Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Resumo

A tuberculose (TB) continua sendo uma das principais causas de morte por um único agente infeccioso no mundo, com o aumento das taxas de resistência a medicamentos tornando o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos uma prioridade global para a saúde. Esse protocolo descreve uma abordagem fenotípica de triagem para identificar potenciais candidatos a medicamentos anti-TB em três estágios integrados. Primeiro, um composto da classe 4-aminoquinolina é sintetizado por uma rota de três etapas e totalmente caracterizado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS). Segundo, a atividade antimicrobiana do composto é avaliada contra Mycobacterium tuberculosis usando o ensaio de microplacas de redução colorimétrica de resazurina (REMA), que determina a concentração inibitória mínima (CIM) por meio de uma simples leitura visual de mudança de cor. Terceiro, a citotoxicidade do composto é avaliada em duas linhagens celulares de mamíferos, Vero (rim do macaco verde africano) e HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), utilizando o ensaio MTT (brometo 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenilo tetrazólio) e o ensaio de captação vermelha neutra (NRU). Esses dois ensaios complementares medem parâmetros celulares distintos, permitindo a validação cruzada dos resultados de citotoxicidade. Juntos, os dados de CMI e citotoxicidade permitem o cálculo de um índice de seletividade (SI) para avaliar o potencial terapêutico de cada composto. Esse protocolo fornece uma estrutura reprodutível e passo a passo para identificação de impactos anti-TB em estágio inicial e avaliação pré-clínica.

Introdução

Causada predominantemente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a tuberculose (TB) é uma doença respiratória infecciosa em humanos que atua principalmente nos pulmões, embora variantes extrapulmonares também possam ocorrer. A TB se espalha por bacilos Mtb no ar liberados por indivíduos com doença^{ativa 1}. Dependendo da progressão da doença, uma pessoa infectada com tuberculose pode adquirir tuberculose ativa imediatamente. Normalmente, porém, um indivíduo recém-infectado desenvolve tuberculose latente, onde células Mtb com baixa atividade metabólica sobrevivem dentro dos^{granulomas 1,2}. Uma pessoa com tuberculose latente pode eventualmente desenvolver a forma ativa da doença, manifestando sintomas^{clínicos 3}. Atualmente, estima-se que um quarto da população mundial tenha infecção latente por^{tuberculose 4}.

Apesar de muitos avanços, a tuberculose continua sendo um sério problema de saúde pública em todo o mundo. Dados do Relatório Global de Tuberculose mais recente mostram que 10,7 milhões de pessoas desenvolveram a doença em 2024. No mesmo ano, 1,23 milhão de mortes por tuberculose foram registradas no mundo todo, tornando a TB a principal causa de morte por um único agente^{infeccioso 5}. Além da patologia e da biologia complexa do Mtb, aspectos socioeconômicos como pobreza e desnutrição, juntamente com fatores relacionados à saúde como tabagismo, diabetes e co-infecção por HIV, tornam o controle de doenças ainda mais^{desafiador 5}. Isso contribui para a permanência de longa data da tuberculose como uma questão global de saúde.

Além disso, os tratamentos atuais para tuberculose apresentam limitações que complicam a luta contra a doença. Contra cepas suscetíveis de MTB, o tratamento padrão consiste em uma terapia combinada de 4 medicamentos: isoniazida (INH), rifampicina (RIF), etambutol (EMB) e pirazinamida (PZA). Esses antibióticos são administrados por um mínimo de 6 meses, exigindo adesão rigorosa durante todo o tratamento. Esse regime terapêutico, apesar de ser eficiente na maioria dos casos e ter uma taxa de sucesso em torno de 85%, ainda enfrenta muitos desafios ^5,6. Entre os maiores problemas estão os efeitos colaterais e a duração prolongada, que frequentemente levam à interrupção prematura do paciente. Essa descontinuação, juntamente com a administração incorreta dos antibióticos, favorece a seleção de cepas resistentes de Mtb, que exigem regimes terapêuticos mais tóxicos, caros e^{extensos 7,8}.

Considerando esse cenário, o desenvolvimento de novos e potentes medicamentos anti-TB é urgente. Este protocolo descreve as etapas iniciais da pesquisa de novos candidatos a medicamentos usando triagem fenotípica. Para ilustrar a aplicação desse protocolo, selecionamos um composto de 4-aminoquinolina derivado do LABIO-17 para avaliação. O LABIO-17 foi identificado anteriormente por nosso grupo de pesquisa como um inibidor da enzima enoil-ACP-redutase (InhA) na Mtb, que é o mesmo alvo molecular da isoniazida (INH^)9,10. O InhA está envolvido na biossíntese do ácido micólico em M. tuberculosis e é essencial para a sobrevivência do bacilo, destacando sua relevância como um alvo molecular^{promissor 11}

Protocolo

1. Síntese química e caracterização

NOTA: A síntese e caracterização do composto químico são realizadas conforme descrito^{anteriormente 10}. Todos os passos de 1.1 a 1.4 devem ser feitos em uma exaustão de fumo bem ventilada, usando luvas de nitrilo.

