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Artigo de método

Avaliações de Oxigenação e Perfusão Vascular em Modelos Pré-clínicos de Câncer e Cicatrização de Feridas Usando OS-DCE OAI

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DOI:

10.3791/70689

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7 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar a Imagem Optoacústica Sensível ao Oxigênio – Imagem Optoacústica Aprimorada por Contraste Dinâmico (OS-DCE OAI) para avaliação de modelos pré-clínicos de câncer e cicatrização de feridas. O OAI pode imagear oxi- e desoxihemoglobina, mapeando a oxigenação dos tecidos. O DC-OAI pode imagear a farmacocinética de um agente de contraste exógeno, mapeando assim a perfusão vascular.

Resumo

A imagem optoacústica sensível ao oxigênio (OS OAI) e a imagem optoacústica dinâmica com contraste (DCE OAI) fornecem leituras complementares e não invasivas da fisiologia tecidual. O OAI utiliza a detecção multiespectral de oxihemoglobina e desoxihemoglobina endógenas para gerar mapas de saturação de oxigênio no sangue (%sO₂), enquanto o OAI DCE acompanha a farmacocinética in vivo de um absorvedor no infravermelho próximo para quantificar a perfusão vascular e a permeabilidade. O objetivo deste protocolo é apresentar um fluxo de trabalho unificado OS-DCE OAI que permita a avaliação simultânea da oxigenação e perfusão em dois ambientes pré-clínicos amplamente utilizados: tumores ortotópicos de câncer de mama e feridas cutâneas de espessura total.

Neste protocolo, demonstramos OAI de modelos de camundongos de câncer de mama ou ferida de laceração. Para OS OAI, varreduras multiespectrais multi-fatias são adquiridas entre 700–875 nm para permitir a desmistura espectral e a estimativa de %sO₂. Para DCE OAI, aquisições repetidas em resolução temporal ≤5-s são realizadas antes e depois da injeção intravenosa de bolus de indocianina verde (ICG), usando amostragem multiespectral em 700-875 nm ou amostragem de comprimento de onda único em 800 nm para gerar curvas de amplitude do sinal OA em função do tempo. O desenvolvimento de modelos animais, preparação para imagem de OA, aquisições de OAI OS e DCE OAI, e análises para medir características de oxigenação e perfusão vascular são detalhados, juntamente com orientações principais para resolução de problemas para artefatos de movimento, absorventes superficiais e injeções falhadas.

Juntos, esse protocolo OS-DCE OAI fornece um retrato funcional integrado da hipóxia e do transporte vascular que pode detectar mudanças fisiológicas em tumores e feridas antes das medidas anatômicas grosseiras. O OS-DCE OAI é facilmente adaptável a outros modelos de doença.

Introdução

A imagem optoacústica (IAO), também chamada de imagem fotoacústica ou tomografia optoacústica multiespectral, é uma modalidade relativamente nova que combina excitação óptica com detecção por ultrassom (US) para permitir a imagem de tecidosprofundos 1,2. Na OAI, pulsos de laser de nanossegundos curtos excitam cromóforos endógenos como oxi- e desoxihemoglobina, produzindo expansão termoelástica localizada e ondas acústicas de banda larga detectadas por transdutores dos EUA. Esses sinais permitem que a OAI produza imagens com contraste óptico em resolução espacial semelhante à de ultrassom, enquanto alcançam profundidade de visão em escala de centímetros in vivo. Quando os dados são adquiridos em múltiplos comprimentos de onda e analisados com desmistura espectral, a OAI sensível ao oxigênio (OS) pode estimar concentrações relativas de oxi- e desoxihemoglobina e, assim, inferir a saturação de oxigênio dos tecidos (%sO₂)2. A saturação de oxigênio no sangue fornece uma avaliação funcional da fisiologia microvascular que é difícil de acessar de forma não invasiva com outros métodos.

A perfusão vascular também é útil para avaliações da fisiologia microvascular. A perfusão vascular representa uma combinação de fluxo vascular, permeabilidade e área da superfície dovaso 3. Para quantificar a perfusão, a IAO pode ser usada com um agente de contraste exógeno para realizar a OAI Dinâmica Aprimorada por Contraste (DCE OAI). Nessa abordagem, a imagem temporal antes, durante e após a injeção do agente de contraste monitora a farmacocinética (PK) do agente. Esses resultados podem ser modelados para medir a taxa de lavagem (NKtrans) do compartimento plasmático sanguíneo para o compartimento extravascular extravascular tumoral, e a taxa de lavagem (kep) do compartimento extravascular extravascular tumoral para o compartimento plasmático. Desenvolvemos um método de modelagem PK que evita o notório problema da fluência da luz (ou seja, espalhamento e absorção em tecidos que causam energia radiante variável através do tecido)4. Nosso método normaliza a mudança do sinal dinâmico de OAI de 0% (pré-injeção) para 100% (realce máximo) e então usa equações diferenciais para estimar a taxade wash-in da trans NK e o kep. Outros estudos da DCE OAI utilizaram métodos padrão de modelagem PK que sofrem da principal suposição de que a fluência da luz é uniforme em todo otecido 5,6.

Os resultados do OAI do DCE também podem ser usados para avaliar taxas de lavagem por meio de medições empíricas de Realce Máximo de Sinal (MSE), Tempo até o Pico (TTP) para atingir o MSE, inclinação (tipicamente para injeção em TTP) e Área Inicial Sob a Curva (IAUC; novamente tipicamente para injeção em TTP após a injeção)7. Deve-se notar que, se a TTP ocorrer mais tarde na curva PK, a inclinação ou IAUC pode ser tomada durante a parte linear da curva ou desde o momento da injeção até 1 minuto após a injeção. Demonstramos que medições empíricas também podem ser úteis ao avaliar tratamentos administrados a modelos tumorais ou ao avaliar cicatrização deferidas 8,9. Outros estudos também mostraram valor em usar medições empíricas para avaliar a permeabilidade vascular tumoral e a fibrosehepática 10,11. A forma da curva PK também pode ser usada para categorizar qualitativamente a perfusão vascular tumoral como alta ou baixa 12,13,14.

