadores ao reservatório de entrada inferior do canal vascular.
   2. Introduza o meio que contém o traçador no canal superior. Usando o mostrador rotativo, ajuste a vazão em ambos os canais para 600 μL/h por 3 minutos, depois aspire o meio dos reservatórios de saída superior e inferior.
   3. Coloque o chip, conectado ao módulo portátil, de volta no módulo de cultura. Usando o mostrador rotativo, ajuste ambos os canais para uma vazão de 45 μL/h e mantenha essa vazão por 3 horas.
   4. Colete 100 μL de meio dos reservatórios de saída superior e inferior e meça a intensidade de fluorescência usando um leitor de placa.
   5. Calcule a permeabilidade aparente (Papp) usando a equação de permeabilidade:
      
      onde SA representa a área superficial do canal de co-cultura (0,17 cm²), Q_R e Q_D denotam as taxas de fluxo do fluido nos canais dosificadores e receptores, respectivamente (cm³/s), e C_R,0 & C_D,0 correspondem às concentrações recuperadas nos canais de dosagem e receção, respectivamente.
      NOTA: Um valor de Papp abaixo de 1 x ^10-6 cm/s indica forte integridade da barreira, refletindo baixa permeabilidade da camada epitelial ao rastreador. Esse limite é definido pelo fabricante do sistema como uma medida interna de controle de qualidade.
2. Imunodetecção de junções tensas e aderentes
   1. Após 2 semanas de ALI, remova cuidadosamente o chip do módulo portátil.
   2. Fixe as células adicionando 50 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em ambos os canais por 20 minutos em RT.
      ATENÇÃO: O PFA é tóxico; Realize todas as etapas em uma exaustão química certificada.
   3. Lave ambos os canais duas vezes com 200 μL de DPBS (-/-) e armazene os chips a 4 °C até que fiquem manchados.
   4. Permeabilize as células adicionando 50 μL de 0,1% de Triton X-100 em DPBS (-/-) por 5 minutos em RT. Depois, bloqueie com 50 μL 0,1% de Triton X-100 em DPBS (-/-) contendo 10% de soro de cabra, por canal, durante 1 hora em RT.
   5. Incubar o canal superior (epitelial brônquico) com 50 μL do anticorpo primário ZO-1 monoclonal anti-humano de camundongo (1:100), e o canal inferior (endotelial vascular pulmonar) com 50 μL do anticorpo primário monoclonal anti-humano anti-humana VE-cadherina de coelho (1:600).
   6. Diluir ambos os anticorpos em solução de anticorpos (0,1% Triton X-100 em PBS (-/-) com soro de cabra a 1%) e incubar a ON a 4°C em condições estáticas.
   7. Lave os chips três vezes com 200 μL de DPBS (-/-). Em seguida, incubar cada canal por 1 hora na RT com 50 μL de anticorpos secundários conjugados com fluoróforos apropriados, diluídos em solução de anticorpos (1:500): anticorpo secundário anti-camundongo no canal superior e anti-coelho anti-coelho no canal inferior.
   8. Lave ambos os canais três vezes com 200 μL DPBS (-/-). Realize coloração nuclear com 50 μL para cada canal de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1 μg/mL em DPBS (-/-)) por 10 minutos em RT.
   9. Realize uma lavagem final com 200 μL de DPBS (-/-) e armazene o chip em DPBS (-/-) a 4°C no escuro até a imagem.
   10. Fotografe os chips nos coverslips (20x60 mm com espessura de 0,16-0,19 mm) usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com um módulo de disco giratório, uma câmera de alta sensibilidade e uma objetiva 20X (NA 0,8). Use softwares adequados de aquisição e análise de imagens para pós-processamento.