1. Preparação de reagentes
   1. Preparação de MeOH/CH₃CN (1:1) com 0,1% de ácido fórmico
      1. Meça volumes iguais de metanol (MeOH) e acetonitrila (CH₃CN) para preparar uma mistura 1:1 (v/v) (grau HPLC).
      2. Combine os solventes em um recipiente limpo e seco (por exemplo, um frasco volumétrico). Adicione ácido fórmico para alcançar uma concentração final de 0,1% (v/v) (por exemplo, adicione 1 mL de ácido fórmico a 1 L de mistura solvente).
      3. Misture bem mexendo suavemente ou girando. Guarde em um recipiente bem fechado em temperatura ambiente, protegido da luz.
   2. Preparação de ácido acético 1% (v/v) em água ultrapura
      1. Enxágue o frasco volumétrico com água ultrapura e depois coloque-o na bancada. Adicione ~80% do volume final de água ultrapura ao frasco (ou seja, 80 mL para um frasco de 100 mL; 800 mL para um cantil de 1 L).
      2. Usando uma pipeta calibrada, adicione ácido acético glacial para alcançar 1% (v/v): para um volume final de 100 mL → adicione 1,0 mL de ácido acético; para 1 L de volume final → adicionar 10,0 mL de ácido acético.
      3. Misture bem mexendo ou agitando. Encha o frasco até a última marca com água Ultrapure e misture.
      4. Desgasifice a solução por sonicação usando um limpador ultrassônico (frequência do tanque ~40 kHz) ajustado para modo de desgaseificação por 20 minutos à temperatura ambiente.
      5. Transfira para um frasco âmbar rotulado (rótulo: conteúdo, concentração, grau solvente, data, preparador). Guarde bem fechado em temperatura ambiente.
   3. Preparação de Acetonitrila: Metanol (1:1, v/v), Grau HPLC
      1. Meça volumes iguais de acetonitrila e metanol: Para volume final de 100 mL → 50,0 mL acetonitrilo + 50,0 mL metanol; para 1 L, volume final → 500 mL acetonitrila + 500 mL metanol.
      2. Combine os solventes em um frasco ou garrafa volumétrica limpa e misture por inversão ou mexida. Filtre a mistura através de um filtro de 0,45 μm em um recipiente limpo para remover partículas.
      3. Desgasifice a solução por sonicação usando um limpador ultrassônico (frequência do tanque ~40 kHz) ajustado para modo de desgaseificação por 20 minutos à temperatura ambiente.
      4. Transfira para uma garrafa âmbar rotulada (rótulo: composição, grau solvente, data, preparador). Guarde bem fechado em temperatura ambiente, longe do calor e da luz.
   4. Preparação de solução 7:3 (v/v) de Hexano/Acetato de Etil para cromatografia em coluna
      1. Meça 70% do volume final em hexano. Exemplo: para volume final de 100 mL → hexano de 70 mL.
      2. Meça 30% do volume final em acetato de etil. Exemplo: para volume final de 100 mL → 30 mL de acetato de etil.
      3. Combine ambos os solventes em um recipiente limpo e seco (por exemplo, frasco volumétrico ou garrafa).
      4. Misture bem invertendo ou mexendo até ficar homogêneo. Rotule o recipiente com composição, data, grau solvente e preparador.
   5. Preparação de solução 1:1 (v/v) de Hexano/Acetato de Etila para cromatografia em coluna
      1. Meça 50% do volume final em hexano. Exemplo: para volume final de 100 mL → hexano de 50 mL.
      2. Meça 50% do volume final em acetato de etil. Exemplo: para volume final de 100 mL → 50 mL de acetato de etil.
      3. Combine ambos os solventes em um recipiente limpo e seco (por exemplo, frasco volumétrico ou garrafa). Misture bem invertendo ou mexendo até ficar homogêneo.
      4. Rotule o recipiente com composição, data, grau solvente e preparador.
   6. Preparação de uma solução de bicarbonato de sódio saturado (NaHCO₃)
      1. Pesar uma quantidade excessiva de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) (aproximadamente 15–20 g para cada 100 mL de água).
      2. Adicione o bicarbonato de sódio a um béquer limpo contendo um volume conhecido de água destilada (por exemplo, 100 mL). Mexa a mistura continuamente em temperatura ambiente (20–25 °C) usando um agitador magnético ou haste de vidro.
      3. Continue mexendo até que nenhum mais sólido se dissolva e uma pequena quantidade de bicarbonato de sódio não dissolvido permaneça no fundo — isso indica que a solução está saturada.
      4. Deixe a suspensão descansar por 10–15 minutos para que o sólido não dissolvido se assente. Filtre a mistura através de um filtro de papel ou funil de vidro sinterizado para remover o excesso de bicarbonato não dissolvido.
      5. Colete o filtrado transparente, que é a solução saturada de bicarbonato de sódio.
      6. Armazene a solução em um frasco bem fechado, devidamente rotulado com o nome do composto, concentração (saturado), data de preparação e suas iniciais.
      7. Mantenha a solução em temperatura ambiente e prepare fresca quando necessário, pois o_CO2 pode escapar lentamente e alterar a concentração ao longo do tempo.
2. Síntese de 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (3)
   1. Prepare uma solução contendo 4-bromoanilina (1,2 g, 7,3 mmol) e sulfato de magnésio anidro (1,08 g, 9,0 mmol) em etanol (15 mL).
   2. Adicione ácido acético glacial (0,33 mL) e acetoacetato de etil (1,8 mL, 14,1 mmol) à solução. Mexa a mistura de reação a 90 °C por 16 horas.
   3. Filtre a mistura da reação através de celulose, retenção de 11 μm e papel filtro qualitativo para remover o sulfato de magnésio em suspensão.
   4. Evapore o etanol usando um evaporador rotativo para obter o intermediário de acrilato.
   5. Aqueça o intermediário usando um banho de óleo apropriado contendo um fluido sintético de transferência de calor de alto desempenho (veja Tabela de Materiais) (15 mL) a 230–250 °C por 15 minutos para completar a reação.
   6. Esfrie a mistura até a temperatura ambiente. Filtre o precipitado formado e lave com hexano e clorofórmio.