Além disso, o sinal OAI em um único ponto de tempo pós-injeção pode ser usado como uma avaliação empírica da perfusão, conhecida como OAI Contrast Enhanced Não Dinâmico (CE OAI)15. Uma imagem de OA de CE que mostra um tumor ou ferida brilhante é simples e altamente visual, mas frequentemente é usada apenas para avaliação qualitativa de perfusão alta versus baixa. Em geral, a mudança dinâmica nos sinais de OAI após a TTP não é analisada para avaliar empiricamente a perfusão vascular em tumores. No entanto, como mostrado abaixo, as taxas de lavagem em ferimentos são extremamente rápidas, de modo que NKtrans, TTP, slope e IAUC são difíceis de medir. Portanto, usamos a inclinação linear ou exponencial da fase de lavagem como medida empírica da perfusão vascular em feridas9.

A maioria dos agentes OAI absorve na faixa de comprimentos de onda do infravermelho próximo (NIR), que pode penetrar mais profundamente nos tecidos16,17. No entanto, a absorção de água em comprimentos de onda maiores que 900 nm limita a faixa de comprimentos de onda OAI utilizável in vivo a 700–900 nm para a maioria dasaplicações 2. O verde de Endocianina (ICG) é um agente prototípico da DCE OAI porque oferece forte absorção de NIR em 780–800 nm, produz um sinal de OAI moderadamente forte e possui biocompatibilidade favorável com aprovação da FDA para uso clínico. Essas características possibilitam contraste intravascular e curvas PK interpretáveis.

Desenvolvemos um protocolo combinado OS-DCE OAI para avaliar oxigenação e perfusão vascular em modelos pré-clínicos de tumores sólidos e feridas 8,9. A parte OS deste protocolo pode avaliar a oxigenação em múltiplas fatias de imagem que cobrem volumes inteiros de tumores e feridas em modelos de camundongo. A parte DCE do nosso protocolo tem a opção de capturar uma única fatia do tumor ou ferida usando múltiplos comprimentos de onda de laser (melhorando a precisão da detecção de agentes de contraste), ou para capturar até 5 fatias com um único comprimento de onda do laser (melhorando a cobertura espacial). Usamos OS-DCE OAI para monitorar a mudança na oxigenação e perfusão vascular após o tratamento de um modelo tumoral com radioterapia ou com combretastatina A4 fosfato, um agente disruptorvascular 4,8. Também usamos o OS-DCE OAI para monitorar cicatrização deferidas 9. O DCE OAI dá à OAI a capacidade de monitorar a progressão por meio da perfusão vascular, que pode ser aplicada a uma variedade de doenças.

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Protocolo

Realize todos os procedimentos sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da sua instituição. Todos os procedimentos do protocolo abaixo foram aprovados pela IACUC da nossa instituição.

1. Anestesia (para procedimentos subsequentes)

  1. Induza anestesia. Inicialmente induza e mantenha anestesia com 5% de isoflurano em gás 100% de transporte de oxigênio até que o camundongo não esteja mais acordado.
  2. Mantenha a anestesia. Continue anestesiando o camundongo com 1,5–2% de isoflurano em gás 100% de transporte de oxigênio. Verifique a ausência de reflexo pedal.
  3. Mantenha a normotermia. Certifique-se de manter os animais em uma superfície quente e monitore a temperatura durante todo o período de anestesia.
    NOTA: (Ponto de pausa) Prossiga para a implantação do tumor ou formação da ferida assim que o animal estiver totalmente anestesiado.

2. Preparando o modelo

NOTA: Todo trabalho celular deve ser realizado em um gabinete de biossegurança para evitar exposição e possível contaminação.

