Drosophila melanogaster atua como um organismo modelo poderoso para pesquisas sobre envelhecimento. Este protocolo detalha os passos necessários para gerar uma medição reprodutível e baseada em população da longevidade e do período funcional de boa saúde.
Artigo de método
Integração Semi-Automatizada da Análise de Longevidade Funcional e Longevidade Total Utilizando o Pipeline FlyTrDT em Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O envelhecimento caracteriza-se por declínio funcional progressivo e redução da longevidade; esses dois parâmetros são frequentemente avaliados independentemente em estudos experimentais. Em Drosophila melanogaster, ensaios de longevidade e medidas locomotoras baseadas na geotaxia negativa são comumente utilizados para estudar o envelhecimento e a neurodegeneração. No entanto, há uma falta de estruturas padronizadas que integrem quantitativamente o desempenho motor inicial com a sobrevivência a longo prazo. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho reprodutível e semiautomatizado que combina análise de longevidade com a quantificação objetiva do período saudável de função motora em moscas envelhecidas.
O protocolo integra condições controladas de criação de moscas, contabilização de mortalidade e ensaios de geotaxia negativa baseados em vídeo, utilizando gravações MP4 padronizadas (resolução mínima de 1280 × 720, 30 quadros/s). O desempenho locomotor é quantificado usando um fluxo de trabalho personalizado baseado em Python, implementado no Python 3.12.1 com OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 e Matplotlib 3.5.2. O fluxo realiza detecção de centróide quadro a quadro e extrai a inclinação ativa de escalada (pixels/s) como uma métrica contínua da função motora. As trajetórias de sobrevivência são analisadas mediante o cálculo da fração de sobrevivência e realização de integração numérica trapezoidal para obter a área sob a curva (AUC) de sobrevivência. A normalização do desempenho motor inicial permite comparação direta entre declínio funcional e longevidade total.
O fluxo de trabalho foi avaliado comparando medições semi-automatizadas da inclinação de escalada com a pontuação manual convencional em moscas controle e em moscas que expressam o peptídeo amilóide-β, sendo que ambos os métodos detectaram declínio motor dependente da idade. Conjuntos de dados representativos demonstraram trajetórias reprodutíveis de longevidade em controles Canton S e prejuízo motor precoce mensurável no modelo de neurodegeneração. Este método minimiza o viés do observador, aumenta a reprodutibilidade e permanece compatível com sistemas de aquisição de vídeo de baixo custo. O fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado a modelos genéticos, intervenções farmacológicas e paradigmas de neurodegeneração, fornecendo uma plataforma escalável para fenotipagem integrada do envelhecimento em Drosophila.
Introdução
O envelhecimento caracteriza-se não apenas pela redução da longevidade, mas também pelo declínio progressivo da função fisiológica e comportamental1. Em condições neurodegenerativas, os primeiros prejuízos na coordenação motora frequentemente ocorrem antes da mortalidade significativa e refletem disfunção neuronal subjacente2,3. A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster surgiu como um sistema modelo poderoso para o estudo do envelhecimento e da neurodegeneração, devido à sua vida curta, manipulabilidade genética e ensaios comportamentais bem estabelecidos4. A análise da longevidade em Drosophila fornece uma medida robusta da sobrevivência do organismo, enquanto os ensaios de geotaxia negativa são amplamente utilizados para avaliar a função locomotora e o declínio motor dependente da idade5,6. No entanto, essas duas leituras são frequentemente analisadas de forma independente, limitando a capacidade de relacionar quantitativamente o prejuízo funcional inicial às trajetórias de sobrevivência a longo prazo. A análise integrada do período saudável de função motora (healthspan) e da longevidade pode fornecer insights mecanicistas sobre se intervenções influenciam a taxa de envelhecimento, a progressão da doença ou sistemas fisiológicos específicos. Essa abordagem é particularmente adequada para modelos genéticos, farmacológicos e neurodegenerativos nos quais déficits locomotores precoces precedem a mortalidade significativa, permitindo a detecção sensível do declínio funcional antes do surgimento de diferenças observáveis na sobrevivência.
Os ensaios tradicionais de geotaxia negativa baseiam-se em pontuações baseadas em pontos finais, como a proporção de moscas que atingem uma altura definida dentro de um intervalo de tempo fixo. Embora sejam simples e econômicos, a pontuação manual pode introduzir viés do observador e pode deixar de detectar diferenças sutis na cinética motora. Medições contínuas derivadas de trajetórias podem aumentar a sensibilidade para detectar déficits locomotores sutis em comparação com abordagens convencionais baseadas em pontuações de ponto final. Da mesma forma, ensaios de longevidade exigem contabilização rigorosa de mortalidade e padronização ambiental para garantir a reprodutibilidade7. Ainda existe a necessidade de abordagens acessíveis e reprodutíveis que integrem métricas funcionais de período de saúde com dados de sobrevivência dentro do mesmo grupo.
Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho semiautomatizado que combina a análise padronizada de longevidade com a quantificação baseada em vídeo do desempenho motor em Drosophila envelhecida. Utilizando ferramentas computacionais de código aberto, realiza-se a detecção quadro a quadro do centróide para extrair a inclinação da subida (pixels/s) como uma métrica contínua da função motora. Os dados de sobrevida são processados mediante o cálculo da fração de sobrevida e a realização de integração numérica trapezoidal para obter a área sob a curva de sobrevida (AUC). Ao normalizar o desempenho motor inicial e integrá-lo com a AUC de sobrevida, este protocolo permite comparação direta entre declínio funcional e longevidade geral. Esta abordagem fornece um arcabouço objetivo e econômico para associar o período saudável motor à longevidade e permite a fenotipagem abrangente das trajetórias de envelhecimento em Drosophila.Figura 1).
Protocolo
Todos os experimentos foram realizados utilizando Drosophila melanogaster e conduzidos de acordo com as normas do laboratório institucional diretrizes. A aprovação ética não foi necessária porque o estudo envolveu organismos invertebrados. Mantenha todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com animais para pesquisas com invertebrados.
OBSERVAÇÃO: Armazene os alimentos experimentais a 4 °C e utilize-os dentro de 1 semana, desde que permaneçam secos. Mantenha as condições ambientais padrão incubando as moscas a 25 °C em ciclo claro–escuro de 12:12 h e aproximadamente 60% de umidade relativa.
1. Preparação da dieta padrão para moscas
- Preparação básica de alimento
- Combine 6 g de amido de milho, 5 g de levedura, 4 g de D-glicose, 3 g de sacarose, 1 g de extrato de levedura, 1 g de ágar, e 0,25 g de extrato de malte em um recipiente contendo 100 mL de água destilada.
- Misture bem o conteúdo com uma espátula até formar uma suspensão homogênea.
- Aqueça a mistura a aproximadamente 85–100 °C em um fogão de indução por 12–15 min ao preparar volumes ≥500 mL, ou por 5–10 min ao preparar volumes entre 100–400 mL. Agite continuamente durante o aquecimento.
- Autoclave a mistura aquecida de acordo com os procedimentos padrão de esterilização em laboratório.
- Deixe o meio autoclavado esfriar. Monitore a temperatura com um termômetro até que atinja 50–55 °C.
- Adicione 600 µL de ácido propiônico e 100 mg de ácido benzóico em 1 mL de etanol a 100% ao meio resfriado e misture bem.
- ATENÇÃO: O ácido propiônico e o etanol devem ser manipulados em local bem ventilado e com o uso de luvas e proteção ocular, pois ambas as substâncias são voláteis e podem causar irritação se inaladas ou em contato com a pele.
- Coloque 5 mL de alimento em cada frasco estéril com 10 cm de comprimento e 20 mm de diâmetro.
- Deixe os frascos descobertos por pelo menos 5–6 h à temperatura ambiente. Cubra-os com papel toalha para evitar a entrada de moscas. Utilize este passo para minimizar a variabilidade nas medidas de longevidade decorrentes de diferenças no preparo e nas condições de armazenamento do meio.
- Preparação de alimento com fármaco
- Prepare um pequeno lote de alimento para adultos conforme descrito nas Etapas 1.1.1–1.1.5.
- Deixe o alimento esfriar até 50–55 °C.
- Prepare uma solução estoque do composto em teste na concentração desejada utilizando um veículo apropriado, como água destilada ou dimetilsulfóxido (DMSO). Dissolva o composto em teste no veículo escolhido para gerar uma solução estoque concentrada e adicione essa solução ao alimento resfriado (50–55 °C) para atingir a concentração final desejada, mantendo concentrações idênticas de veículo entre os grupos tratados e controle.
- Misture bem para garantir distribuição uniforme.
- Coloque 2 mL do alimento contendo o fármaco em cada frasco experimental, sobrepondo-o à superfície do alimento-base já solidificado.
- Prepare frascos controle adicionando um volume equivalente do veículo isoladamente (por exemplo, água destilada ou DMSO na mesma concentração final usada nos grupos tratados) ao alimento sobreposto ao alimento-base.
- Deixe o alimento em camadas solidificar completamente à temperatura ambiente antes de introduzir as moscas.
NOTA: Manipulação e armazenamento do alimento: Se o alimento for preparado à noite, deixe os frascos cobertos com papel toalha durante a noite à temperatura ambiente e insira tampões de algodão na manhã seguinte. Lave, descontamine e autoclave sempre os frascos antes do uso. Autoclave rolos de algodão separadamente antes de tampar os frascos. Insira os tampões de algodão somente após o alimento ter solidificado completamente por pelo menos 5–6 h.
2. Geração de D. melanogaster expressando amiloide-β
- Coleta e validação de fêmeas virgens do driver
- Mantenha a linhagem de moscas driver a 25 °C sob um ciclo claro–escuro de 12 h:12 h antes da coleta de virgens.