3. Fenotipagem

1. Preparação das seções de lascas
   1. Conserte os chips com 4% de PFA conforme descrito na seção 2.2.2.
   2. Corte o polidimetilsiloxano (PDMS) ao redor do chip usando uma lâmina de barbear.
   3. Preencha ambos os canais com 50 μL de agarose de baixa fusão a 2% em DPBS (-/-), e permita que a agarose solidifique em RT.
   4. Corte o aparo transversalmente em duas metades usando uma lâmina de barbear, incorpore cada metade em um meio de injeção a temperatura de corte ideal (OCT) e armazene a −80 °C até a seção.
2. Criosseção
   1. Prepare um criostato e corte criosseções de 200 μm das metades do chip.
   2. Colete as seções do cavaco com pinças em poços de uma placa de 48 poços cheia de DPBS (-/-) e armazene-as a 4 °C até a imunocoloração.
3. Coloração imunofluorescente
   NOTA: Realize cada etapa na placa de 48 poços, usando 400 μL como volume de referência.
   1. Permeabilize as células e bloqueie a ligação inespecífica conforme descrito anteriormente na seção 2.2.4.
   2. Incubar cada seção ON a 4°C com anticorpos primários específicos para células ciliadas epiteliais (β-tubulina IV, 1:2000) ou para células endoteliais (CD31, 1:25), diluídos em solução de anticorpos (0,1% Triton X-100 em DPBS com 1% de soro de cabra).
   3. Lave as seções três vezes com DPBS (-/-).
   4. Incubar seções por 1 hora em RT com anticorpos secundários anti-camundongos conjugados com fluoróforo (1:500) para β-tubulina IV e CD31, diluídos em solução de anticorpos, protegidos da luz.
   5. Lave as seções três vezes com DPBS (-/-) e realize a coloração nuclear com DAPI (1 μg/mL em DPBS (-/-)) por 10 minutos em RT.
   6. Lave as seções uma vez com DPBS (-/-) antes de montar.
   7. Usando uma pinça, coloque um espaçador em cada lâmina do microscópio e depois coloque uma seção no meio. Adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem e coloque uma cobertura circular.
   8. Deixe secar no escuro no RT, depois veda as bordas do engobe com esmalte transparente.
   9. Armazene as lâminas a 4°C no escuro até a imagem.
   10. Imageie as seções dos chips usando um microscópio de fluorescência invertida, equipado com um módulo de disco giratório, uma câmera de alta sensibilidade e uma objetiva 40X (NA 1,25). Processe imagens usando o software de microscopia apropriado.

4. Extração e quantificação de RNA

1. Coleta de células de chips sob fluxo laminar
   1. Após 2 semanas de cultivo ALI, desconecte os chips dos módulos portáteis e lave ambos os canais duas vezes com 200 μL de DPBS (-/-) pré-aquecido a 37 °C.
   2. Adicione 35 μL de 0,25% de Tripsina-EDTA (1X) às células endoteliais no canal inferior e incube por aproximadamente 30 segundos na RT.
   3. Inspecione as células ao microscópio para confirmar o descolamento completo. Depois, colete a suspensão da célula em um tubo e centrifuge a 900 × g por 5 minutos em RT.
   4. Ressuspenda o pellet celular em 50 μL de reagente de isolamento de RNA à base de fenol e armazene a -80 °C até a extração de RNA.
   5. Adicione 50 μL de reagente de isolamento de RNA à base de fenol diretamente no canal superior para lisar células epiteliais, selar as portas com pontas e incubar no gelo por 3-4 minutos.
   6. Pipetee suavemente para garantir a lise completa, colete o lisado em um tubo e armazene-o a -80 °C até a extração de RNA.
   7. Inspecione ambos os canais sob o microscópio para confirmar a coleta completa da célula.
2. Extração de RNA
   1. Adicione clorofórmio (0,2 volume por 1 volume de reagente isolante de RNA à base de fenol usado para lise; 10 μL por amostra), misture os tubos cuidadosamente agitando e incube no gelo por 2-3 minutos.
   2. Centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para separar as fases e transferir cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo sem perturbar a interfase. Depois, adicione 5 μg de glicogênio livre de RNA à fase aquosa como transportador.
   3. Adicione isopropanol (0,5 volume por 1 volume de reagente de lise; 25 μL por amostra), incube amostras a 4 °C por 10 minutos e centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
   4. Descarte o sobrenadante enquanto retém o pellet de RNA.
3. Lavagem e ressuspensão de RNA
   1. Lave o pellet de RNA com etanol a 75% (1 volume por 1 volume de reagente de lise; 50 μL por amostra), faça o vórtice brevemente e centrifuge a 7.500 × g por 5 minutos a 4 °C.
   2. Descarte o sobrenadante e deixe a pastilha secar ao ar por 5 a 10 minutos.
   3. Ressuspenda o RNA em 30 μL de água livre de RNase por pipeteamento suave e armazene RNA a -80 °C até novo uso.
   4. Avalie a integridade e quantificação do RNA usando um sistema de separação de ácidos nucleicos baseado em microfluídicos em chips.

