Transdução Lentiviral Dual para Gerar Células-Tronco Neurais Mutantes para Pesquisa em Glioma

Resumo

Este protocolo descreve a geração de células-tronco neurais murinas mutantes (NSCs) para pesquisa em glioma utilizando transduções lentivirais sequenciais. Mutações oncogênicas são introduzidas primeiro nos NSCs, seguidas por um lentivírus bicustrônico contendo genes repórteres. Após a dupla seleção de antibióticos, os CSN mutantes permitem imagens em tempo real do crescimento tumoral e da resposta ao tratamento.

Resumo

Gliomas são os tumores cerebrais primários mais prevalentes em adultos, e a modelagem murina sugere que eles podem surgir de mutações oncogênicas em NSCs ou progenitores diferenciadores precoces. Modelos de transplante ortotópico derivados de CSN mutantes têm, portanto, o potencial de fornecer informações pré-clínicas valiosas sobre patogênese do glioma, desfechos e resposta ao tratamento. Esses modelos exigem a introdução de uma mutação oncogênica nos NSCs, preferencialmente acoplada a repórteres para auxiliar na determinação da eficiência da transfecção/transdução e para monitorar o crescimento tumoral in vivo. Esse protocolo descreve uma metodologia dupla baseada em transdução para gerar NSCs mutantes adequados para monitoramento tumoral in vivo . Nessa técnica, os CSN isolados são primeiro transduzidos com lentivírus que contêm um gene de interesse (mutação oncogênica ou controle da proteína fluorescente verde [GFP]), além de um elemento de resistência à blasticidina. Após a seleção da blasticidina, as células são transduzidas secundariamente por um vetor lentiviral biscistrônico que expressa luciferase e proteína fluorescente vermelha (RFP), além de um elemento de resistência à puromicina. Após a seleção da puromicina, as células podem ser expandidas para ensaios de proliferação, transplante ortotópico ou outras aplicações posteriores. Essa abordagem de dupla transdução permite estimar a eficiência da transdução em ambos os estágios da infecção, bem como monitorar in vivo o estabelecimento, crescimento e resposta do tumor à terapia usando imagens bioluminescentes não invasivas (BLI). Esse sistema representa uma ferramenta útil para a pesquisa do glioma, unindo a relevância biológica da modelagem de tumores derivadas de células-tronco neurais adultas com o benefício prático da capacidade de imagem em tempo real, aprimorando, em última análise, a compreensão da biologia do glioma e o avanço de novas abordagens terapêuticas.

Introdução

Gliomas são a forma mais prevalente de tumores cerebrais primários que afetam adultos, constituindo aproximadamente 80% de todas as neoplásias malignas cerebrais nesta^{população 1}. A maioria deles são gliomas^{de alto grau 2}, que normalmente são muito invasivos e apresentam um prognóstico ruim ^3,4, apesar dos avanços significativos em técnicas neurocirúrgicas, radioterapia e abordagens quimioterapêuticas⁵. A alta taxa de mortalidade em pacientes afetados por esses tumores destaca a necessidade de pesquisas contínuas sobre a formação e progressão do glioma.

A gliomagênese no sistema nervoso central pode ser desencadeada pela introdução de mutações oncogênicas nos^NSCs 6,7,8,9 ou em seus descendentes diferenciadores ^precoces 10,11,12 em estudos de modelagem murina. Notavelmente, esses estudos mostraram que as mesmas mutações oncogênicas frequentemente falham em produzir tumores quando introduzidas em células mais^{diferenciadas 13}, estabelecendo uma hierarquia de célula de origem onde o aumento da restrição de linhagem se correlaciona com uma suscetibilidade reduzida à^{transformação 14}. Assim, os CSN geneticamente modificados são comumente usados para gerar modelos de glioma biologicamente relevantes e versáteis, utilizando técnicas transgênicas ou métodos ortotópicos^{de transplante 15}. Ambas as abordagens permitem o estudo da formação de tumores de novo no ambiente cerebral nativo a partir de uma célula não transformada. Modelos geneticamente modificados permitem esse estudo em animais com sistema imunológico intacto, muitas vezes imitando melhor a histologia e heterogeneidade celular observadas em tumores^{humanos 16}. No entanto, gerar esses modelos é trabalhoso e custoso, e frequentemente apresentam longos tempos de latência e baixas frequências de formação^{tumoral 16}. Em contraste, modelos ortotópicos de NSC são mais facilmente manipuláveis e econômicos. Os NSCs mutantes podem ser gerados a partir de células primárias ou imortalizadas de camundongos ou humanos, com base nas necessidades experimentais, e também são adequados para experimentação in vitro. ^{experimentação 16,17}. Além disso, esses modelos oferecem a capacidade de ajustar com precisão o estágio de desenvolvimento tanto dos NSCs quanto dos camundongos receptores, bem como a localização espacial de onde os NSCs são derivados e para onde são introduzidos. Isso permite aos pesquisadores investigar como a idade e regiões cerebrais específicas influenciam a tumorigênese impulsionada por mutações específicas¹⁷.