   7. Concentre o produto final sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo até que todos os solventes residuais sejam removidos (veja a Tabela de Materiais).
3. Síntese de 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (4)
   1. Prepare uma solução de 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) em tolueno (10 mL). Adicione oxicloreto de fósforo (V) (0,65 mL, 6,9 mmol) à solução.
   2. Mexa a mistura da reação a 110 °C por 2 horas. Remova o excesso de oxicloreto de fósforo(V) usando um evaporador rotativo.
   3. Esfrie o resíduo em um banho de gelo. Neutralize a mistura de reação com solução saturada de bicarbonato de sódio.
   4. Extraia o produto com acetato de etílica (3 x 50 mL). Combine as fases orgânicas e seque sobre sulfato de sódio anidro.
   5. Evapore o solvente usando um evaporador rotativo para obter um resíduo sólido. Seque o sólido resultante usando um evaporador rotativo para obter o produto bruto.
   6. Purifique o composto por cromatografia flash em gel de sílica (malha 35–70) usando hexano:acetato de etil (7:3) como eluente.
4. Síntese de 6-Bromo-2-metil-N-(4-(piperidina-1-il)fenil)quinolina-4-amina (6)
   1. Prepare uma mistura de reação contendo 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidina-1-il)anilina (0,57 g, 3 mmol), piridina (0,24 mL) e HCl 37% (0,2 mL) em isopropanol (20 mL).
   2. Mexa a mistura de reação a 85 °C por 16 horas. Remova o solvente usando um evaporador rotativo.
   3. Trate o resíduo com solução saturada de bicarbonato de sódio.
   4. Filtre o sólido resultante através de um papel filtro qualitativo de celulose com retenção de 11 μm e dissolva-o em clorofórmio (50 mL).
   5. Lave a solução de clorofórmio com água (3 x 15 mL). Seque a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro.
   6. Evapore o solvente usando um evaporador rotativo para obter um sólido verde. Purifique o produto por sucessivas lavagens com hexano quente (4 x 10 mL).
   7. Realize a purificação final por cromatografia flash em gel de sílica (malha 35–70) usando hexano:acetato de etila (1:1) como eluente.
5. Cromatografia de Camada Fina (TLC)
   1. Monitore o progresso da reação usando cromatografia de camada fina (TLC) em placas de gel de sílica TLC 60 F254.
   2. Use o material inicial 4 como referência para monitorar a reação e avaliar seu consumo.
6. Ponto de fusão (m.p.)
   1. Adicione a ponta de uma espátula do composto ao aparelho de ponto de fusão. Registre a faixa do ponto de fusão.
   2. Não aplique correções aos valores medidos. Realize o experimento em triplicado.
7. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC)
   1. Pesar 1–2 mg de composto 6. Prepare uma solução estocada do composto a 1,0 mg/mL em acetonitrila/metanol (1:1, v/v).
   2. Dilua a solução original para 0,5 mg/mL para análise. Analise as amostras usando um sistema HPLC (veja Tabela de Materiais) equipado com bomba dupla, injetor automático e detector UV.
   3. Adquirir e processar dados usando software de aquisição de dados de cromatografia (veja Tabela de Materiais).
   4. Defina as condições cromatográficas da seguinte forma: use uma coluna C18 de fase reversa, 5 μm (250 x 4,6 mm) (veja Tabela de Materiais). Ajuste a vazão para 1,5 mL/min e monitore a detecção UV em 254 nm. Mantenha a fase móvel a 100% de água (0,1% ácido acético) de 0 a 7 minutos; Aplicar um gradiente linear de 100% água (0,1% ácido acético) a 90% acetonitrila/metanol (1:1, v/v) de 7 a 15 minutos; Volte a 100% de água (0,1% ácido acético) por 5 minutos e segure por mais 10 minutos.
8. Ressonância Magnética Nuclear (¹H, ¹³C)
   1. Pesar 15–20 mg do composto 6 em um tubo de RMN. Adicione_{DMSO-d 6} como solvente.
   2. Adquira espectros de RMN ^{de 1}H e ¹³C em um espectrômetro de RMN (veja Tabela de Materiais) usando sequências de pulsos padrão.
   3. Opere o instrumento a 400 MHz para núcleos ^{de 1}H e 100 MHz para ¹³núcleos C. Use tetrametilsilano (TMS) como referência interna.
   4. Expressar deslocamentos químicos (δ) em partes por milhão (ppm). Use o arquivo FID obtido do experimento para visualizar e processar os dados da RMN.
9. Espectrometria de Massa de Alta Resolução (HRMS)
   1. Pesar 1–2 mg de composto 6. Prepare a amostra em uma mistura 1:1 de MeOH/CH₃CN contendo 0,1% de ácido fórmico.
   2. Realize a análise em um espectrômetro de massa Orbitrap de alta resolução (veja Tabela de Materiais), que combina um espectrômetro de massa linear de armadilha de íons com um analisador de massa Orbitrap.
   3. Introduza a amostra por infusão direta a uma vazão de 10 μL/min em modo íon positivo usando ionização por eletrospray (ESI).
   4. Determine a composição elementar usando a ferramenta de composição elementar no software de análise de dados de espectrometria de massa (veja Tabela de Materiais).
10. Cromatografia em Coluna – Composto 4
    1. Prepare uma coluna de gel de sílica usando gel de sílica de 60 Å (malha 70–230, 0,063–0,200 mm). Encha a coluna adequadamente com o gel de sílica.
    2. Use hexano/acetato de etila (7:3, v/v) como fase móvel. Carregue o composto bruto 4 na coluna. Elude o composto e colete frações.
    3. Monitore as frações por TLC e combine aquelas que contêm o produto puro.
11. Cromatografia em Coluna – Composto 6
    1. Prepare uma coluna de gel de sílica usando gel de sílica de 60 Å (malha 70–230, 0,063–0,200 mm). Encha a coluna adequadamente com o gel de sílica.
    2. Use hexano/acetato de etílio (1:1, v/v) como fase móvel. Carregue o composto bruto 6 na coluna. Elude o composto e colete frações.
    3. Monitore as frações por TLC e combine aquelas que contêm o produto puro.