Resultados

Estabelecimento dos modelos de cocultura pulmão em chip

Imagens em campo claro revelaram adesão e crescimento celular ao longo do tempo no sistema de cocultura pulmão em chip. Células epiteliais das vias aéreas brônquicas proliferaram em cultura submersa na interface líquido-líquido (LLI), formando uma camada uniforme ao longo do canal superior (Figura 6A), enquanto células endoteliais vasculares pulmonares se expandiram para cobrir todo o canal inferior, formando uma monocamada confluente (Figura 6B).

Uma vez estabelecida a cocultura, as células endoteliais foram monitoradas nas regiões de entrada e saída do canal inferior, que são as únicas áreas acessíveis para inspeção microscópica. Como mostrado na Figura 7, as células endoteliais permaneceram viáveis e apresentaram uma morfologia alongada alinhada com a direção do fluxo. Após 14 dias de cultura ALI, a camada epitelial tanto em modelos saudáveis quanto em modelos de DPOC apresentava batidas ciliares visíveis (Vídeo Suplementar). Como esperado, o modelo de DPOC apresentou aumento significativo na produção de muco em comparação com o modelo saudável (Figura 8), recapitulando características-chave da patologia da DPOC.

Figura 6: Co-cultura de células epiteliais e endoteliais das vias aéreas no dispositivo microfluídico.
Imagens representativas das células epiteliais brônquicas primárias na superfície superior (A) e das células endoteliais microvasculares pulmonares primárias na superfície inferior (B) da membrana porosa sob condições de interface líquido-líquido (LLI). Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Células endoteliais no canal microfluídico inferior durante a interface ar–líquido.
Imagens representativas de campo claro mostrando células endoteliais microvasculares pulmonares na entrada (superior) e saída (inferior) do canal inferior durante a interface ar-líquido (ALI). Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Acúmulo de muco no canal das vias aéreas.
Imagens representativas mostrando a produção de muco após 14 dias de interface ar-líquido (ALI) em modelos saudáveis (A) e COPD (B). A camada marrom no compartimento das vias aéreas representa o acúmulo de muco. Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação quantitativa da integridade da barreira

A avaliação funcional da integridade da barreira mostrou menor permeabilidade aparente (Papp) tanto em modelos saudáveis quanto em modelos de DPOC em comparação com o controle positivo (chip revestido com ECM sem células) (Figura 9).

Na ausência de células, valores altos de Papp indicaram formação mínima de barreiras. Em contraste, na presença de camadas epiteliais e endoteliais, o traçador fluorescente de dextrano não cruzou a MEC, resultando em uma permeabilidade marcadamente reduzida e indicando uma barreira forte. Esse efeito foi observado tanto antes da ALI quanto após 10 dias de ALI, demonstrando que a função da barreira é estabelecida precocemente durante a diferenciação.

Como mostrado na Figura 10, no modelo saudável, os valores médios de Papp antes da ALI já estavam abaixo do limiar indicativo de integridade robusta da barreira (1 × 10⁻⁶ cm/s) e diminuíram ainda mais durante a cultura da ALI. No modelo de DPOC, os valores médios de Papp também estavam dentro da faixa de barreira forte antes da ALI e, embora tenham aumentado levemente após 10 dias de ALI, a integridade da barreira permaneceu robusta.

Figura 9: Avaliação da função de barreira no modelo pulmão em chip.
Permeabilidade aparente (Papp) medida em chips revestidos a ECM sem células (controle positivo para vazamento; preto), e em modelos saudáveis (rosa) e de cocultura de DPOC (verde) antes e após 10 dias de interface ar-líquido (ALI). Cada ponto representa um chip individual. O modelo saudável inclui células de doadores separados, enquanto o modelo de DPOC utiliza células derivadas de um único paciente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Comparação da função da barreira em modelos saudáveis e de DPOC.
Permeabilidade aparente (Papp) medida antes e depois de 10 dias de interface ar–líquido (ALI) em modelos de cocultura saudáveis (esquerda) e DPOC (direita). Cada ponto representa um chip individual. Os valores são médios ± SD. O modelo de DPOC inclui células de três pacientes, enquanto o modelo saudável combina células de diferentes doadores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Imunodetecção de junções tensas e aderentes