Este protocolo descreve a metodologia para gerar NSCs mutantes murinos a partir de cultura primária, que são adequados tanto para aplicações experimentais in vitro quanto in vivo (Figura 1). O protocolo consiste em duas fases distintas de transdução que ocorrem em uma sequência temporal específica. Na fase inicial de transdução, CSN murinos isolados são infectados com lentivírus recombinantes que carregam o construto genético alvo, seja uma mutação oncogênica ou um controle de proteína fluorescente verde (GFP), junto com um cassete de resistência à blasticidina. Em seguida, a pressão de seleção do antibiótico é aplicada usando blasticidina, permitindo que apenas as células transduzidas sobreviventes prossigam para um evento secundário de transdução. Esse evento secundário emprega uma construção lentiviral bicustrônica que codifica tanto os genes repórteres da luciferase dos vaga-lumes quanto da proteína fluorescente vermelha (RFP), acoplados a elementos de resistência à puromicina para seleção subsequente. Após a seleção com puromicina, as populações de NSC duplamente transduzidas resultantes são expandidas in vitro. antes de experimentos subsequentes. Essa abordagem de transdução sequencial oferece várias vantagens metodológicas: (1) facilita uma avaliação quantitativa da eficiência da transdução em cada^{etapa 18}, (2) estabelece linhas celulares repórteres estáveis adequadas para rastreamento longitudinal, e (3) possibilita o monitoramento não invasivo da iniciação tumoral, cinética de progressão e respostas terapêuticas por meio das metodologias^{BLI 18,19,20}. Também pode ser usado com as NSCs primárias ou^{imortalizadas 21, 22, 23}.

O protocolo apresentado aqui atende à necessidade urgente de uma abordagem padronizada, eficiente e biologicamente relevante para gerar modelos de glioma derivados de NSC a partir de animais adultos com capacidades integradas de imagem. Espera-se que os modelos resultantes forneçam insights clinicamente relevantes sobre a patogênese do glioma, facilitem a identificação de novos alvos terapêuticos e apresentem bases sólidas para a avaliação pré-clínica de estratégias de tratamento emergentes.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os padrões éticos e diretrizes regulatórias estabelecidos pela Washington University em St. Louis. Para esse protocolo, o córtex de camundongos adultos foi microdissecado conforme a técnica²⁴ descrita anteriormente pelo laboratório Brossier e usado para isolar NSCs murinos primários para expansão subsequente em culturas não aderentes, conforme protocolo^{estabelecido 24,25,26}. Todos os reagentes usados em cultura são fornecidos em formato estéril ou passados por um filtro de membrana de 0,2 μM para garantir a esterilidade. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de células-tronco neurais a partir de tecido microdissecado

1. Prepare Mídia Dissociativa (DM) e Meio de Digestão de Tripsina (TDM), conforme as receitas mostradas na Figura 2.
   1. Adicione 200 μL de Meio de Digestão de Tripsina em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe no gelo por pelo menos 20 minutos antes do uso. A DM pode ser deixada em temperatura ambiente para etapas posteriores do protocolo.
   2. Enquanto os tubos estão pré-resfriando, prepare o Meio Neural de Células-Tronco (NSC; receita mostrada na Figura 2) e coloque o NSC e o Soro Bovino Fetal (FBS) a 37 °C em um banho de água ou de contas para pré-aquecer. Coloque alíquotas de suplementos (B27, N2) e fatores de crescimento (EGF, FGF) em um balde de gelo para descongelar lentamente.
      NOTA: O TDM deve ser preparado fresco a cada vez antes do uso, embora NSC e DM possam ser armazenados a 4 °C entre os usos; receitas são mostradas na Figura 2. Estoques de N2, B27, EGF e FGF devem ser alicotados e armazenados a -20 °C até o uso; evite congelamentos e descongelamentos repetidos de estoques reconstituídos (veja a Tabela de Materiais para mais detalhes na preparação dos estoques de EGF e FGF).
2. Após os tubos microcentrífugas contendo TDM serem suficientemente resfriados, microdissecar o tecido conforme descrito^{anteriormente 24}. Após cada microdissecação, coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga. Volte o tubo ao gelo até que todas as dissecações estejam concluídas, pois qualquer aquecimento do tecido pode iniciar o processo digestivo enzimático mais cedo e resultar em excesso de digestão.
3. Incube o(s) tubo(s) da microcentrífuga a 37 °C em um banho de água ou esferas por 15 minutos para iniciar a digestão enzimática. Durante a incubação, prepare 10% de FBS em NSC adicionando 0,5 mL FBS a 4,5 mL de NSC.
   1. Após a incubação, pipete-se suavemente 5–10 vezes com uma micropipeta de 1 mL para dissociar ainda mais as células, e então neutralize a tripsina adicionando 200 μL de 10% de FBS em NSC a cada amostra. Pipete suavemente para cima e para baixo para misturar.
      NOTA: É fundamental seguir o tempo recomendado de incubação a 37 °C. A tripsinização excessiva pode levar à morte celular, enquanto a subtripsinização pode dificultar a dissociação da amostra ( veja a Tabela 1, Pontos 1–2 para essa e outras dicas de solução de problemas).
      NOTA: Pode ser usado um banho-maria ou um banho de contas para incubar amostras; este último pode reduzir o risco de^{contaminação 27}, mas pode trazer o risco de transferência de calor^{menos eficiente 28}.
4. Centrifuge as células primárias isoladas a 630 × g por 5 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar as células no fundo do poço. Lave as células adicionando 2,5 mL de DM ao pellet celular e resuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo 3 a 4 vezes. Centrifuge novamente a 630 × g por 5 minutos a 4 °C e aspire cuidadosamente o sobrenadante.
5. Repita o Passo 1.3 para realizar uma segunda lavagem. Durante a lavagem final, adicione B27, N2, FGF e EGF ao meio base de NSC pré-aquecido para criar meio NSC completo (receita mostrada na Figura 2).
6. Aspire o sobrenadante. Adicione 2 mL de meio NSC completo e morno a cada pellet celular, depois resuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo 3 a 4 vezes. Coloque as células ressuspensas em um poço de uma placa de fixação baixa de 6 poços e incube a 37 °C.
   NOTA: Embora o meio base do NSC possa ser armazenado a 4 °C entre os usos, suplementos e fatores de crescimento podem sofrer degradação nessa temperatura. Assim, B27, N2, FGF e EGF devem ser adicionados ao meio NSC para criar um meio NSC completo imediatamente antes do uso.