  1. Estabeleça um modelo tumoral ortotópico 4T1 (Figura 1).
    1. Prepare células no gelo: Resuspenda 4 células T1 em PBS gelado a uma concentração de 2 × 107 células/mL.
    2. Misture células com matriz: Combine a suspensão celular 1:1 (v/v) com hidrogel biológico gelado que possui uma matriz extracelular rica. A combinação deve resultar em uma solução de células a 1 × 107 células/mL.
    3. Carregue a seringa: Coloque a mistura celular em uma seringa de laboratório estéril com volume no máximo 1,0 mL. Limite o volume a 100 μL por injeção (1 × 106 células). Como opção, aqueça suavemente a seringa a 30 °C, o que torna o hidrogel biológico levemente viscoso e mais focalmente retido no local da injeção.
      ATENÇÃO: Tenha cuidado que as seringas são afiadas e evite recaptar.
    4. Anestesiar o camundongo conforme descrito na seção 1.
    5. Remova o pelo, se houver: Despilhe a área do peitorão. Omita essa etapa se usar camundongos nus atímicos.
    6. Posicione a agulha e injete: Esterilize a 4ª almofada de gordura mamária inguinal. Insira a agulha com bisel para cima e injete lentamente 100 μL na almofada de gordura para evitar refluxo.
    7. Recupere o animal da anestesia: Coloque o rato de volta em uma gaiola aquecida e monitore até que ele esteja andando.
    8. Deixe o tumor crescer: Espere de 8 a 10 dias para que os tumores 4T1 atinjam um diâmetro mínimo de 0,3 cm antes da imagem.
      NOTA: Tumores com diâmetro maior também podem ser capturados por imagem. O diâmetro do tumor pode ser medido com um calibre vernier calibrado. Tumores que excedam o diâmetro máximo aprovado pela IACUC (ou um comitê institucional equivalente) devem ser eutanasiados. Siga a injeção ortotópica e adapte o número/volume de células ao protocolo de entralto desejado.
  2. Geração de uma ferida excisional em um camundongo (Figura 2)
    1. Prepare o campo cirúrgico: Esterilize a área de trabalho e os instrumentos.
    2. Anestesiar o camundongo conforme descrito na seção 1.
    3. Remova o pelo se presente: Depilar a região dorsal. Omita essa etapa se usar camundongos nus atímicos.
    4. Administre analgesia: Fixe o camundongo em uma superfície cirúrgica estéril. Injetar buprenorfina 0,05–0,1 mg/kg subcutânea (SC) na região dorsal.
    5. Desinfete a área da ferida: Desinfete a pele dorsal com povidona-iodo seguido de 70% de etanol.
    6. Crie uma ferida de excisão: Use um punção de biópsia de 6 mm para delinear o local. Retirar a pele e o pânnico carnoso para formar um defeito de espessura total.
    7. Coloque a tala de silicone:
      1. Coloque uma tala de silicone em forma de rosquinha ao redor do ferimento. Certifique-se de que o diâmetro interno da fenda seja 2–4 mm maior que o diâmetro da ferida, e que a largura da tala seja ~5 mm.
      2. Corte uma tala de silicone em formato de rosquinha a partir de uma folha de material de silicone. Use um material transparente para sutura para costurar a tala no lugar. Se necessário, use um filme adesivo fino para encaixar o anel.
        NOTA: Materiais pigmentados para suturas podem absorver luz NIR e, portanto, não devem ser usados.
    8. Suture a tala: Coloque oito pontos interrompidos espaçados uniformemente para fixar a tala à pele ao redor sem estrangulamento.
    9. Aplique um curativo oclusivo: Cubra a ferida e a tala com um curativo oclusivo para proteger a cama e padronizar o ambiente da ferida.
    10. Recupere o animal da anestesia: Coloque o rato de volta em uma gaiola aquecida e monitore até que ele esteja andando.
    11. Permita que o animal se recupere: Continue cuidando diariamente e avaliando conforme o desenho do estudo ou até que a ferida esteja completamente cicatrizada.
    12. Substitua o curativo todos os dias: Substitua o curativo oclusivo diariamente após imagens ou fotografias para limitar a contaminação e manter a esterilidade.
      NOTA: (Passo crítico) Imobilize a ferida para suprimir a contração e promover a reepitelialização, melhorando a relevância translacional para a cura humana. (Ponto de pausa) Após aplicar o curativo, faça uma pausa até a próxima avaliação ou sessão de imagem agendada.