A análise de imunofluorescência confirmou a organização estrutural das proteínas juntorais. O ZO-1 mostrou localização contínua ao longo das bordas das células epiteliais brônquicas, indicando uma barreira epitelial intacta (Figura 11A). De forma semelhante, a coloração por VE-cadherina revelou distribuição uniforme nas junções endoteliais, consistente com uma monocamada endotelial confluente. As células endoteliais apresentaram uma morfologia alongada alinhada com a direção do fluxo (Figura 11B).

Não foram observadas diferenças entre os modelos saudáveis e de DPOC na localização das proteínas de junção apertada e aderente. Esses achados são consistentes com os dados da barreira funcional, apoiando a presença de uma interface epitelial–endotelial fisiologicamente relevante, com integridade juntoral preservada em ambos os modelos.

Figura 11: Expressão de proteínas juncionais no modelo de cocultura pulmão em chip.
Imagens de imunofluorescência em vista superior obtidas após 14 dias de interface ar-líquido (ALI) mostrando localização de ZO-1 no compartimento epitelial das vias aéreas (A) e localização de VE-cadherina no compartimento endotelial (B). Núcleos são corados com DAPI. A seta indica a direção do fluxo. Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fenotipagem

A coloração imunofluorescente das criosseções em chip revelou células positivas para β-tubulina IV no lado apical da membrana, indicando diferenciação das células epiteliais das vias aéreas em células ciliadas, uma característica definidora do epitélio brônquico maduro (Figura 12A). A coloração CD31 confirmou a presença de uma monocamada endotelial confluente ao longo do lado basal da membrana (Figura 12B). Esses resultados demonstram que o sistema de cocultura apoia o estabelecimento de fenótipos epiteliais e endoteliais fisiologicamente relevantes em ambos os modelos.

Figura 12: Imagens de imunofluorescência de seções transversais pulmão em chip. Coloração imunofluorescente representativa das seções transversais do chip após 14 dias de interface ar–líquido (ALI) mostrando expressão de β-tubulina IV no compartimento epitelial das vias aéreas (A) e expressão de CD31 no compartimento endotelial (B). Núcleos são corados com DAPI. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Extração e quantificação de RNA

RNA isolado de células epiteliais das vias aéreas produziu concentrações variando de 59 a 135 ng/μL, com Números de Integridade do RNA (RIN⁾¹¹ de 7,4–9,6, enquanto o RNA de células endoteliais microvasculares variou de 12 a 46 ng/μL, com valores de RIN de 9,6–10, em ambos os modelos. Os dados indicaram que ambos os modelos alcançaram quantidades suficientes de RNA de alta qualidade, adequadas para análises moleculares posteriores.

Tabela Suplementar 1: Informações sobre doadores para as células epiteliais das vias brônquicas. A tabela representa as células epiteliais das vias brônquicas usadas no modelo saudável. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Informações sobre doadores para as células endoteliais microvasculares pulmonares. Informações sobre doadores para células endoteliais microvasculares pulmonares usadas no modelo saudável. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Informações do paciente. A tabela representa informações para células endoteliais epiteliais das vias aéreas e microvasculares pulmonares usadas no modelo de DPOC. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Visão geral dos principais reagentes e meios de cultura usados no protocolo.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Batidas ciliares no canal das vias aéreas (modelo saudável).
Vídeo representativo mostrando batidas ciliares após 14 dias de interface ar-líquido (ALI). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 2: Batidas ciliares no canal das vias aéreas (modelo DPOC).
Vídeo representativo mostrando batidas ciliares após 14 dias de interface ar-líquido (ALI). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para estabelecer um sistema de cocultura pulmão em chip, a fim de gerar tanto um modelo saudável, usando células endoteliais bronquiais e microvasculares pulmonares comercialmente disponíveis, quanto um modelo de DPOC usando células derivadas de pacientes provenientes de pulmões explantados. Em ambos os modelos, os dois tipos celulares são separados por uma membrana porosa e extensível revestida com matriz extracelular específica do tipo celular (ECM), permitindo um microambiente que se assemelha mais ao pulmão in vivo . O protocolo também inclui métodos para avaliar a integridade da barreira, fenotipagem celular e extração de RNA de cada compartimento. Ambos os modelos foram mantidos com sucesso sob condições dinâmicas de perfusão e interface ar-líquido (ALI), resultando em uma barreira epitelial-endotelial fisiologicamente relevante com um epitélio das vias aéreas pseudoestratificado totalmente diferenciado. Células endoteliais alinhadas com a direção do fluxo, conforme observado in vivo, e RNA de alta qualidade foi obtido de ambos os compartimentos.