2. Estabelecimento e expansão da cultura da neurosfera

1. Administre de 0,5 a 1 mL de meio alimentar fresco de NSC (receita mostrada na Figura 2) em cada poço das culturas de NSC a cada 3 dias.
2. Monitore a formação da neurosfera. Quando pequenas esferas totalmente formadas são visíveis, a cultura está pronta para a passagem (tipicamente de 5 a 10 dias após a colocação inicial).
   NOTA: As células crescem melhor quando são frequentemente transportadas e ainda na fase logarítmica. Neurosferas maiores são mais difíceis de dissociar e mais propensas à morte celular durante esse processo. Assim, recomenda-se a passagem mais precoce e frequente para promover a saúde celular. Quando prontas para passagem, neurosferas isoladas terão ~100–200 μm de diâmetro, com células compactas e bordas lisas e bem definidas sob microscopia de campo claro. As neurosferas não exibirão projeções ou extensões irregulares. O centro das neurosferas será um pouco mais escuro que as bordas externas, mas não excessivamente; núcleos excessivamente escuros frequentemente resultam da necrose das células centrais devido à privação de nutrientes quando as neurosferas foram superdimensionadas. A passagem em neurosferas sobredimensionadas frequentemente resulta em altas quantidades de morte celular, o que pode afetar aplicações a jusante. Veja a Tabela 1, Pontos 3–4 para essa e outras dicas de solução de problemas.
3. Pré-aqueça o meio NSC, DM, 0,05% de Tripsina-EDTA e soro salino tamponado com fosfato (PBS) a 37 °C usando um banho de água ou esferas. Coloque estoques de B27, N2, FGF, EGF e FBS no gelo até que seja necessário.
4. Para a passagem, transfira neurosferas bem desenvolvidas para um tubo cônico estéril de 15 mL usando uma pipeta sorológica. Centrifuge a 630 × g por 1 minuto a 4 °C para estabilizar as neurosferas. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar as neuroesferas em pelote. Lave as células ressuspendendo em 1x PBS estéril, depois centrifuge novamente a 630 × g por 5 minutos a 4 °C e aspire o sobrenadante.
5. Adicione 1 mL de 0,05% de Tripsina/EDTA ao pellet celular. Pipete para cima e para baixo 3 a 5 vezes com uma micropipeta de 1 mL para misturar, depois incube a 37 °C em banho de água ou de estalas por 5 a 6 minutos.
   1. Após a incubação, pipeteie suavemente para cima e para baixo 5 a 10 vezes com uma micropipeta de 1 mL para quebrar as neurosferas. Neutralize a tripsina adicionando 1 mL de 10% de FBS em meio NSC; Pipete suavemente para misturar.
      NOTA: Evite a tripsinização excessiva e/ou pipeteamento excessivamente vigoroso das neurosferas, pois isso pode danificar os NSCs e afetar a viabilidade celular.
6. Adicione 2,5 mL de DM e centrifuge a 630 × g por 5 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem com mais 2,5 mL de DM, seguida pela centrifugação e aspiração do sobrenadante, para remover vestígios de FBS no meio.
7. Resuspenda células em 1 mL de meio NSC completo e fresco. Suspende-se a célula do filtro colocando um filtro estéril de 40 μm em um tubo de microcentrífuga de 50 mL, depois adicionando a solução da célula ao topo do filtro e permitindo que a gravidade drene a solução para dentro do tubo. Quaisquer células não dissociadas restantes serão capturadas pelo filtro, enquanto células individuais passarão para a solução abaixo.
8. Das células ressuspensas e filtradas, retire 10 μL para contagem celular e misture com 10 μL de azul de tripano. Usando um hemocitometro manual, carregue 10 μL da amostra e conte células viáveis (ou seja, células que não são azuis) conforme a prática^{padrão 29}. Alternativamente, pode ser usado um contador automático de células, embora possa ser menos preciso na presença de detritos ou agregados^{de células 30,31}.
   NOTA: Geralmente, menos de 10%–15% do total de células deve apresentar sinais de morte celular (por exemplo, incapacidade de excluir o azul de tripano). Taxas mais altas de morte celular podem resultar de super-tripsinização, força mecânica excessiva na separação das células ou má saúde geral da cultura antes da tripsinização (ver Tabela 1, Pontos 1–3). Como isso pode afetar negativamente as aplicações posteriores, recomenda-se que as células sejam replacadas (Etapa 2.9) e expandidas novamente (por exemplo, repetir as Etapas 2.1–2.9) se forem observadas altas taxas de morte celular, em vez de prosseguir para a transdução.
9. Dilua 5 x 10⁵ células em 2 mL de meio NSC completo e fresco e place em um poço de uma placa de 6 poços de fixação ultra-baixa. Administre de 0,5 a 1 mL de alimentação fresca de NSC em cada poço a cada três dias para garantir a saúde ideal da cultura. Quando totalmente formadas, esferas saudáveis são visíveis ( veja Tabela 1, Ponto número 4), a cultura está pronta para uso nas Etapas 3 ou 4.
   NOTA: Os NSCs extras podem ser armazenados neste ponto resuspendendo um milhão de NSCs em 1 mL de meio congelante de células sem soro em um criovial de 1,5 mL e armazenando-os a -80 °C. Os NSCs também podem ser ainda mais expandidos, se necessário, ao recobrir células adicionais em poços extras da placa de 6 poços ou ao colocar em frascos T-25.