Figura 1. Reagentes e condições: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 h; ii = C₁₂H₁₀, C_{12H 10}O, 230-250 °C, 15 min; iii =_{POCl 3}, Toluene, 110 °C, 2 h; iv = Piridina, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Determinação da Concentração Mínima Inibitória

1. Projeto experimental e disposição das placas
   1. Avalie os compostos quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de M. tuberculosis usando o ensaio de microplacas de redução colorimétrica de resazurina (REMA) para determinar a Concentração Mínima Inibitória (CMI), conforme descrito^{anteriormente 11,12,13}.
   2. Realizar três experimentos independentes (três réplicas biológicas) para cada composto testado sem réplicas técnicas (uma linha por composto e uma placa por experimento).
   3. Avalie compostos atuando como controles positivos junto com compostos de teste para garantir que as condições do ensaio permitam a inibição do crescimento.
   4. Ensaio Isoniazida (INH) e Rifampicina (RIF) como controles positivos.
   5. Atribua as linhas A e B para compostos de controle (INH e RIF, respectivamente).
   6. Atribua linhas subsequentes para compostos de teste (compostos A a F na Figura 2).
   7. Prepare as colunas 1 a 10 com diluições seriais em duas partes dos compostos de controle e teste, cada composto ocupando uma linha, com a maior concentração na coluna 10 e a menor na coluna 1.
   8. Prepare a coluna 11 como controle de viabilidade contendo meio de crescimento e bactérias em uma concentração final de DMSO de 2,5%, sem adicionar nenhum composto de controle ou teste.
   9. Prepare a coluna 12 como controle de esterilidade, adicionando compostos de controle ou de teste na maior concentração da diluição serial (igual à coluna 10) ao meio de crescimento sem células bacterianas.
   10. Consulte a Figura 2 para um layout representativo de uma placa MIC.
2. Preparação de Reagentes
   1. Preparação do Caldo Middlebrook 7H9 suplementado com Ácido Oleico, Albumina, Dextrose e Catalase (OADC).
      1. A um frasco de vidro de 200 mL contendo 90 mL de água ultrapura, adicione 0,47 g de pó 7H9, 0,24 mL de glicerol 85% e 0,5 mL de 10% Tween-80.
      2. Autoclave o meio por 10 minutos a 121 °C e 98,07 kPa.
      3. Deixe o meio esfriar até que esteja quente ao toque (aprox. 45–50 °C).
      4. Adicione 10 mL de OADC (usamos OADC comercialmente disponível; veja a Tabela de Materiais para detalhes).
      5. Armazene a 4 °C.
         NOTA: Prepare a quantidade apropriada para o experimento, considerando as proporções dos reagentes.
   2. Preparação do Caldo Middlebrook 7H9 com ADC
      1. A uma garrafa de vidro de 200 mL contendo 90 mL de água ultrapura, adicione 0,47 g de pó 7H9. Autoclave o meio por 10 minutos a 121 °C e 98,07 kPa.
      2. Deixe o meio esfriar até que esteja quente ao toque (aprox. 45–50 °C). Adicione 10 mL de ADC. Armazene a 4 °C.
         NOTA: Prepare a quantidade apropriada para o experimento, mantendo as proporções dos reagentes.
   3. Preparação de Soluções para Estoques Compostos
      1. Prepare uma solução de estoque de cada composto a 2 mg/mL dissolvido em DMSO.
      2. Armazene a –20 °C.
         NOTA: Antes do experimento, a concentração máxima no teste é definida com base em uma avaliação de solubilidade. Para determinar o limite de solubilidade, inspecione-se visualmente as soluções em busca de cristais. Se cristais forem observados, dilua ainda mais a alíquota para metade da concentração anterior. Realize essa avaliação usando DMSO de 5%.
   4. Preparação de Soluções de Trabalho Composto
      NOTA: As soluções de trabalho devem ser preparadas frescamente no momento do experimento, diluindo os compostos de origem em caldo 7H9 suplementado com 10% de ADC. A concentração final de DMSO na solução de trabalho deve ser de 5%, e a concentração do composto deve ser o dobro da maior concentração pretendida para o teste. Notavelmente, a concentração final de DMSO à qual as bactérias são expostas durante o ensaio é de 2,5%, pois o volume é dobrado após a adição da suspensão bacteriana (veja seção 2.3, passo 2.3.8).
      NOTA: DMSO 2,5% é tolerado pelas cepas bacterianas usadas em nosso laboratório (M. tuberculosis , H37Ra, H37Rv e isolados clínicos). Se estiver trabalhando com outras cepas ou espécies bacterianas, realize um experimento preliminar de CMI usando DMSO como composto de teste para determinar as maiores concentrações de DMSO que podem ser usadas sem promover a inibição do crescimento.
   5. Preparação da Solução de Resazurina
      1. Prepare uma solução de resazurina 0,01% dissolvendo 1 mg de resazurina em 10 mL de água ultrapura.
      2. Esterilize a solução usando um filtro de 0,22 μm.
         NOTA: A resazurina esterilizada com filtro pode ser armazenada a 4 °C por 1 semana^{e 14} semanas. No entanto, prepare essa solução imediatamente antes do uso, como prática padrão.
3. Preparação de micobactérias
   1. Inocular uma única colônia de M. tuberculosis em um tubo centrífugo de 50 mL contendo 10 mL de caldo 7H9 suplementado com 10% de OADC, 0,2% de glicerol e 0,05% Tween-80.
   2. Incube com agitação constante (100 rpm) a 37 °C até que a cultura atinja uma densidade óptica de 600 nm (OD₆₀₀) de 0,6 a 0,8 (aproximadamente 3 a 4 semanas).
      ATENÇÃO: M. tuberculosis H37Rv é classificado como um patógeno do Grupo de Risco 3, capaz de transmissão aérea e de causar doenças potencialmente letais em humanos. Realize todas as manipulações em um gabinete de biossegurança certificado dentro de um laboratório de biossegurança nível 3 (BSL-3), utilizando equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados.
   3. Homogeneize a cultura bacteriana vórtice com contas de vidro estéreis (1 mm) por 3 minutos.
   4. Deixe a suspensão descansar por 15 minutos para acalmar os aglomerados.
   5. Meça o OD₆₀₀ do sobrenadante e armazene alíquotas a −80 °C.
      NOTA: Para experimentos, dilua a suspensão bacteriana a um OD teórico_{de 600} de 0,006 em caldo fresco 7H9 suplementado com 10% de ADC. Dispense 100 μL por poço em placas de 96 poços durante o ensaio.
4. Preparação de Placas de 96 Poços
   1. Adicione 100 μL de caldo 7H9 complementado com 10% de ADC na coluna 12.
   2. Adicione 100 μL de caldo 7H9 suplementado com ADC 10% (contendo 5% de DMSO) nas colunas 11 e 9 a 1.
   3. Adicione 200 μL da solução composta (preparada ao dobro da maior concentração de teste) à coluna 10 (atribua uma linha por composto).
   4. Adicione 100 μL da solução composta à coluna 12. Realize uma diluição serial dupla: transfira 100 μL da coluna 10 para a coluna 9 e misture bem pipetando.
   5. Continue a diluição serial da coluna 9 até a coluna 1. Descarte os últimos 100 μL da coluna 1.
   6. Adicione 100 μL da suspensão bacteriana (OD teórico₆₀₀ de 0,006) às colunas 11 a 1.
   7. Cubra a placa, fele com parafilme e incube a 37 °C por 7 dias.
      NOTA: A Figura 2 é um layout representativo de uma placa MIC. Consulte esta figura para interpretar os passos 2.3.1 a 2.3.9.
5. Adição de Resazurin e Análise de Dados
   1. Adicione 60 μL de solução de resazirina a 0,01% em cada poço da placa. Cubra a placa, sele com parafilme e incube a 37 °C por 48 horas.
   2. Observe a mudança de cor do azul (inibição do crescimento) para o rosa (crescimento bacteriano).
      NOTA: Em alguns experimentos, uma mudança de cor incompleta resulta em um poço roxo. Interprete isso como crescimento bacteriano.