Vários passos críticos são essenciais para estabelecer esse sistema de cocultura com sucesso. É necessária uma semeadura precisa das células epiteliais para alcançar uma cobertura uniforme, pois a distribuição não uniforme pode resultar em cobertura superficial incompleta e formação comprometida de barreiras. Nesses casos, o compartimento apical deve ser suavemente aspirado e as células epiteliais resemeadas. O estabelecimento da ALI deve ser realizado apenas quando ambas as camadas epitelial e endotelial formam monocamadas contínuas, pois a exposição precoce à ALI pode levar ao vazamento do meio vascular para o compartimento das vias aéreas e à diferenciação comprometida. Se a confluência não for alcançada, a criação do ALI deve ser adiada.

Remoção incompleta do meio apical ou exposição inconsistente à ALI pode levar à maturação epitelial heterogênea. O meio residual no canal superior pode ser removido aumentando a vazão para 600 μL/h por 3–4 minutos. A formação de bolhas, que interrompe a perfusão e afeta a viabilidade celular, pode ocorrer devido a equilíbrio insuficiente. As bolhas podem ser removidas aumentando temporariamente o fluxo para 600μL/h por 3-4 minutos ou, se persistentes, desconectando o chip e deslocando-as manualmente usando uma pipeta. No modelo de DPOC, a produção excessiva de muco pode obstruir o canal das vias aéreas e prejudicar a perfusão; nesses casos, recomenda-se uma lavagem suave com DPBS seguida do restabelecimento da ALI.

A maioria dos sistemas existentes de co-cultura que combinam células epiteliais das vias aéreas e endoteliais pulmonares dependem de células primárias comercialmente disponíveis e revestimentos genéricos de MEC, como colágeno ou^{fibronectina 10,12}. Embora esses suportem a adesão, eles reproduzem apenas parcialmente as propriedades bioquímicas e mecânicas da interface via aérea–vascular. Em contraste, o sistema atual emprega revestimentos ECM específicos para tipo celular, proporcionando um microambiente que imita mais de perto o tecido pulmonar^{humano 13}.

A função da barreira é comumente avaliada usando resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TEER), embora esse método possa ser influenciado pela organização epitelial^{multicamadas 14}. Neste estudo, a permeabilidade ao dextrano foi usada para avaliar a integridade funcional. Os valores observados de Papp estavam abaixo do limiar para forte integridade da barreira (1 × 10⁻⁶ cm/s), indicando uma interface robusta epitelial–endotelial. O epitélio das vias aéreas apresentou características de diferenciação, incluindo batidas ciliares e produção de muco, juntamente com localização contínua de ZO-1 e VE-cadherina nas junções celulares. Além disso, RNA de alta qualidade foi consistentemente obtido em ambos os compartimentos, permitindo análises específicas de célula a jusante a jusante.

Um avanço chave desse trabalho é o desenvolvimento de um modelo de pulmão em chip para DPOC, no qual células epiteliais e endoteliais derivam do mesmo paciente. Até o conhecimento recente, uma cocultura tão compatível com pacientes não havia sido relatada anteriormente. Estudos anteriores incorporaram células epiteliais derivadas da^{DPOC 7,8}, mas basearam-se em células endoteliais de origem comercial, limitando a investigação das interações epiteliais específicas da doença. O modelo atual supera essa limitação ao preservar as interações celulares específicas do paciente.