3. Curva de morte da blasticidina nas células-mãe

NOTA: Uma vez que os NSCs passados formam neurosferas saudáveis, as células estão prontas para experimentos subsequentes. Antes da transdução, é fundamental determinar a concentração ideal do antibiótico seletivo (blasticidina, neste caso). Isso deve ser realizado empiricamente, pois diferentes populações de CSN podem ter suscetibilidade diferente ao antibiótico. Se isso já foi determinado para o tipo de célula dado, pule para a Etapa 4.

1. Pré-aqueça o meio base do NSC, DM, 0,05% de Tripsina-EDTA e PBS a 37 °C. Descongelam estoques de B27, N2, FGF, EGF, FBS e blasticidina. Antes de iniciar, ou durante as etapas de incubação abaixo, prepare um meio NSC completo fresco e 10% de FBS no meio NSC, conforme descrito acima.
2. Usando neurosferas recém-expandidas (após a cultura do Passo 2.9 acima), tripsinize e posteriormente divida-se conforme os passos 2,5–2,6, depois resuspenda 1 mL de NSC fresco para contagem. Filtre as células através de um filtro estéril de 40 μm conforme descrito acima para remover células não dissociadas, depois conte as células conforme descrito no Passo 2.8.
3. Resuspenda 25.000 células viáveis em 2,5 mL alíquotas de NSC completo fresco em 15 mL cônicas, com 1 alíquota preparada por concentração de antibiótico a ser testada. Planeje testar pelo menos 4–6 concentrações diferentes, embora mais possam ser testadas se desejado.
4. Adicione a quantidade apropriada de blasticidina a cada alíquota de 2,5 mL para alcançar a concentração final desejada (veja cálculos de amostra na Tabela 2). Placa de 500 μL de células suspensas (5.000 células) por poço em uma placa de fixação ultra-baixa de 24 poços, com cada concentração em quadruplicatada.
   NOTA: Para alcançar a concentração final correta, pode ser necessário diluir o estoque de blasticidina antes de ser adicionado ao meio. A blasticidina pode ser diluída em meio NSC ou PBS; para um estoque diluído 1:1000 (10 mg/mL), adicione 1 mL de estoque de blasticidina não diluído (10 mg/mL) a 999 mL de NSC ou PBS. Recomenda-se que os pesquisadores realizem todos os cálculos necessários para alcançar as concentrações desejadas enquanto os materiais estão aquecendo no Passo 3.1; Cálculos de exemplo mostrados na Tabela 2.
5. Incube as células a 37 °C. Verifique as células cuidadosamente usando microscopia de campo claro a cada 24 horas para detectar mudanças na morfologia e morte celular/neurosfera. Alimente as células a cada 3 dias adicionando 0,5–1 mL de meio de alimentação novo de NSC, suplementado com a concentração correta de blasticidina.
6. Determine a concentração adequada para a seleção subsequente de blasticidina identificando a menor concentração de blasticidina que mata células não transduzidas entre 72 e 120 h após o revestimento.
   NOTA: Para CSN murinos adultos, 1000 ng/mL (1 mg/mL) de blasticidina foi identificada como a melhor concentração para seleção de antibióticos (Figura 3). Os passos subsequentes são realizados usando blasticidina nessa concentração. Deve-se notar que a concentração ótima de blasticidina pode variar consideravelmente entre as preparações celulares, tipicamente variando de 0,5 a 10 μg/mL, dependendo do tipo de amostra, número de passagem e condições de^{cultivo 32,33}; Curvas de Kill empíricas são, portanto, essenciais, e não opcionais para cada novo tipo de célula. Veja a Tabela 1, Ponto número 5 para dicas adicionais de solução de problemas.

4. Primeira transdução lentiviral

NOTA: Antes de prosseguir com a transdução, é essencial conhecer a multiplicidade ótima de infecção (MOI) na qual transduzi-se as partículas lentivirais (LVPs). Isso deve ser determinado empiricamente para diferentes tipos celulares; Os métodos para isso já foram bem descritos^{anteriormente 34,35}. Nos resultados ilustrativos representados, foi utilizado um MOI de 20 baseado em experiência prévia na transdução de CEN primário murino.