3. Protocolos de aquisição OS-DCE OAI

  1. Prepare um rato e o agente de contraste para a varredura OAI.
    1. Prepare o agente de contraste.
      1. Prepare uma solução de 1,62 mM do agente de contraste ICG em água estéril. Filtre a solução com um filtro de seringa de 0,3 μm. Encha uma seringa de laboratório estéril com 100 μμL dessa solução.
        NOTA: Essa dose é de 162 nmol ou 125,5 μμg baseada em um peso molecular de ICG de 775 g/mol. A dose é de 6,28 mg/kg de peso corporal de camundongo, considerando que um camundongo pesa aproximadamente 20 g. Uma dose equivalente animal é 12,3 vezes maior que uma dose equivalente humana18. Portanto, a dose equivalente humana é de 0,51 mg/kg de peso corporal humano. A dose máxima tolerada para humanos é de 2 mg/kg 19. Portanto, a dose utilizada neste estudo pré-clínico é aproximadamente 1/4 da dose máxima tolerada em humanos.
    2. Prepare o scanner OAI.
      1. Encha o tanque de imagem com água deionizada e destilada. Ajuste a temperatura do aquário para 36 °C para um camundongo com <25 g de peso corporal.
        NOTA: A temperatura desse aquário manterá a temperatura central do corpo próxima a 37 °C porque o rato é enrolado em um saco plástico no berço. A temperatura do aquário deve ser ajustada para 35 °C para um camundongo maior com >25 g de peso corporal para evitar superaquecimento, pois um camundongo maior possui mais tecido adiposo subcutâneo que atua como camada isolante.
    3. Anestesiar o camundongo conforme descrito na seção 1. No restante do protocolo de aquisição, certifique-se de que o camundongo permaneça anestesiado com 1,5–2% de isoflurano em gás portador de oxigênio 100%.
    4. Se estiver realizando DCE OAI, coloque acesso venoso.
      1. Lave um cateter caudal de 27 G com soro fisiológico heparinizado. Insira o cateter em uma veia lateral da cauda e fixe o cateter para evitar que ele se desfaça da veia caudal (Figura 3A). Certifique-se de que não haja bolhas de ar.
        NOTA: (Passo crítico) Use soro fisiológico heparinizado para manter a permeabilidade do cateter.
      2. Além disso, prepare uma seringa de laboratório estéril com volume no máximo 500 μL que possa se conectar ao cateter. Certifique-se de que a seringa contenha 100 μL de 2,14 mM ICG (~322 nmol; ~16 μmol/kg para um camundongo de 20 g).
    5. Cubra o camundongo e o embalo com gel de ultrassom (Figura 3B).
      1. Aplique uma camada fina de gel transparente para ultrassom na área do tumor ou ferida (Figura 3C). Além disso, aplique gel de ultrassom no suporte para criar uma vedação entre o berço e o tumor ou área da ferida.
        NOTA: Elimine bolhas de ar. Como opção, o gel de ultrassom pode ser centrifugado para remover o ar antes do uso do gel. Além disso, use uma quantidade mínima de gel de ultrassom para evitar bolhas que podem se formar em camadas grossas de gel.
    6. Coloque o mouse no suporte (Figura 3D): Consulte as instruções do fabricante do instrumento. Coloque o rato em um suporte com o nariz do rato firmemente dentro do cone. Use algemas para segurar as mãos e os pés do rato. Use o laço do dente para estabilizar a cabeça.
      1. (OPCIONAL) Use o berço com um cone de nariz de rato ao fotografar um rato. O cone do nariz do rato levanta a cabeça do camundongo da base do berço, o que pode evitar afogamentos acidentais se uma pequena quantidade de água vazar para dentro do berço.
    7. Coloque o mouse e o suporte no instrumento OAI. Consulte as instruções do fabricante para o instrumento.
      1. Observe para quaisquer vazamentos no suporte do rato. Se houver vazamentos, retire o rato e o suporte do instrumento e volte a vedá-lo no suporte para evitar afogamentos acidentais.
      2. Se for desejado o DCE OAI, conecte o cateter à seringa com o agente de contraste.
    8. Equilibre o camundongo antes da imagem: Reserve 10 minutos para estabilizar a fisiologia do camundongo no tanque de água morna antes da aquisição da imagem (Figura 3E).
    9. Posicione o mouse em relação ao transdutor OAI:
      1. Mova o mouse ou o transdutor OAI conforme as instruções do fabricante para que o tumor ou ferida fique localizado no conjunto de imagens multi-fatia.
      2. Otimize a velocidade do som para o conjunto de imagens. Complete essa etapa enquanto o mouse está sendo equilibrado antes da imagem (passo 3.1.7).
      3. (Passo crítico) Mantenha a orientação/posição de corte consistente dos animais para todos os camundongos e em todos os pontos de tempo para garantir resultados rigorosos
  2. Defina os parâmetros OAI do sistema operacional.
    1. Selecione os parâmetros da fatia da imagem para que múltiplas fatias sejam imagens para cobrir toda a área do tumor ou ferida com 1 mm de espessura de corte.
    2. Selecione os comprimentos de onda de absorção. Para OAI do OS, selecione os comprimentos de onda de absorção de 700, 730, 760, 800, 850 e 875 nm.
    3. Empregue a média de sinal: Selecione parâmetros para adquirir 10 médias por comprimento de onda antes de adquirir o próximo comprimento de onda e antes de passar para a próxima fatia de imagem. As médias de 10 por comprimento de onda aumentam a relação sinal-ruído de cada fatia de imagem.
    4. Defina o número de repetições:
      1. Defina o número de repetições conforme mostrado na Tabela 1 para manter um tempo total de aquisição de aproximadamente 2 minutos. Para usuários de um instrumento com taxa de repetição de 10 Hz, o tempo total de aquisição é de 6,0 s por fatia de imagem.
      2. Mover o mouse para a próxima fatia de imagem e depois retornar à posição da primeira fatia requer uma média de 0,2 s, de modo que cada fatia requer 6,2 s.
      3. Realize no mínimo 3 repetições para garantir a estabilidade da medição. Um tempo total de aquisição superior a 2 minutos é aceitável se forem desejadas mais repetições.
  3. Adquira as imagens do sistema operacional (OA).
  4. Defina os parâmetros OAI do DCE.
    1. Defina os parâmetros de aquisição do DCE OAI para um protocolo de imagem de fatia única com múltiplos comprimentos de onda.
      1. Posicione as fatias de imagem. Selecione ≤5 fatias de imagem centradas na área do tumor ou ferida com 1 mm de espessura.
      2. Selecione o comprimento de onda de absorção ideal para o agente de contraste. Para verde de indocianina em ambiente in vivo , ajuste o comprimento de onda para 800 nm.
      3. Defina o número de médias e repetições conforme mostrado na Tabela 2. Essas recomendações manterão uma resolução temporal ≤ 5 s e um tempo total de aquisição de 11,0–11,2 min para usuários do instrumento OAI, que possui taxa de repetição de imagem de 10 Hz.
        NOTA: Usuários de outros instrumentos com taxa de repetição de imagem diferente devem ajustar o número de médias para manter uma resolução temporal de ≤ 5 segundos para cada conjunto de imagens.
    2. Como alternativa ao passo 3.4.1, defina os parâmetros de aquisição do OAI DCE para um protocolo de imagem multi-fatia com um único comprimento de onda.
      1. Posicione as fatias de imagem. Selecione ≤ 5 fatias de imagem centradas no tumor ou área da ferida com espessura de corte de 1 mm.
      2. Selecione o comprimento de onda de absorção ideal para o agente de contraste. Para verde de indocianina em ambiente in vivo , ajuste o comprimento de onda para 800 nm.
      3. Defina o número de médias e repetições conforme mostrado na Tabela 2. Essas recomendações manterão uma resolução temporal ≤ 5 s e um tempo total de aquisição de 11,0–11,2 min para usuários do instrumento OAI, que possui taxa de repetição de imagem de 10 Hz.
        NOTA: Usuários de outros instrumentos com taxa de repetição de imagem diferente devem ajustar o número de médias para manter uma resolução temporal de ≤ 5 s para cada conjunto de imagens.
  5. Adquira as imagens do DCE OA.
    1. Registre imagens de base: Inicie a aquisição e colete 12 conjuntos de imagens (~1 min).
    2. Injetar o agente de contraste: administrar 100 μL pelo cateter enquanto a aquisição continua.
      NOTA: A injeção do bolus deve ser consistente por aproximadamente 10–15 segundos para evitar o acúmulo de pressão no cateter na frágil veia caudal. Essa consistência pode ser controlada com pressão constante no êmbolo da seringa durante a injeção manual, ou usando um injetor automático. Importante, taxas de injeção de 10–15 s suavizam a entrega inicial do agente ao tumor, em vez de criar picos cinéticos na primeira passagem na curva PK causados por tempos mais rápidos de injeção, o que melhora a modelagem PK e as análises de medições empíricas.
      1. (Passo crítico) Evite o vazamento de agentes de contraste do vaso sanguíneo para os tecidos ao redor no local da injeção para preservar o tempo preciso do bolus.
    3. Continue com a imagem: Adquira os 128 conjuntos restantes de imagens por 10,2 minutos após a injeção para capturar a cinética de lavagem e lavagem de entrada.
    4. Monitore o processo de imagem para garantir que as imagens sejam adquiridas: Monitore a frequência respiratória do camundongo para garantir que a fisiologia do camundongo esteja estável durante os exames.
    5. Remova o rato e o suporte do instrumento: Retire o rato do berço. Deixe o rato se recuperar da anestesia. Devolva o rato a uma gaiola aquecida e monitore até que ele esteja andando.
      NOTA: Use o software apropriado e consulte as instruções do fabricante para o instrumento OAI. As etapas abaixo descrevem etapas de reconstrução e análise para um instrumento OAI que utiliza o software viewMSOT v4.0, e o Matlab R2019b ou uma versão mais recente do software Matlab.