Figura 2. Representação esquemática de uma placa de microdiluição de caldo usada para determinar a Concentração Mínima Inibitória (CMI). Diluições em série duplas dos compostos testados foram distribuídas pelas colunas 1–10, as diluições subsequentes são realizadas sequencialmente da coluna 10 até a coluna 1, com a maior concentração de composto na coluna 10. As linhas A e B correspondem a controles positivos contendo os medicamentos de referência isoniazida e rifampicina, respectivamente. As linhas C–H correspondem aos compostos testados. A coluna 11 representa o controle de viabilidade (meio contendo 2,5% de DMSO e inoculo bacteriano), enquanto a coluna 12 corresponde ao controle de esterilidade (meio contendo os compostos na ausência de inoculo bacteriano). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Avaliação de Citotoxicidade em Linhas Celulares de Mamíferos

NOTA: Realize todas as manipulações de cultura celular sob condições estéreis em um gabinete de segurança biológica certificado Classe II.

1. Preparação de Linhagens Celulares de Mamíferos
   1. Cultivar as linhas celulares de carcinoma do fígado humano (HepG2) e rim de macaco verde africano (Vero) no Meio Modificado de Águia (DMEM) de Dulbecco.
   2. Suplemente o meio com 1,8 g/L de bicarbonato de sódio, 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e 0,1% de anfotericina B (referida como meio completo).
   3. Incubar as culturas celulares a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
   4. Colhe células subconfluentes (70%–80%) tratando-as com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% por 5–10 minutos.
   5. Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio completo. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 200 x g por 5 minutos.
   6. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a célula em 10 mL de meio fresco e completo.
   7. Determine a concentração e viabilidade celular usando um contador celular automatizado ou um hemocitômetro com exclusão de azul de tripano.
      NOTA: Para exclusão do azul de tripano, misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de solução de azul de tripano a 0,4% e coloque sobre o hemocitômetro (ou lâmina de contagem). Células mortas ou com membrana comprometida aparecem azuis, enquanto células viáveis permanecem sem coração. Calcule a viabilidade como % de viabilidade = (células não coradas / células totais) x 100. Prossiga com a semeadura somente se a viabilidade for ≥ 90%.
   8. Dilua a suspensão da célula até a densidade de semeadura alvo. Seme 100 μL de suspensão de células em cada poço das colunas 2 a 12 de uma placa de fundo plano com 96 poços.
      Densidades de semeadura: 4.000 células/poço para células Vero; 5.000 células/poço para células de HepG2.
      NOTA: Otimize essas densidades para garantir que as células permaneçam na fase de crescimento logarítmico e não atinjam 100% de confluência antes do final do ensaio de 48 horas.
   9. Preencha a coluna 1 com 100 μL de meio completo (sem células) para servir como espaço em branco para medições de absorvida.
   10. Prepare quatro placas idênticas para cada linha celular: duas para o ensaio MTT e duas para o ensaio NRU.
   11. Incubar as placas por 24 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir a fixação celular.
2. Diluição de Compostos e Tratamento Celular
   1. Prepare soluções de base para cada composto de teste no Soro Tamponado de Fosfato (DPBS) da Dulbecco ou em um solvente apropriado (por exemplo, dimetil sulfóxido; DMSO).
      NOTA: Verifique se o composto é solúvel no meio de cultura celular e que a concentração do solvente não é tóxica (por exemplo, <0,1% v/v para DMSO) antes do ensaio.
   2. Projete o layout das placas para incluir blanks, controles apropriados e réplicas técnicas. Um layout representativo para testar até 9 compostos em 8 concentrações é mostrado na Figura 3.
   3. Prepare diluições seriadas do(s) composto(s) de ensaio em meio completo para cobrir a faixa de concentração pretendida. Certifique-se de que volume suficiente esteja preparado para todas as placas replicadas.
      NOTA: Se estiver usando um solvente (por exemplo, DMSO), suplemente o meio de diluição para que a concentração final de solvente permaneça constante em toda a série de diluição seriada.
      NOTA: Poços tratados com solvente (controle veicular) servem como controle funcional negativo, definindo 100% de viabilidade celular contra a qual os poços tratados com composto são normalizados. Para validação do ensaio, inclua um composto citotóxico de referência (por exemplo, 0,1% Triton X-100 ou 1 mM dodecilo sulfato de sódio) em uma concentração conhecida por causar morte celular completa (viabilidade 0%). Os valores de absorção nesses poços controle positivos não devem diferir significativamente dos poços em branco, confirmando viabilidade de 0%.
   4. Após o período de fixação das células de 24 horas, inspecione-se visualmente as placas sob um microscópio invertido para confirmar que as células estão ligadas, espalhadas e cobrem aproximadamente 70%–80% da superfície do poço com confluência homogênea. Placas descartáveis que mostrem contaminação ou fixação insuficiente.
   5. Aspire cuidadosamente o meio de cultivo usando uma ponta de pipeta, inclinando a ponta para o lado de cada poço para evitar perturbar a monocamada celular. Processe as placas em seções para evitar a dessecação.
   6. Adicione imediatamente 100 μL das diluições ou meios de controle apropriados para o composto de teste aos poços correspondentes.
   7. Incubar as placas tratadas por 48 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
3. Protocolo de Ensaio MTT
   1. Prepare uma solução de 0,5 mg/mL de MTT em DMEM sem soro. Filtre por um filtro de seringa de 0,22 μm e proteja da luz.
   2. Após o tratamento de 48 horas, inspecionar visualmente as células para confirmar os efeitos esperados do tratamento.
   3. Aspire cuidadosamente o meio das placas MTT. Adicione 50 μL da solução funcional MTT de 0,5 mg/mL em cada poço.
   4. Incubar por 3 horas a 37 °C, 5% de CO₂, protegido da luz.
      NOTA: Embora 2–4 horas seja comum, uma incubação de 3 horas é tipicamente suficiente para as células Vero e HepG2. Otimize se necessário.
   5. Adicione 100 μL de 100% de DMSO a cada poço para dissolver os cristais de formazan. Coloque as placas em um agitador orbital a 100 rpm por 15 minutos, protegidas da luz. Inspecione os poços de controle para garantir a dissolução completa dos cristais. Leia a absorvância a 570 nm usando um leitor de microplaca. Se disponível, defina um comprimento de onda de referência de 630–690 nm.
4. Protocolo de Ensaio de Captação Neutra de Vermelho (NRU)
   1. Prepare uma solução de Vermelho Neutro (NR) de 40 μg/mL em DMEM e filtro sem soro. Prepare a Solução de Dessorção NR: 1% (v/v) de ácido acético glacial, 49% (v/v) etanol e 50% (v/v) de água ultrapura.
      ATENÇÃO: O ácido acético glacial é corrosivo; Cabo em uma exaustão.
   2. Após o tratamento de 48 horas, inspecione visualmente as células. Aspire cuidadosamente o meio das placas NRU.
   3. Adicione 100 μL da solução de trabalho de 40 μg/mL NR a cada poço. Incubar por 2 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
      NOTA: Uma incubação de 2 horas é suficiente para a captação máxima de corante nessas linhagens celulares.
   4. Aspire a solução de trabalho de NR. Enxágue suavemente cada poço uma vez com 150 μL de PBS estéril.
   5. Adicione 150 μL da Solução de Dessorção NR a cada poço. Coloque em um shaker orbital a 150 rpm por 15 minutos para extrair o corante.
   6. Inspecione os poços de controle para garantir a extração completa do corante. Leia a absorção a 540 nm usando um leitor de microplaca.
5. Análise de Dados
   1. Realize a subtração de fundo calculando a absorção média das colunas em branco e subtraindo esse valor de todos os poços.
   2. Realize a verificação de toxicidade de solventes comparando poços de controle de solventes com controles não tratados. Se a viabilidade estiver abaixo de um limiar definido (por exemplo, 80%), considere a citotoxicidade do solvente.
   3. Calcule a porcentagem de viabilidade em relação aos poços de controle de solventes:
      % de viabilidade = (absorção do poço tratado / absorção média do controle do solvente) x 100.
   4. Plote % de viabilidade (eixo y) em relação a log₁₀ da concentração composta (eixo x). Use um modelo de regressão não linear (dose-resposta sigmoidal, inclinação variável) para determinar CC₅₀.
   5. Calcule o Índice de Seletividade (SI) dividindo CC₅₀ pelo MIC.