1. Comece com NSCs expandidos e não transduzidos formando neurosferas saudáveis (geradas após a expansão das células no Passo 2.9 acima). Divida, ressuspenda, filtra e conte as células conforme os Passos 2.3–2.8 acima, depois placar as células com densidade de 1,5 x 10⁶ células por poço em dois poços (um para vírus oncogênico, outro para controle) de uma placa de 6 poços de ultra baixa aderência. Incube as placas durante a noite a 37 °C.
2. No dia seguinte, examine as células. Os CSN estarão prontos para infecção se estiverem formando pequenos aglomerados.
3. Antes de infectar as células, descongele cuidadosamente a alíquota lentiviral no gelo, permitindo um descongelamento gradual. É fundamental não apressar esse processo.
   NOTA: Para fins ilustrativos, este protocolo descreve a transdução lentiviral usando dois construtos representativos: (1) um vetor controle expressando GFP sob o promotor EF1-α com resistência à blasticidina, e (2) um vetor experimental expressando um mutante oncogênico BRAF V600E marcado com HA N-terminal sob o promotor EF1-α, também com resistência à blasticidina. A geração de lentivírus está além do escopo deste protocolo, mas já foi bem descrita^{anteriormente 36,37}.
4. Após o descongelamento, aqueça brevemente o vírus a 37 °C imediatamente antes da infecção. Determine o volume de LVP a ser adicionado a cada poço, usando a fórmula MOI x número de células/título do vírus. Usando uma micropipeta ajustada ao volume calculado, adicione lentamente os LVPs gota a gota às células cultivadas. Gire a placa suavemente para distribuir, tomando cuidado para não espalhar o meio em poços adjacentes. Incube as células a 37 °C por 24 horas.
   NOTA: Uma vez que a alíquota viral foi descongelada até a temperatura ambiente, ela não pode ser recongelada e deve ser utilizada em até 24 horas. Uma vez que a alíquota tenha sido aquecida para 37 °C, ela deve ser utilizada em um prazo de 30 minutos.
5. Após esse período de incubação, centrifuge as neuroesferas a 630 × g por 5 minutos a 4 °C, depois aspire o sobrenadante. Ressuspenda em 2 mL de CSN completo e fresco, sem nenhum vírus ou antibiótico, e coloque em um poço fresco de uma placa de 6 poços de baixa fixação.
6. No dia seguinte, avalie a eficiência de transdução nas células de controle da GFP determinando a proporção de células/aglomerados marcados fluorescentemente em relação ao total de células/aglomerados por microscopia de fluorescência em múltiplos campos. A expressão do repórter esperado (GFP) deve ser superior a 80% para transdução bem-sucedida.
   NOTA: Se for observada eficiência de transdução subótima, pode ser realizada uma segunda rodada de infecção (repetindo os Passos 4.4–4.6). Se a eficiência não melhorar, considere reotimizar o MOI ou testar uma preparação diferente do lentivírus. Veja a Tabela 1, Ponto número 6 para essas e outras dicas de solução de problemas.
7. Ao observar que as neurosferas em desenvolvimento parecem saudáveis e que há evidências de infecção (positivo para GFP; ~80%), proceda à divisão das células conforme os Passos 2.3–2.6 acima. Resuspenda as células em 5 mL frescos de meio completo de NSC contendo a concentração apropriada de blasticidina (1000 ng/mL), depois filtre através de filtros estéreis de 40 μm para eliminar aglomerados celulares. Conte as células, depois placar aproximadamente 5 x^{10 4} células/mL em frascos T-25 de ultra-baixa fixação.
   NOTA: Após a adição inicial do antibiótico, pode haver uma alta taxa de morte celular à medida que as células não transdutas morrem; Isso é esperado e deve melhorar com a seleção contínua.
8. Expanda as células alimentando-a a cada 3 dias com um suplemento alimentar contendo blasticidina. Quando totalmente formadas, esferas saudáveis são visíveis, geralmente 5–10 dias após a divisão, a cultura está pronta para uso nas Etapas 5 ou 6.
   NOTA: Após uma expansão adicional dos clones resistentes, as células podem ser coletadas para Western blot (descrito no Passo 7) para validar se o construto oncogênico marcado com HA e marcado não fluorescentemente está sendo expresso adequadamente. Se o Western blot for realizado nessa etapa, ainda é recomendado que a expressão seja verificada após a^{segunda transdução} (no Passo 7), para garantir uma expressão contínua adequada.

5. Curva de eliminação da puromicina em NSCs resistentes à blasticidina

NOTA: A concentração ótima de seleção para a segunda transdução também deve ser determinada empiricamente. CSN transduzidos resistentes à blasticidina são usados nessa etapa, e as células são mantidas sob seleção de blasticidina (1000 ng/mL) durante todo o tempo, pois a transdução e a seleção simultânea de blasticidina podem alterar a sensibilidade à puromicina.