4. Análise de resultados OS-DCE OAI

  1. Reconstrua as imagens OA.
    1. Selecione parâmetros de reconstrução de imagem: Configure a reconstrução de imagem para usar um método de retroprojeção filtrado com filtro passa-banda de 50 kHz–6,5 MHz e permita a correção automática de energia pulso a pulso.
    2. Reconstrua todas as imagens: Obtenha imagens em todos os comprimentos de onda do laser, todas as posições de corte da imagem e todos os pontos de tempo. Esse volume de dados pode exigir um tempo considerável para reconstrução da imagem.
  2. Analise imagens de OA do sistema operacional.
    1. Desmisturar cromóforos: Realizar desmistura espectral para gerar mapas paramétricos de oxihemoglobina (HbO 2), desoxihemoglobina (Hb), hemoglobina total (onde HbT =HbO 2 + Hb) e %sO 2 (onde %sO 2 = HbO2/HbT).
    2. Defina ROIs:
      1. Desenhe manualmente um ROI que represente o tumor ou ferimento em cada fatia da imagem. Desenhe um retorno de investimento conservador que penda pelo lado de excluir pixels da periferia tumoral ou da ferida, em vez de incluir pixels para tecido normal na periferia.
      2. Como alternativa, desenhe manualmente um retorno de investimento que represente a borda tumoral e um segundo retorno de investimento que representa o núcleo tumoral. A borda tumoral pode apresentar maior vascularização do que o núcleo tumoral, proporcionando uma análise potencialmente útil de sub-região.
        NOTA: Embora possam ser extraídos retornos adicionais de sub-regiões tumorais ou de feridas, ou os valores pixelados deHbO 2, Hb, HbT ou %sO 2 possam ser avaliados (sem necessidade de retorno sobre incógnito), essas regiões menores apresentam menor relação sinal-ruído, o que leva a medições imprecisas.
      3. Mantenha as posições de retorno do investimento consistentes em todas as imagens em cada comprimento de onda e ponto de tempo.
    3. Calcule os parâmetros médios para todo o tumor.
      1. Calcule o valor médio deHbO 2, Hb, HbT e %sO 2 no ROI tumoral ou ROI da ferida para cada fatia de imagem e cada ponto de tempo.
      2. Para OAI de OSO multi-fatia, calcule o valor médio deHbO 2, Hb, HbT e %sO2 de todas as fatias de imagem para obter um valor médio único para cada parâmetro para todo o tumor ou ferida.
    4. Avalie a estabilidade dos parâmetros. Plote o valor de %sO 2 para cada repetição (veja o passo 3.2.4). Avalie se o valor de %sO2 mudou mais de 10% durante os exames, o que indica uma medição temporalmente instável.
  3. Analise imagens de DCE OA.
    1. Desmisturar cromóforos em imagens DCE OA multicomprimento de onda: Realizar a desmistura espectral para gerar mapas paramétricos deHbO 2, Hb e o agente de contraste. Essa etapa não é necessária para o DCE OAI de comprimento de onda único.
    2. Defina ROIs.
      1. Desenhe manualmente um ROI que represente o tumor ou ferimento em cada fatia da imagem. Desenhe um retorno de investimento conservador que penda pelo lado de excluir pixels da periferia tumoral ou da ferida, em vez de incluir pixels para tecido normal na periferia.
      2. Como alternativa, desenhe manualmente um retorno de investimento que represente a borda tumoral e um segundo retorno de investimento que representa o núcleo tumoral. A borda tumoral pode apresentar maior vascularização do que o núcleo tumoral, proporcionando uma análise potencialmente útil de sub-região.
        NOTA: Embora possam ser extraídos ROIs adicionais das sub-regiões tumorais, ou os valores pixel-wise do agente de contraste possam ser avaliados (sem requerer ROI), essas regiões menores apresentam menor relação sinal-ruído, o que leva a medições imprecisas.
      3. Mantenha as posições de retorno do investimento consistentes em todas as imagens em cada comprimento de onda e ponto de tempo.
    3. Extraia curvas PK de imagens DCE OA.
      1. Para o ROI em cada fatia de imagem, exporte os pontos de tempo em relação ao sinal médio do ICG (do DCE OAI multicomprimento de onda) ou ao sinal do OAI no único comprimento de onda selecionado (para DCE OAI de comprimento de onda único).
      2. Calcule o sinal médio para todas as fatias de imagem. Um gráfico do sinal médio ao longo do tumor ou ferida em função do tempo é conhecido como curva PK.
      3. Transfira o sinal médio de todas as fatias de imagem em cada ponto de tempo para um programa de computador que possa avaliar os parâmetros empíricos listados abaixo. Por exemplo, o Microsoft Excel e o Graphpad Prism podem realizar análises simples de grafos.
    4. Calcule parâmetros empíricos conforme descrito nos passos 4.3.5–4.3.11.
    5. Normalize a curva PK: Determine o valor médio dos pontos de tempo pré-injeção, conhecidos como sinal de base. Subtraia o valor base do sinal de todos os valores pós-injeção.
    6. Determinar o Aprimoramento Máximo de Sinal (MSE): Identificar o maior valor de sinal pós-injeção na curva PK.
    7. Determine o Tempo até o Pico (TTP): Identifique o valor do ponto de tempo do MSE.
    8. Calcule a inclinação inicial da curva PK.
      1. Obtenha essa inclinação inicial desde o momento da injeção inicial até a TTP. Alternativamente, calcule a inclinação 1 minuto após a injeção se a forma da curva for muito íngreme ou se o TTP estiver muito atrasado.
      2. Nesse cenário, adquira as imagens de pré-injeção por 1 minuto e calcule essa inclinação do minuto 1.0 ao minuto 2.0 na curva PK.
    9. Calcule a Área Inicial Sob a Curva (IAUC): Calcule o valor médio dos valores do sinal desde o momento da injeção inicial até o TTP na curva PK.
    10. Calcule uma taxa empírica da fase de lavagem.
      1. Para a porção da curva PK de 1 minuto após o TTP até o último ponto de tempo, ajuste essa porção da curva com uma linha reta ou uma função de decaimento monoexponencial com um termo de deslocamento constante.
      2. Use a inclinação da linha reta ou a constante exponencial de decaimento como medida empírica da taxa PK da fase de lavagem.
    11. Calcule OAI com contraste aprimorado.
      1. Selecione um ponto de tempo maior que o TTP. Determine o valor do sinal nesse ponto como medida de realce de contraste.
        NOTA: O ponto de tempo em 10 minutos após a injeção é frequentemente selecionado, mas outros pontos podem ser selecionados conforme necessário.