Figura 3. Exemplo de design de placa para ensaio de viabilidade celular MTT/NRU, configuração precoce de triagem para testar citotoxicidade de até 9 compostos. (A) Esquema de design de placas. A coluna 1 é designada como "em branco", sem células, e preenchida com DPBS ou meio completo. As colunas 2 e 12 são semeadas com células e tratadas com meio completo ("controle não tratado") ou meio completo com solvente ("controle solvente"). As colunas 3 a 11 são semeadas com células e tratadas com diluições seriadas dos compostos testados, até 9 compostos com uma réplica por concentração testada por composto. (B) Fotografias representativas de uma placa Vero NRU (acima) e uma placa Vero MTT (abaixo) após o tratamento de 48 horas e as etapas finais do ensaio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

A síntese resultou no composto alvo 6 como um sólido verde-claro (0,53 g, rendimento de 67%). O composto apresenta ponto de fusão de 227–229 °C e pureza UHPLC de 99% (t_R = 14,11 min) (Figura 4). A estrutura química foi confirmada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS). O espectro de RMN ^{de 1}H (Figura 5) mostrou sinais correspondentes à metade da piperidina entre 1,50 e 3,13 ppm. O grupo metilo na posição 2 apareceu como um singlete típico com 2,38 ppm. O hidrogênio na posição 3 apareceu como um singlete a 6,56 ppm. O anel fenil apresentava dois doublets a 6,97 e 7,17 ppm, com uma constante de acoplamento de 8,9 Hz. Os hidrogênios nas posições 7 e 8 geravam um multiplete em 7,63–7,75 ppm, enquanto o hidrogênio na posição 5 do núcleo quinolínico produzia um duplo a 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). O hidrogênio amina foi observado como um singlete a 8,66 ppm. O espectro de RMN ¹³C (Figura 6) exibia um sinal de 23,81 ppm atribuído ao grupo metilo na posição 2, enquanto sinais entre 24,85 e 49,70 ppm correspondiam ao grupo piperidina. O carbono na posição 3 apareceu em 100,52 ppm. Os sinais remanescentes no campo foram atribuídos ao núcleo de quinolina e aos carbonos do anel fenil. A HRMS confirmou a fórmula molecular do composto 6, mostrando um íon [M+H^]+ em m/z 396,1063 (cálculo para C₂₁H₂₃BrN₃: 396,1070).

Figura 4. Cromatograma HPLC e espectros UV do composto 6. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5. ¹Espectros H NMR (400 MHz, DMSO-d6) do composto 6. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6. ^{Espectros de 13}C NMR (101 MHz, DMSO-d6) do composto 6. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A atividade inibitória do composto contra M. tuberculosis foi avaliada determinando a CMI, definida como a menor concentração de um composto que previne completamente o crescimento visível das bactérias. No ensaio REMA, a falta de mudança de cor (permanecer azul) indica inibição do crescimento, enquanto a mudança para o rosa indica crescimento bacteriano. Isoniazida (INH) e rifampicina (RIF) atuaram como controles de drogas. Os resultados são apresentados na Figura 7. Cada placa incluía um controle de crescimento (coluna 11, sem medicamentos) e um controle de esterilidade (coluna 12, sem micobactérias). Os compostos foram diluídos em série da coluna 10 (maior concentração) até a coluna 1 (menor concentração). Como mostrado na Figura 7, o valor de CMI para o composto na linha A (isoniazida) é observado na coluna 4, enquanto os valores de CMI para os compostos nas linhas B (rifampicina) e C (composto sintetizado) são observados na coluna 5. Em nossas mãos, os valores de CIM para INH são 0,31 μg/mL para a deformação H37Rv e 0,16 μg/mL para H37Ra, enquanto para RIF obtemos 0,08 μg/mL para H37Rv e 0,01 μg/mL para a deformação H37Ra.

Figura 7. Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) em Mycobacterium tuberculosis usando o ensaio de microplacas de resazurina (REMA). Linhas A–C, colunas 1–10: Diluições seriais duplas de isoniazida (linha A), rifampicina (linha B) e o composto sintetizado (linha C). Coluna 11: Controle de viabilidade (meio contendo 2,5% de DMSO + bactérias). Coluna 12: Controle de esterilidade (médio + composto). Uma cor azul indica inibição do crescimento bacteriano, enquanto uma cor rosa indica viabilidade bacteriana devido à redução da resazirina para resorufina. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Uma placa representativa de 96 poços tanto para os ensaios NRU (Vero, em cima) quanto para MTT (Vero, inferior) é mostrada na Figura 3B. Na placa MTT, é visível um gradiente de cor claro, mudando de translúcido (sem células viáveis) em altas concentrações compostas para um roxo profundo (alta viabilidade celular) em concentrações baixas. De forma semelhante, a placa NRU apresenta um gradiente do translúcido ao rosa profundo, indicando a absorção do corante vermelho neutro nos lisossomos das células viáveis.