1. Pré-aqueça o meio base do NSC, DM, 0,05% de Tripsina-EDTA e PBS a 37 °C. Descongelam estoques de B27, N2, FGF, EGF, FBS, blasticidina e puromicina. Antes de iniciar, ou durante as etapas de incubação abaixo, prepare um meio NSC completo fresco e 10% de FBS no meio NSC, conforme descrito acima.
2. Utilizando neurosferas resistentes à blasticidina, tripsinize e subsequentemente dividi-se conforme os Passos 2.5–2.7, ressuspendendo em 1 mL de NSC fresco para contagem e filtragem e remoção de aglomerados. Conte as células conforme descrito no Passo 2.8, depois resuspenda 25.000 células viáveis em 2,5 mL alíquotas de NSC completo fresco em 15 mL cônicas, com 1 alíquota preparada por concentração de antibiótico a ser testada. Planeje testar pelo menos 4–6 concentrações diferentes, embora mais possam ser testadas se desejado.
3. Adicione blasticidina para alcançar a concentração previamente otimizada (1000 ng/mL = 0,25 mL de estoque não diluído / 2,5 mL aliquota). Depois, adicione a quantidade apropriada de puromicina a cada tubo para alcançar a concentração final desejada (veja cálculos exemplos na Tabela 2).
4. Placa de 500 μL de células suspensas (5.000 células) por poço em uma placa de fixação ultra-baixa de 24 poços, com cada concentração em quadruplicatada.
5. Incube as células a 37 °C. Verifique as células cuidadosamente usando microscopia de campo claro a cada 24 horas para detectar mudanças na morfologia e morte celular/neurosfera. Alimente as células a cada 3 dias adicionando 0,25 mL de meio alimentar novo de NSC suplementado com blasticidina e a concentração correta de puromicina.
6. Determine a concentração apropriada para a seleção subsequente de puromicina, identificando a menor concentração que mata células entre 72 e 120 horas após a placagem.
   NOTA: Para CSN murinos adultos transduzidos com lentivírus ilustrativos GFP e/ou BRAF-V600E, 100 ng/mL puromicina foi empiricamente determinada como a melhor concentração para seleção do antibiótico (Figura 4). Para as transduções de exemplo, passos subsequentes foram realizados usando 1000 ng/mL de blasticidina (do Passo 3 acima) e 100 ng/mL de puromicina (do Passo 5 acima). Veja a Tabela 1, Ponto número 5 para dicas de solução de problemas.

6. Segunda transdução lentiviral

NOTA: As células permanecem em meios contendo blasticidina durante a segunda fase de transdução para garantir que o construto oncogênico ou controle de GFP introduzido na primeira fase de transdução seja mantido nas células.

1. Inicie o procedimento utilizando NSCs resistentes à blasticidina, que proliferam ativamente e são estabilidademente transduzidas (gerados no Passo 4). Comece dissociando os NSCs em uma suspensão de célula única (Etapas 2.3–2.7) para garantir uniformidade durante o revestimento.
2. Células de placas com densidade de 1,5 x 10⁶ células por poço em meio NSC completo com blasticidina (1000 ng/mL, conforme determinado no Passo 3) em uma placa de ultra baixa aderência de 6 poços. Incube as placas durante a noite a 37 °C.
3. No dia seguinte, as células estarão prontas para transdução caso formem pequenos aglomerados. Descongele o lentivírus bicustrônico (contendo luciferase e RFP) no gelo, depois aqueça brevemente até 37 °C imediatamente antes da infecção. Determine o volume de LVP a ser adicionado a cada poço, usando a fórmula MOI x número de células/título do vírus; um MOI de 20 é usado aqui.
   1. Usando uma micropipeta ajustada ao volume calculado, adicione lentamente os LVPs gota a gota às células cultivadas. Gire a placa suavemente para distribuir, tomando cuidado para não espalhar o meio em poços adjacentes. Incube as células a 37 °C por 24 horas.
4. No dia seguinte, centrifuge as neurosferas a 630 × g por 5 minutos a 4 °C e replace-as em um NSC completo e fresco contendo blasticidina (1000 ng/mL, conforme Passo 3).
5. No dia seguinte, avalie a eficiência da segunda etapa de transdução determinando a proporção de células/aglomerados positivos para RFP em relação ao total de células/aglomerados por microscopia de fluorescência em múltiplos campos, com eficiência ótima de ~60%.
6. Ao observar que as neurosferas parecem saudáveis e que a segunda etapa de transdução foi eficaz (por exemplo, a maioria dos aglomerados celulares é RFP+), as células estão prontas para a dupla seleção. Comece dissociando os NSCs em uma suspensão de célula única (Passos 2.3–2,7), depois replacar aproximadamente 5 x 10⁴ células/mL em frascos T-25 de ultra-baixa fixação em NSC completo contendo blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL).
   NOTA: Como no Passo 4.6 acima, se for observada eficiência de transdução subótima, pode ser realizada uma segunda rodada de infecção (repetindo os Passos 6.3–6.6). Veja a Tabela 1 para mais dicas de solução de problemas.
7. Alimente as células a cada 3 dias com um suplemento contendo blasticidina e puromicina.
   NOTA: O monitoramento vigilante das culturas é essencial para identificar clones duplamente resistentes, que serão caracterizados por sua sobrevivência sob ambas as pressões seletivas. Quando esferas totalmente formadas e saudáveis são visíveis, geralmente 5–10 dias após a divisão, a cultura está pronta para validação adicional (Passo 7).

7. Validação e caracterização de NSCs duplamente transduzidas

NOTA: Antes de realizar experimentos in vitro ou in vivo, recomenda-se uma validação adicional para garantir que os construtos marcados com HA e a luciferase sejam expressos adequadamente.