      2. Como alternativa, calcule o sinal médio do TTP até o ponto de tempo selecionado, o sinal médio do TTP até o último ponto de tempo, ou outro intervalo de pontos de tempo conforme necessário.
      3. Note que o sinal médio é equivalente à área sob a curva PK para esses dois pontos de tempo, que tecnicamente é conhecida como uma medida da intensidade do sinal e não como uma medida da amplitude do sinal.
    12. Realize a modelagem PK conforme descrito nos passos 4.3.13–4.3.20.
      NOTA: Os passos a seguir analisam imagens DCE OA adquiridas com um instrumento OAI inVision. Outros instrumentos OAI podem produzir imagens em um formato de dados diferente. Os passos abaixo ainda podem ser seguidos para analisar imagens DCE OA usando outros instrumentos OAI se o formato dos dados dos outros instrumentos puder ser transferido para o MatLab e o formato de dados for ajustado para corresponder aos arquivos de dados de exemplo fornecidos com o pacote de software.
    13. Baixe o software.
      1. Para DCE OAI multi-comprimento de onda, baixe OE-DCE_MSOT_Matlab do repositório CAMEL-MartyPagel no Github, ou https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab.
      2. Para DCE OAI de comprimento de onda único, baixe o DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab do repositório CAMEL-MartyPagel no Github, ou https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab.
      3. Descompacte o arquivo comprimido. Abra o arquivo SOP na pasta doc e siga o procedimento padrão para instalar e usar o software.
    14. Organize os componentes do software em pastas diferentes. Armazene os seguintes arquivos de software em uma única pasta:
      Código principal: run_MSOT_nonneg.m
      Subcódigos: run_DCE_MSOT_MSP.m ; run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      Outros códigos: Negative_pixel_count.m ; Voxel_count.m; ROI_modification.m
      Pasta intitulada: com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      Dados exportados do ViewMSOT após reconstrução e desmistura espectral.
    15. Lance o programa no MatLab.
      1. Clique duas vezes em run_MSOT_nonneg.m para iniciar o programa no Matlab. Clique no botão "Executar" no topo da janela do Matlab. O código pode reportar um erro que run_OE_MSOT_AK_nonneg não é encontrado na pasta atual ou no caminho do MATLAB.
      2. Para corrigir esse erro, digite addpath e coloque a localização do arquivo entre aspas (por exemplo, addpath 'C:\Users\yourname\Documents\Non negative analysis') antes de rodar o código.
    16. Selecione o tipo de análise: Insira N para a análise OE e Y para a análise DCE.
      NOTA: O programa é capaz de analisar imagens de OA Oxigênio Aprimorado (OE), que consistem em uma combinação de mapas %sO2 adquiridos com gás respirável 21%O2 (ar grau médico) ou gás respirável 100%O2 , que não é usado nos estudos OS-DCE OAI descritos neste protocolo.
    17. Selecione os dados:
      1. Selecione a pasta que contém os arquivos OAI DCE. Selecione a pasta principal de varredura e não a subpasta MSP.
      2. Depois, verifique o nome do escaneamento. Por fim, selecione a pasta para salvar os dados analisados.
    18. Digite 3 para o número de cromóforos. Os cromóforos são Hb,HbO 2 e o agente de contraste.
      NOTA: O programa foi projetado para acomodar a análise DCE OAI de múltiplos cromóforos que são co-injetados no modelo do camundongo, se necessário. No entanto, o protocolo DCE OAI neste protocolo usa apenas um cromóforo.
    19. Retire os ROIs conforme descrito nos passos 4.3.19.1–4.3.19.4.
      1. Desenhe o ROI do vaso sanguíneo que servirá como Função de Entrada Arterial para a análise: Uma imagem em tons de cinza da varredura aparecerá em volume. Rastreie manualmente o ROI que representa o vaso sanguíneo.
        NOTA: Dê zoom clicando na lupa com o sinal de mais logo acima do canto superior direito da imagem. Clique novamente na lupa para voltar ao modo de desenhar o retorno do investimento. A veia cava inferior próxima à coluna pode frequentemente ser identificada e usada como AIF.
      2. Desenhe o ROI do tumor: Uma imagem em tons de cinza do exame aparecerá em tons de cinza. Trace o ROI que representa todo o tumor, a borda tumoral ou o núcleo tumoral. Para analisar mais de um ROI, repita todo esse procedimento de modelagem PK (Passo 4.3.12) para obter um ROI adicional.
      3. Desenhe o ROI de uma região muscular: Não use esse ROI no cálculo do OAI DCE. Use o ROI do músculo para a análise de OAI DCE usando o Modelo de Região de Referência Linear, que não é utilizado neste relatório. Essa etapa ainda deve ser realizada para que o programa continue.
      4. Verifique se o retorno sobre investimento correto foi obtido. A modelagem da curva PK vai começar.
    20. Visualize os resultados analisados do DCE OAI.
      1. Para carregar dados DCE analisados, vá até a barra do navegador e selecione DCE_MSOT_MSP.
      2. Na janela de comando, insira limpar tudo.
        NOTA: A aba atual de pastas agora está preenchida com dados OAI DCE analisados, que incluem:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat: Clique duas vezes aqui para ver os valores tabulados de NKtrans e kep para o ROI do tumor. Os parâmetros cinéticos são tabulados de 3 maneiras:
        Trans NK_avg: Média datrans NK calculada para cada pixel.
        _avg_signaltrans NK: Valortrans NK único calculado após a média dos sinais para todo o tumor
        Trans _nz NK: Trans NK_avg calculado apenas com valores de pixels diferentes de zero.
        Da mesma forma, k valoresep podem ser exibidos.
        NKtrans.fig: Exibe omapa trans _avg NK sobreposto a uma imagem em tons de cinza.
        kep.fig: Exibe o mapak ep_avg sobreposto a uma imagem em tons de cinza.
        Maps_Wavelength_ICG.mat: Isso precisa ser carregado para visualizar outros mapastrans ou kep . Após carregar essa matriz, use o "código de sobreposição" (incluído separadamente) para exibir o parâmetro desejado.
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat e Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat: Parâmetros de exibição para ROIs musculares.
        Sinal normalizado para ICG. fig: Denota o sinal médio de ICG ao longo do tempo nos três ROIs, normalizado ao sinal máximo.
        Sinal para ICG.fig: Denota o sinal médio do ICG ao longo do tempo nos três ROIs.