A microscopia fornece uma confirmação visual do status do ensaio após o tempo de incubação de 48 horas (Figura 8). A Figura 8A compara células controle saudáveis e não tratadas (Vero e HepG2) com células tratadas com concentração citotóxica do composto. As células tratadas aparecem arredondadas, descoladas e inviáveis. A Figura 8B fornece um ponto de verificação visual crítico antes da etapa final de solubilização. Ele mostra a formação esperada de cristais de formazan roxo escuro dentro de células viáveis (ensaio MTT) e o acúmulo de corante vermelho nos lisossomos (ensaio NRU) em ambos os tipos celulares.

Os dados brutos de absorção foram normalizados para o controle do veículo e analisados por regressão não linear para gerar curvas dose-resposta conforme detalhado no passo 3.5 do protocolo. Para o composto alvo 6 (derivado do LABIO-17), essa análise resultou em um CC₅₀ de 12,2 μM (Vero) e 18,3 μM (HepG2) no ensaio NRU, e um CC₅₀ >20 μM para ambas as linhas celulares no ensaio MTT. Isso resultou em um Índice de Seletividade (IS) variando de 30,5 a >50, conforme já^{relatado 10}.

Figura 8. Imagens microscópicas representativas de ensaios de citotoxicidade em células Vero e HepG2. Todas as imagens foram tiradas com ampliação de 100x. (A) Comparação da morfologia celular após 48 horas de tratamento. Poços de controle não tratados para células Vero (superior) e HepG2 (inferior) mostram uma monocamada saudável e confluente. Em contraste, células tratadas com concentração citotóxica de um composto aparecem arredondadas, encolhidas e desprendidas da superfície da placa. (B) Pontos de verificação visuais críticos após a adição do reagente e antes da solubilização. No ensaio MTT (painéis esquerdos para cada linha celular), células viáveis contêm cristais visíveis de formazan roxo escuro. No ensaio NRU (painéis direitos para cada linhagem celular), células viáveis apresentam acúmulo de corante vermelho dentro dos lisossomos intactos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Uma abordagem fenotípica, que depende da atividade celular inteira em vez de enzimas isoladas, é uma estratégia eficaz para identificar compostos ativos contra M. tuberculosis. Aqui, descrevemos os passos iniciais dessa abordagem, abrangendo a síntese química de um composto candidato, a avaliação de sua atividade inibitória por meio da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e a avaliação de sua citotoxicidade em células de mamíferos (Vero e HepG2) usando ensaios MTT e NRU.

A rota sintética consistia em três etapas principais (Figura 1), que fornecem o composto alvo em alta pureza usando transformações operacionalmente diretas. Vários passos críticos foram identificados como determinantes para a reprodutibilidade e eficiência. A condensação inicial requer controle estequiométrico preciso e refluxo sustentado para garantir a formação intermediária completa. A remoção incompleta do solvente antes da ciclização térmica pode afetar negativamente a eficiência do fechamento do anel. A etapa de ciclização em si exige controle rigoroso de temperatura, pois aquecimento insuficiente resulta em aromatização incompleta, enquanto aquecimento excessivo ou prolongado pode promover a formação de subprodutos. Durante a cloração, o controle cuidadoso da temperatura da reação e a adição gradual de cloreto de fosforil são recomendados para minimizar reações colaterais e garantir a ativação seletiva na posição 4. Durante a otimização do método, pequenos ajustes procedurais melhoraram a robustez. Em casos de precipitação incompleta após ciclização, o resfriamento gradual, em vez da têmpera rápida, aumentou a recuperação dos sólidos. Se rendimentos reduzidos foram observados na etapa de substituição nucleofílica, estender o tempo de reação ou verificar a pureza da amina foi benéfico.

As principais limitações do método são a necessidade de ciclização em alta temperatura e reagentes cloradores corrosivos como cloreto de fosforilo, que requerem infraestrutura laboratorial específica e segurança. Efeitos eletrônicos substituintes podem exigir reotimização para diferentes anilinas ou aminas, limitando a ampla diversificação do andaime sem adaptação. No entanto, a abordagem Conrad–Limpach é operacionalmente mais simples do que sínteses do tipo Skraup (oxidadores agressivos) ou protocolos catalisados por metais de transição (catalisadores especializados/atmosferas inertes). Essa estratégia sem metais gera eficientemente intermediários de quinolina funcionalizados para a química medicinal.

O protocolo usado para determinar a CIM é um ensaio colorimétrico que depende da inspeção visual. Um possível desafio com esse método é a mudança de cor incompleta, resultando em um poço roxo em vez de azul distinto (inibição) ou rosa (crescimento). Se isso ocorrer, deve ser interpretado como uma falha em inibir o crescimento de micobactérias. Além disso, à medida que o composto é avaliado por diluição em série, a concentração máxima testável é ditada pela solubilidade do composto. Como resultado, em alguns casos, o resultado pode ser inconclusivo se não houver inibição observada na concentração máxima solúvel. Além disso, é importante reconhecer que outros laboratórios podem adaptar certas etapas do protocolo às suas condições específicas, o que pode levar a variações nos resultados obtidos. Para aumentar a taxa de transferência, esse protocolo pode ser adaptado para automação. Implementar sistemas de manuseio de líquidos para a preparação de placas de 96 poços reduziria erros de pipeteamento, melhorando assim a precisão e a reprodutibilidade.

O protocolo de avaliação de citotoxicidade utiliza duas linhas celulares distintas de mamíferos (Vero e HepG2) e dois ensaios complementares de viabilidade (MTT e NRU). Várias etapas dentro desse protocolo são críticas para garantir a reprodutibilidade e precisão dos dados, e cada laboratório deve realizar sua própria validação. Por exemplo, a densidade inicial de semeadura celular deve ser cuidadosamente otimizada, pois a sobreconfluência pode levar à inibição do contato e alteração dos estados metabólicos, confundindo os resultados, enquanto a sub-semeadura pode tornar as células mais suscetíveis a pequenos insultos, podendo superestimar a^{toxicidade 15}. Além disso, a maior concentração testada geralmente é limitada pela solubilidade do composto, e a precipitação pode levar a resultados imprecisos. Além disso, o layout sugerido de placas (Figura 3A) é projetado para triagem primária, maximizando o número de compostos testados ao abrir mão de réplicas técnicas e ignorar efeitos de borda em favor da validação por meio de réplicas biológicas independentes.