1. Western blot para validar a expressão do construto marcado com HA
   1. Culturas de NSCs (controle GFP e BRAF marcado com HA. V600E, no exemplo fornecido) em frascos de adesão ultra-baixa T-25 até estarem prontos para se dividir (conforme Passo 2.2).
      NOTA: Antes de prosseguir para a próxima etapa, recomenda-se que as culturas sejam verificadas duas vezes quanto à expressão contínua de GFP (em células de controle de GFP) e à expressão de RFP (em todas as células).
   2. Remova metade da cultura e divida conforme os Passos 2.2–2.7, depois replate em meio NSC novo e completo com blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL) para expansão contínua da cultura. Centrifuge o restante das neuroesferas a 630 × g a 4 °C, depois aspire o supernadante.
   3. Em seguida, lave os NSCs em pellets duas vezes com PBS gelado, centrifugando a 630 × g a 4 °C e aspirando o sobrenadante após cada lavagem. Adicione aproximadamente 200 μL de tampão de lise RIPA gelado, suplementado com protease e inibidores de fosfatase a cada amostra.
   4. Deixe os lisados incubarem no gelo por 30 minutos, garantindo vórtices intermitentes a cada 10 minutos. Centrifuge as amostras a 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Transfira cuidadosamente o sobrenadante, designado como lisado limpo, para um tubo pré-resfriado fresco. Armazene os lisados a -80 °C em um freezer profundo.
   5. O lisado pode então ser usado para Western blotting (para validar a expressão de construtos) de acordo com protocolos^{previamente estabelecidos 38}.
      NOTA: Se não for usado imediatamente, armazene os lisados a -80 °C até o uso. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento para manter a integridade da amostra ( veja Tabela 1, Ponto nº 7).
2. Intensidade de bioluminescência (BLI) para validar a expressão apropriada da luciferase de vagalumes
   NOTA: Este protocolo valida a expressão de luciferase usando monitoramento BLI de células vivas usando hardware e software específicos (veja a Tabela de Materiais para mais detalhes). Se for utilizado um sistema diferente para detecção e quantificação de BLI, a metodologia pode variar.
   1. Divida os NSCs e quantifique conforme os Passos 2.2–2.8 acima, depois dilua as células em meio e placa completa de NSC em concentrações variadas (por exemplo, 2,5 x 10⁴ células, 1 x 10⁵ células/poço) em uma placa de ultra-baixa aderência de 24 poços (500 mL/poço), com cada concentração celular quadruplicada em quadruplicat. As células são mantidas em meio completo de NSC contendo blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL).
      NOTA: Para evitar que a intensidade da luminescência secretada por luciferase de um poço transborde para poços adjacentes durante a medição, evite as NSCs de revestimento em poços adjacentes.
   2. Ligue o sistema de imagem com pelo menos 30 minutos de antecedência para permitir que a câmera do dispositivo acoplado de carga resfrie até sua temperatura ideal de operação (aproximadamente -90 °C). Inicie o software de quantificação e higienize a câmara de imagem usando 70% de etanol, permitindo que seque completamente antes do uso.
      NOTA: Mantenha a temperatura da câmara de imagem em 37 °C para garantir a viabilidade celular durante sessões prolongadas de imagem.
   3. Descongele as alíquotas de D-luciferina, garantindo que estejam protegidas da exposição à luz. Adicione suavemente um volume de 5 μL de solução de trabalho de D-luciferina 15 mg/mL em cada poço contendo células para alcançar uma concentração final de 150 mg/mL. Gire levemente a placa para garantir uma distribuição uniforme da solução.
   4. Incube a placa a 37 °C por 10 minutos para facilitar a difusão do substrato para dentro das células, promovendo assim a produção máxima de luz.
   5. Posicione a placa dentro do sistema sensível de bioluminescência de imagem. Coloque uma grade sobre a placa. Selecione o modo de imagem por luminescência , começando com a exposição automática para o tempo de exposição. Ajuste o binning para médio e ajuste o f-stop para 1 para otimizar a coleta de luz.
      1. Ajuste o campo de visão para 'D' para placas de 24 poços e fixe a altura do sujeito em 1,5 cm. Adquira imagens usando o software de imagem. Se o sinal parecer baixo, o tempo de exposição pode ser ajustado manualmente (veja Ponto 8 da Tabela de Solução de Problemas).
   6. Realize correções de fundo contra os poços de controle e quantifique as unidades relativas de luz conforme necessário para análises subsequentes usando o software de imagem.
      NOTA: Após a validação do BLI, as células podem ser transplantadas ortotopicamente para o cérebro de camundongos sintéticos ou imunocomprometidos, de acordo com protocolos^{previamente estabelecidos 19}.

Resultados

Os NSCs adultos foram isolados do córtex de camundongos adultos C57BL/6 e cultivados em cultura^{não aderente 39}, resultando na formação de neurosferas primárias (20 – 250 μm) em 7 a 10 dias (Figura 1). As células foram então expandidas in vitro. A otimização da seleção de blasticidina foi então realizada em NSCs não transduzidos (Passo 3). Após 24 horas de seleção, concentrações iguais ou superiores a 1000 ng/mL (1 μg...