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Resultados

O sinal OAI pode gerar mapas de saturação de oxigênio em tumores e feridas
Após a aquisição e reconstrução de conjuntos de dados multiespectrais de OAI, regiões de interesse (ROIs) podem ser definidas dentro de tumores ou leitos de feridas para quantificar a intensidade do sinal em diferentes comprimentos de onda. Algoritmos de desmistura espectral são então aplicados para separar as contribuições da oxihemoglobina (HbO 2) e da desoxihemoglobina (Hb) do sin...

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Discussão

As curvas PK do OAI do DCE podem ser afetadas por uma variedade de artefatos que reduzem a confiabilidade da análise PK. Uma armadilha comum é a presença de feridas superficiais, crostas ou sangue seco no campo de imagem, que podem introduzir uma absorção forte e inespecífica na superfície da pele e obscurecer sinais mais profundos (Figura 8). Ao desenhar ROIs dentro do tumor, deve-se tomar cuidado para evitar incluir essas estruturas superficiais para garan...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse em relação a esta obra.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Neal Burton, da iThera Medical, GmbH, pela consulta. Este trabalho foi financiado pela bolsa NRSA da UW-Madison Radiology (2T32CA009206-46), pela ITPT Radiological Sciences Trainee Pilot Grant, pelo programa Clinical and Translational Science Award (CTSA), pelo National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), UL1TR002373 e TL1TR002375 do NIH R43 CA265603, NIH R01 EB034261, NIH R21 EB037731 e um Falk Catalyst Award do Falk Medical Research Trust.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha 20 GExel INT26417Agulha hipodérmica; 20G x 1", usado para preparar soluções de heparina
Células 4T1ATCCCRL-2539Linha celular de câncer de mama triplo negativa
Anti-Anti (100x)Gibco15240-062Coquetel antibiótico
Punção de biópsiaIntegra 33-36punção de biópsia descartável de 6 mm & nbsp;
Água de Grau CelularCorning25-055-CV500 mL; testado com USP sterile sater para especificações de inecção & nbsp;
Solução da Matriz de ColágenoCorning354262Matriz de colágeno para formação e injeção tumoral
EtanolLaboratório Deacon2701Asséptico de uso geral
Lubrificante para os Olhos Optixcare 50-218-844220 g/0,70 oz; apenas para uso animal 
gaze Fisherbrand22-415-468Gaze de algodão; 3" x 3" (7,6 x 7,6 cm); 12 camadas
LuvasVWR76457-130Luvas de exame de nitrilo
HeparinaMeithealNDC71288-402-1010.000 unidades USP por 10 mL, 1.000 unidades USP por mL; Frasco Multidosagem de 10 mL
Verde de IndocianinaTCII0535Agente de Contraste Optoacústico
IsofluranoIsospire17033-091-25Um anestésico inalativo não inflamável e não explosivo para uso em cavalos e cães; 250 mL 
Filme de LaboratórioParafilm PM-9922" x 250'; Núcleo de 1" de diâmetro
Depilador de pelo de dobragem corporal Nair NairLL4038Creme Espeliatório; Manteiga de cacau rica & Manteiga de Cacau vitamina E
Agulha TerumoNN2732R27G x 1 1/4" (6,40 mm x 32 mm); R.W. Reg. Bevel 
Máquina de Imagem OptoacústicaiTheraMedical MSOT no Vision 512Scanner optoacústico
PBS, 1xCorning 21-040-CV500 mL; Soro salino tamponado com fosfato sem cálcio e magnésio  
RPMICorning 10-040-CVMeios de cultura celular
Soro fisiológicoHospiraNDC0409-4888-0210 mL de dose única; Injeção de cloreto de sódio a 0,9%, USP
CroômetroiTheraMedical 4135333Usado para registrar minutos e segundos  
SeringasSaúde Cardinal11881280121 mL de seringa de insulina; U-100 apenas insulina; 27G x 1/2" (0,35 x 12,7 mm)
Curativos transparentes para feridasTegaderm1624Westilo de moldura de filme transparente; 2 3/8" x 2 3/4" (6 cm x 7 cm)
PinçaTermo Electron 7626Usado para puxar a pele para trás ao injetar células em camundongos
Gel de ultrassomEcoVue283Pacote de 32 g, sem prpylenoglicol, solúvel em água, sem parabenos e sem corantes
Suturas não tingidasEthiconVR493corte de 18"; P-3 3/8 13 mm; sem tingir e trançar, sutura absorvível sintética, não USP
Bolsa térmicaRepti Therm UTH120VAC 60Hz 8W Costumava aquecer animais sob anestesia;  
Talas de UsoGrace Bio-Labs476684Silicone transparente, 14 mm de diâmetro de campo x 10 mm de comprimento de 0,5 de espessura com pontos de sutura e de ponto;
Clipes de feridaReflex 7203-1000Sistema reflex de fechamento de pele, 7 mm, aço inox stee