Uma das principais forças desse protocolo é a implementação paralela tanto dos ensaios MTT quanto da NRU. Embora ambos sejam bem estabelecidos, eles medem parâmetros celulares diferentes. O ensaio MTT quantifica a atividade metabólica das desidrogenases mitocondriais, que geralmente se correlaciona com a viabilidade celular¹⁶. No entanto, esse ensaio é suscetível a interferências de compostos com propriedades redutoras ou oxidantes ou daqueles que perturbam a respiração mitocondrial, levando a possíveis resultados^{falsos 15}. Executar o ensaio NRU em paralelo ajuda a diagnosticar esses artefatos. O ensaio NRU mede a capacidade das células viáveis de manter a integridade lisossômica e os gradientes de pH necessários para a absorção de^{corante 17}. Discrepâncias entre os resultados do MTT e da NRU podem revelar mecanismos específicos de toxicidade, como disfunção mitocondrial, o que justifica investigação adicional.

Em resumo, este protocolo descreve os passos fundamentais para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos. Compostos que demonstram seletividade e potência promissoras podem ser posteriormente avançados para modelos de infecção mais complexos, como estudos in vivo .

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LINHAS CELULARES
HepG2 (carcinoma hepatocelular humano)	ATCC	HB-8065	Linha celular de carcinoma hepático humano
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (rim de macaco verde africano)	ATCC	CCL-81	Linha celular de epitélio de rim de primata
QUÍMICOS – SÍNTESE
4-(Piperidin-1-il)anilina	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Precursor de amina para o composto 5/6
4-Bromoanilina	Sigma-Aldrich	108-67-8	Matéria-prima para a síntese de quinoleína
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	695092	Reagente na síntese e preparação da fase móvel
Acetonitril (grau HPLC)	Sigma-Aldrich	34967	Componente da fase móvel HPLC e solvente NMR
Cloreto de metileno	Sigma-Aldrich	C2432	Solvente para extração de produto
DMSO-d6 (deuterado)	Sigma-Aldrich	175641	Solvente NMR
Dowtherm A (fluido de transferência de calor)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Solvente de alto ponto de ebulição para ciclização térmica (230–250 °C); anteriormente listado como Dowtherm® A
Etanol (absoluto)	Sigma-Aldrich	459836	Solvente de reação para a etapa Conrad–Limpach
Acetato de etila (grau HPLC)	Sigma-Aldrich	270989	Componente eluente da coluna
Etil acetoacetato	Sigma-Aldrich	E12806	Reagente de β-cetoéster para a formação do anel quinoleína
Ácido fórmico (grau HPLC)	Sigma-Aldrich	F0507	Aditivo de 0,1% na fase móvel para HPLC e HRMS
Esferas de vidro (1 mm, estéreis)	Sigma-Aldrich	G8772	Para homogeneização da cultura de M. tuberculosis
HCl (ácido clorídrico, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Catalisador ácido na substituição nucleofílica
Hexano (grau HPLC)	Sigma-Aldrich	34859	Eluente não polar para cromatografia em coluna
Isopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Solvente de reação para a síntese do composto 6
Sulfato de magnésio (MgSO4, anidro)	Sigma-Aldrich	M7506	Agente de secagem e catalisador de reação
Metanol (grau HPLC)	Sigma-Aldrich	34860	Componente da fase móvel HPLC e solvente NMR
Oxicloreto de fósforo (V) (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Reagente de cloração para o intermediário 4
Piridina	Sigma-Aldrich	270970	Catalisador básico na substituição nucleofílica
Gel de sílica (35–70 mesh) para cromatografia flash	Macherey-Nagel	815349	Fase estacionária para etapas de cromatografia flash
Gel de sílica 60 Å (70–230 mesh) para cromatografia em coluna	Macherey-Nagel	815381	Fase estacionária para cromatografia em coluna
Sulfato de sódio (Na2SO4, anidro)	Sigma-Aldrich	239313	Agente de secagem para a fase orgânica
Placas de TLC de gel de sílica 60 F254	Merck	1.05554	Monitoramento de cromatografia em camada fina
Tolueno	Sigma-Aldrich	244511	Solvente para a etapa de cloração
Água ultrapura	Millipore / equivalente	N/A	Usado na preparação da fase móvel; anteriormente referenciado como água Milli-Q no texto
EQUIPAMENTO & INSTRUMENTOS
Filtro de seringa de 0,22 µm	Millipore / qualquer	SLGP033RS	Esterilização da solução de resazurina (2.1.4); filtração da solução de trabalho de MTT (3.3); filtração da solução de trabalho de Neutral Red (3.4)
Filtro de seringa de 0,45 µm	Millipore / qualquer	SLHA033SS	Filtração das soluções da fase móvel
Tubo cônico de 15 mL (estéril)	Falcon / qualquer	352097 ou equivalente	Coleta e centrifugação da suspensão celular após a tripsinização
Placa de 96 poços (fundo plano, tratada para cultura de tecido)	Corning / qualquer	3596	Para ensaios de citotoxicidade e MIC
Folha de alumínio	Qualquer	—	Proteção contra luz das placas durante a incubação e agitação de MTT e NRU
Autoclave	Qualquer	—	Esterilização da mídia (121 °C, 98,07 kPa, 10 min)
Cabinet de biossegurança (Classe II, certificado)	Qualquer (certificado BSL-3)	—	Requerido para manipulações de M. tuberculosis (BSL-3)
Contador de células (automatizado) ou hemocitómtero	ex., Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Para determinação da concentração e viabilidade celular
Centrífuga (capaz de 200 × g)	Qualquer	—	Passo de aglomeração celular
Incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, umidificado)	Qualquer	—	Incubação da cultura celular e do tratamento
Manto de aquecimento	Fisotom	12M	Manto de aquecimento com controle de temperatura com Dowtherm® A
Sistema HPLC (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Injetor automático de dupla bomba, UV detector; para análise de pureza do composto 6
Microscópio invertido (ou equivalente)	Qualquer	—	Inspeção visual das células no momento da adesão (3.2), durante o ponto de verificação do tratamento (3.3, 3.4) e para verificação do status do ensaio
Agitador magnético / placa quente	Qualquer	—	Preparação da solução e mistura da reação
Espectrômetro de