O modelo de DPOC recapitulou características-chave da doença, incluindo o aumento da produção de^{muco 3}, mantendo o alinhamento endotelial e a integridade da junção sob fluxo. Importante destacar que a co-cultura de células epiteliais e endoteliais derivadas do paciente não comprometeu a função ou viabilidade da barreira, apesar do aumento da produção de muco. O sistema permaneceu estável sob condições de AL e perfusão contínua, apoiando seu uso em estudos de longo prazo. Além disso, a plataforma permite um estiramento mecânico, aumentando ainda mais sua relevância fisiológica.

Uma força importante desse fluxo de trabalho é a capacidade de avaliar condições saudáveis e de DPOC dentro da mesma plataforma sob parâmetros experimentais comparáveis. Isso permite a avaliação direta das diferenças associadas à doença na diferenciação epitelial, função endotelial e integridade da barreira. Os modelos também podem ser usados de forma independente, dependendo da questão de pesquisa. O modelo saudável é adequado para estudos mecanicistas e modulação de vias, enquanto o modelo de DPOC oferece uma plataforma para avaliação terapêutica e testes de drogas. A capacidade de extrair RNA de alta qualidade de cada compartimento separadamente possibilita ainda mais o perfilamento molecular específico do tipo celular. O uso de células pareadas com pacientes no modelo de DPOC preserva interações relevantes para a doença que, de outra forma, seriam perdidas ao combinar fontes celulares não relacionadas.

Apesar dessas vantagens, várias limitações devem ser consideradas. O uso de sistemas pulmão em chip requer equipamentos especializados e expertise técnica, o que pode limitar a acessibilidade. Além disso, o modelo atualmente não inclui outros tipos celulares pulmonares relevantes, como células imunes ou estromais, que podem influenciar respostas a patógenos e medicamentos. No entanto, a plataforma pode ser adaptada para incorporar células imunes circulantes, permitindo a investigação de suas interações com compartimentos epiteliais e endoteliais. O acesso ao material de DPOC derivado do paciente também pode ser limitado, e a variabilidade entre pacientes pode afetar a reprodutibilidade. Além disso, a produção excessiva de muco pode interferir na perfusão.

O impacto do alongamento mecânico cíclico não foi investigado neste estudo, mas representa uma direção futura importante. A membrana extensível permite a simulação das forças mecânicas associadas à respiração, que são conhecidas por influenciar a função celular, o reparo e a homeostase ^15,16. Estudos anteriores mostraram que a tensão mecânica pode aumentar a absorção e o transporte de nanopartículas através da barreira^{epitelial 10}.