Discussão

Esse método de transdução lentiviral em duas etapas gerou com sucesso NSCs geneticamente modificados, adequados para pesquisas oncoológicas. Aqui, foi ilustrada a integração eficaz da mutação oncogênica BRAF V600E (encontrada em um subconjunto de gliomas adultos de alto grau e usada aqui como prova de conceito) ou do controle por GFP com sistemas de repórter duplo para imagem por bioluminescência (luciferase) e detecção por microscopia de fluorescência (RFP). Transdução sucessiv...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
& beta;-mercaptoetanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Use dentro do gabinete de segurança biológica. Faça estoques de 50 mM adicionando 35 mL BME a 10 mL DMEM de baixa glicose, filtrando esterilmente e alíquota em alíquotas de 500 mL para uso na preparação do meio.
Anti-mouse IgG, Anticorpo ligado a HRP	Cell Signal Technology	7076	Usado em diluição 1: 2000 em 1% Leite sem gordura
Suplemento B-27 (50X),	Gibco	17504-044	Na primeira utilização, descongele e faça alíquotas de 1ml para uso futuro; armazene as alíquotas a -20 ° C. Mantenha os suplementos no gelo após o descongelamento até estar pronto para adicionar ao meio
Blasticidina S HCl (10 mg / mL)	Gibco	A1113903	Faça alíquotas do estoque de 10 mg / mL; coloque em tubos pequenos de 200 mL e armazene a -20 ° C até o uso.
Álbumina sérica bovina (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Usado como 10% de BSA peso / volume em 1x PBS. A BSA é pegajosa; certifique-se de pesar corretamente e adicionar um volume apropriado de diluente para fazer a solução exata.
Peneira de Células (40 μm)	Midsci	40ICS	Pré-esterilizado e individualmente embalado. Deve ser aberto dentro do gabinete de segurança biológica. Não tocar com as mãos
D-Luciferina, Sal de Potássio	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Faça solução de trabalho de 15 mg / mL (diluída em água molecular) e filtre esterilmente antes do uso. Prepare estoque fresco a cada vez e adicione diretamente ao meio para atingir a concentração de trabalho final de 150 mg / mL (por exemplo, 5 mL de solução de trabalho por 500 mL de cultura)
DMEM, Baixa Glicose	Gibco	11885-084	Usado para fazer meio NSC base
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)	Corning	354001	Fornecido como pó liofilizado estéril; para reconstituição de estoque 1000X, adicione 4,95 mL PBS e 50 μL de 10% de BSA (em 1x PBS) a 100 μg de pó liofilizado de EGF, e pipete para combinar. Faça alíquotas de 500 μL ou menores em tubos pequenos e armazene a -20 ° C até o uso para meio NSC completo e suplemento de alimentação NSC. Evite repetições de congelamento e descongelamento.
Fator de Crescimento de Fibroblastos, Básico (FGF)	R & amp; D systems	233-FB	Fornecido como pó liofilizado estéril; para reconstituição de estoque 1000X, adicione 1,24 mL de PBS e 12,5 μL de 10% de BSA (em 1x PBS) a 25 μg de pó liofilizado de FGF, e pipete para combinar. Faça alíquotas de 500 μL ou menores em tubos pequenos e armazene a -20 ° C até o uso para meio NSC completo e suplemento de alimentação NSC. Evite repetições de congelamento e descongelamento.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	Usado em diluição 1: 1000 em 3% de albumina bovina (Western blotting, para verificar a expressão de HA-tag)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
IVIS 50	PerkinElmer		O instrumento deve ser ligado 30 minutos antes do uso para permitir que a câmera resfrie até a temperatura ideal. O software Living Image (versão 4.3.1) é usado para quantificação.
Lentivirus-Luciferase (Firefly) -2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP deve ser aliquotado e armazenado em geladeira a -80 ° C
L-Glutamina, 200 mM	Corning	25-005-CI	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
Água de Grau Molecular	Corning	46-000-CM	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
Suplemento N-2 (100x)	Gibco	17502-048	Na primeira utilização, descongele e faça alíquotas de 1ml para uso futuro; armazene as alíquotas a -20 ° C. Mantenha os suplementos no gelo após o descongelamento até estar pronto para adicionar ao meio
Nestin (E5C7I) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	89529	Usado em diluição 1: 1000 em 3% de albumina bovina (Western blotting, para verificar a expressão de marcador NSC)
Meio Neurobasal	Gibco	21103-049	Usado para fazer meio NSC base
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL)	Gibco	15140-122	Fornecido como solução estéril; alíquota e armazene a -20 ° C até o uso.
Soro tampão fosfato, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	Fornecido como solução estéril. Não abra fora do gabinete de segurança biológica
Inibidor de protease / fosfatase	Cell Signal Technology	5872S	Deve ser armazenado a -20 ° C
Diidrocloreto de Puromicina	Gibco	A1113803	Faça alíquotas do estoque de 10mg / ml; coloque em tubos pequenos de 200 mL e armazene a -20 ° C até o uso.
RIPA Lysis Buffer, 10x	Millipore-Sigma	20-188	Armazene a -80 ° C e faça alíquotas de 1x em água duplamente destilada estéril
Meio de congelamento celular sem soro	Bambanker (Nippon Genetics)	CS-04-001 / BB02	Dilua as células em 1ml de meio de congelamento por cryovial para armazenar NSCs. Após a adição do meio de congelamento às células, as células podem ser colocadas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo; não há necessidade de resfriamento lento ou armazenamento em N2 líquido.
Bicarbonato de sódio (7,5%)	Corning	25-035-CI	Fornecido como solução estéril. Não a