Referências

  1. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: In vivo imaging from organelles to organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  2. Ntziachristos, V., Razansky, D. Molecular imaging by means of multispectral optoacoustic tomography (MSOT). Chem Rev. 110 (5), 2783-2794 (2010).
  3. Sourbron, S. P., Buckley, D. L. Classic models for dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 26 (8), 1004-1027 (2013).
  4. Hupple, C. W., et al. A light-fluence-independent method for the quantitative analysis of dynamic contrast-enhanced multispectral optoacoustic tomography (DCE MSOT). Photoacoustics. 10, 54-64 (2018).
  5. Xiao, T. G., et al. Applying dynamic contrast-enhanced MSOT imaging to intratumoral pharmacokinetic modeling. Photoacoustics. 11, 28-35 (2018).
  6. Han, Z., et al. Dynamic 2-deoxy-D-glucose-enhanced multispectral optoacoustic tomography for assessing metabolism and vascular hemodynamics of breast cancer. Photoacoustics. 32, 100531(2023).
  7. Pickles, M. D., Manton, D. J., Lowry, M., Turnbull, L. W. Prognostic value of pre-treatment DCE-MRI parameters in predicting disease-free and overall survival for breast cancer patients undergoing neoadjuvant therapy. Eur J Radiol. 71 (3), 498-505 (2009).
  8. Goel, S., et al. Evaluations of radiotherapy in small animal models of pancreatic cancer with oxygen-enhanced–dynamic contrast-enhanced multispectral optoacoustic tomography (OE-DCE MSOT). Photons Plus Ultrasound: Imaging and Sensing 2023, 12379, (2023).
  9. Yang, E., et al. Evaluations of a cutaneous wound healing model using oxygen-enhanced dynamic contrast-enhanced photoacoustic imaging (OE-DCE PAI). Mol Imaging Biol. 26 (6), 995-1004 (2024).
  10. Longo, D. L., et al. Water-soluble melanin derivatives for dynamic contrast-enhanced photoacoustic imaging of tumor vasculature and response to antiangiogenic therapy. Adv Healthcare Mater. 6 (1), 1600550(2017).
  11. Ermolayev, V., Dean-Ben, X. L., Mandal, S., Ntziachristos, V., Razansky, D. Simultaneous visualization of tumour oxygenation, neovascularization and contrast agent perfusion by real-time three-dimensional optoacoustic tomography. Molec Imaging. 26, 1843-1851 (2016).
  12. Chen, Z., et al. Concurrent fluorescence and volumetric optoacoustic tomography of nanoagent perfusion and bio-distribution in solid tumors. Biomed Opt Express. 10 (10), 5093-5102 (2019).
  13. Taruttis, A., Morscher, S., Burton, N. C., Razansky, D., Ntziachristos, V. Fast multispectral optoacoustic tomography (MSOT) for dynamic imaging of pharmacokinetics and biodistribution in multiple organs. PLoS One. 7 (1), e30491(2012).
  14. Tomaszewski, M. R., Gehrung, M., Joseph, J., Quiros-Gonzalez, I., Disselhorst, J. A., et al. Oxygen-enhanced and dynamic contrast-enhanced optoacoustic tomography provide surrogate biomarkers of tumor vascular function, hypoxia, and necrosis. Cancer Res. 78 (20), 5980-5991 (2018).
  15. Choi, W., Park, B., Choi, S., Oh, D., Kim, J., et al. Recent advances in contrast-enhanced photoacoustic imaging: and practical challenges. Chem Rev. 123 (11), 7379-7419 (2023).
  16. Weber, J., Beard, P. C., Bohndiek, S. E. Contrast agents for molecular photoacoustic imaging. Nat Methods. 13 (8), 639-650 (2016).
  17. Fu, Q. R., Zhu, R., Song, J. B., Yang, H. H., Chen, X. Y. Photoacoustic imaging: Contrast agents and their biomedical applications. Adv Materials. 31 (6), 1805875(2019).
  18. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  19. Alander, J. T., et al. A review of indocyanine green fluorescent imaging in surgery. Int J Biomed Imaging. 2012, 940585(2012).
  20. Xia, J., Chen, W. Y., Maslov, K., Anastasio, M. A., Wang, L. H. V. Retrospective respiration-gated whole-body photoacoustic computed tomography of mice. J Biomed Opt. 19 (1), 016003(2014).
  21. Liu, S., Wang, T., Zheng, X., Zhu, Y., Tian, C. On the imaging depth limit of photoacoustic tomography in the visible and first near-infrared windows. Optics Express. 32 (1), 5460-5480 (2024).
  22. Oraevsky, A., Clingman, B., Zalev, J., Stavros, A., Yang, W., et al. Clinical optoacoustic imaging combined with ultrasound for coregistered functional and anatomical mapping of breast tumors. Photoacoustics. 12, 30-45 (2018).
  23. Cox, B., Laufer, J. G., Arridge, S. R., Beard, P. C. Quantitative spectroscopic photoacoustic imaging: a review. J Biomed Opt. 17 (6), 061202(2012).
  24. Khodaverdi, A., et al. Two photoacoustic spectral coloring compensation techniques adapted to the context of human in-vivo oxygenation measurements. Biomed Optics Express. 16 (6), 2217-2231 (2025).
  25. Reinhart, M. B., Huntington, C. R., Blair, L. J., Heniford, B. T., Augenstein, V. A. Indocyanine green: Historical context, current applications, and future considerations. Surg Innov. 23 (2), 166-175 (2016).

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