Em conclusão, os modelos saudáveis e de DPOC pulmão em chip apresentados aqui fornecem uma plataforma fisiologicamente relevante para estudar as interações epitelial-endoteliais na saúde e doença. A natureza dinâmica do sistema permite um controle preciso das condições de fluxo e apoia aplicações como testes de drogas e estudos de exposição a patógenos. Esse protocolo oferece uma alternativa robusta aos modelos tradicionais in vitro e animais e representa uma ferramenta valiosa para o avanço da pesquisa respiratória translacional.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% trypsin-EDTA (1X)  (para células endoteliais)	Gibco	25200-056	Usado para dissociação enzimática de células endoteliais microvasculares pulmonares.
Prato de cultura de células quadrado de 120 mm x 120 mm	VWR	688161	Usado para segurar o suporte do chip durante a preparação e manuseio do chip.
Bioanalyzer 2100	Agilent	G2939A	Usado para avaliar a qualidade e integridade do RNA.
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516	Usado para precipitar o RNA durante a extração.
4′,6-diamidino-2-fenilindo (DAPI)	Invitrogen	D1306	Usado para colorir os núcleos das células durante a imunofluorescência.
Tubos cônicos de 50 mL	Cellstar	227261	Usado para coleta de células, centrifugação e preparação de suspensões celulares.
Kit Agilent RNA 6000 Nano	Agilent	5067-1511	Usado para análise da qualidade do RNA com o Bioanalyzer.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Usado para prevenir contaminação fúngica durante o cultivo celular.
Contador automático de células	NanoEntek	EVE PLUS	Usado para determinar a concentração e viabilidade das células antes da semeadura.
Placas multipoço para cultura celular, 48 poços, estéreis	Falcon	353078	Usado para segurar as seções transversais durante os procedimentos de coloração.
Centrífuga	Hettich	320R	Usado para sedimentar as células antes da semeadura.
Suporte do Chip	Emulate	support@emulatebio.com	Usado para apoiar e segurar os chips durante a ativação da superfície, revestimento e semeadura de células.
Cloreto de cloro	Sigma-Aldrich	366927	Usado para separação de fases durante a extração de RNA.
Módulo de disco rotativo Cicero	CrestOptics S.p.A.		Usado para realizar imagens de fluorescência confocal de alta velocidade.
Lâminas de cobertura	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	Usado para apoiar os chips durante a imagem confocal. Descrição: 24 x 60 mm, #1.5
Criostato	Thermo Fisher Scientific	NX70	Usado para secionar amostras incorporadas em OCT.
Módulo de cultura (Zoë-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	Usado para controlar as condições ambientais para o cultivo celular dentro do sistema microfluídico.
Inibidor de tripsina definido (DTI)	Thermo Fisher	R007100	Usado para neutralizar a atividade da tripsina após a dissociação das células epiteliais.
Dextrana Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	Usado como um traçador fluorescente para avaliar a permeabilidade da barreira.
Kit de Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV2	PromoCell	C-22022	Usado para manutenção e expansão de células endoteliais microvasculares pulmonares.
Reagente de ativação de superfície ER-1  (reagente de ativação sensível à luz em pó)	Emulate	support@emulatebio.com	Usado para ativar as superfícies do chip para revestimento subsequente.
Reagente de ativação de superfície ER-2  (tampão)	Emulate	support@emulatebio.com	Usado como um tampão durante a ativação da superfície do chip.
Etanol absoluto	Thermo Fisher Scientific	437433T	Usado para lavar os pellets de RNA durante a extração.
Leitor de placas fluorescente	Agilent	Leitor de microplacas BioTek Sinergy H1	Usado para medir a intensidade de fluorescência para ensaios de permeabilidade.
Gelatrina de pele bovina	Sigma-Aldrich	G9391	Usado para revestir superfícies de cultura para promover a adesão de células endoteliais.
Alexa Fluor 488 Anti-Rato (para ZO-1 e β-tubulina IV)	Thermo Fisher	A11001	Usado para detectar anticorpos primários de camundongo com fluorescência verde.
Alexa Fluor 594 Anti-Rato (para CD31)	Thermo Fisher	A11005	Usado para detectar anticorpos primários de camundongo com fluorescência vermelha.
Alexa Fluor 555 Anti-Coelho (para VE-cadherina)	Thermo Fisher	A21429	Usado para detectar anticorpos primários de coelho com fluorescência laranja-vermelha.
Módulo de hub (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	Usado para fornecer gás e energia ao módulo de cultura.
Células epiteliais brônquicas humanas (HBEC)	Lonza	CC-2540S	Usado como células epiteliais das vias aéreas para estabelecer o modelo de co-cultura saudável.
Colágeno humano  IV	Sigma	C5533	Usado para revestir frascos T25 para promover a adesão das células epiteliais.
Colágeno humano tipo I	Advanced Biomatrix	5007	Usado como componente da solução de matriz extracelular para revestimento do chip.
Fibronectina humana	Sigma-Aldrich	F0895	Usado como componente da solução de matriz extracelular para revestimento do chip.
Laminina humana	Sigma -Aldrich	L4544	Usado como componente da solução de matriz extracelular para revestimento do chip.
Células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HPMEC)	PromoCell	C-12281	Usado como células endoteliais microvasculares pulmonares para estabelecer o modelo de co-cultura saudável.
fator de crescimento epidérmico humano recombinante (hrEGF)	PromoCell	C-60182	Usado para promover a proliferação de células epiteliais.
Solução concentrada de hidrocortisona	StemCell Technologies	7925	Usado como suplemento no meio de cultura para suportar a diferenciação das células epiteliais das vias aéreas.
ImageJ	Fiji software	versão ImageJ 1.54p	Usado para processar e analisar imagens adquiridas.
Microscópio invertido para cultura celular	Leica Microsystems	DMi1	Usado para monitorar a morfologia e a confluência das células durante o cultivo.
iSpacer	SUNJin Lab	IS307	Usado para criar uma câmara definida para montagem de amostras durante a imagem. Espessura: 0,3 mm.
Câmera Kinetix	Teledyne Photometrics		Usado