- Colete fêmeas recém-emergidas da linhagem driver duas vezes ao dia, uma pela manhã e outra no final da tarde, utilizando anestesia breve com dióxido de carbono.
- Transfira imediatamente as fêmeas coletadas para tubos novos de sexo único após a coleta para evitar acasalamento.
- Incube os tubos a 25 °C por mais 48 h para validação da condição de virgindade.
- Examine os tubos diariamente quanto à presença de larvas.
- Confirme o status de virgindade verificando a ausência de ovos ou prole larval.
- Utilize apenas fêmeas que não apresentem evidência de produção de larvas em cruzamentos genéticos.
- Montagem do cruzamento genético
- Colete machos adultos recém-emergidos UAS-APPE693G utilizando anestesia breve com dióxido de carbono no dia da montagem do cruzamento.
- Monte os cruzamentos colocando 20 fêmeas virgens elav-GAL4 com 10 machos UAS-APPE693G em um tubo com meio fresco.
- Incube os tubos de cruzamento a 25 °C sob umidade controlada e ciclo claro–escuro de 12 h:12 h.
- Permita que as moscas acasalem e depositem ovos por 48 h.
- Transfira os adultos para tubos frescos se prole adicional for necessária.
- Remova as moscas parentais após a postura para evitar superlotação e gerações sobrepostas.
- Permita que a prole se desenvolva até a fase adulta em condições padrão até a emergência.
- Utilize moscas adultas F1 que expressam a proteína β-amilóide em neurônios para experimentos subsequentes de longevidade e saúde.
NOTA: O driver elav-GAL4 permite a expressão pan-neuronal da proteína precursora da amilóide humana que carrega a mutação ártica E693G. A expressão ocorre durante todo o desenvolvimento e vida adulta em condições padrão de criação. Para experimentos de envelhecimento, utilize fundos genéticos consistentes e controles apropriados. Mantenha condições de temperatura constantes dentro de cada
experimento. Temperaturas de incubação mais baixas, como 18 °C, podem ser utilizadas durante o desenvolvimento para
retardar a patologia associada ao transgene antes da fase adulta.
3. Coleta de moscas
- Coleta de moscas para o ensaio de geotaxia negativa
- Mantenha todas as linhagens de moscas em alimento padrão para moscas a 25 °C, aproximadamente 60% de umidade relativa e ciclo claro–escuro de 12 h:12 h antes da montagem experimental.
- Colete moscas machos adultas recém-emergidas dentro de uma janela de 2–3 dias utilizando anestesia breve com dióxido de carbono.
- Transfira as moscas machos para frascos de alimento contendo o fármaco ou para frascos de alimento controle, conforme a condição experimental.
- Substitua o alimento a cada 3 dias ou antes, se a qualidade do alimento se deteriorar.
- Mantenha as moscas nessas condições até as idades designadas para avaliação de geotaxia negativa.
NOTA: Apenas moscas machos são utilizadas no ensaio de geotaxia negativa para evitar variabilidade decorrente de diferenças específicas ao sexo no desempenho locomotor e no envelhecimento.
- Coleta de moscas para o ensaio de longevidade
- Anestesie brevemente pequenos grupos de moscas em um suporte para anestesia.
- Identifique moscas machos utilizando um pincel macio.
- Minimize a exposição ao dióxido de carbono durante a separação para evitar efeitos fisiológicos duradouros que possam interferir nas medidas de longevidade.
- Coloque 10 moscas machos e 10 moscas fêmeas, em uma proporção sexual de 1:1, em cada frasco de alimento fresco, conforme o delineamento experimental.
- Conclua a separação e a distribuição em porções dentro de 3–4 min por lote.
- Garanta que a exposição total à anestesia não exceda 9–10 min.
- ATENÇÃO: A anestesia com dióxido de carbono deve ser aplicada utilizando reguladores apropriados e ventilação laboratorial adequada para minimizar a exposição do operador e prevenir estresse fisiológico prolongado induzido pela anestesia nas moscas.
- Repita as Etapas 3.2.1–3.2.6 até que 4–6 frascos replicados sejam estabelecidos para cada condição experimental.
4. Experimento de longevidade
- Transferência e manutenção das moscas
- Mantenha as moscas em condições padrão.
- Transfira as moscas para tubos com alimento fresco em intervalos regulares para evitar superlotação, contaminação por larvas e degradação do alimento.
- Transfira as moscas para alimento fresco a cada 3 dias.
- Utilize essa frequência de transferência para minimizar a perturbação das condições de alimentação, prevenindo o crescimento larval no tubo.
- Realize todas as transferências sem anestesia.
OBSERVAÇÃO: Evite a anestesia durante experimentos de longevidade, pois ela pode induzir mortalidade aguda, especialmente em moscas idosas.
- Avaliação da mortalidade durante as transferências
- Registre a idade do grupo em dias a cada transferência.
- Examine cuidadosamente o tubo antigo.
- Conte e registre o número de moscas mortas remanescentes no tubo antigo.
- Conte e registre o número de moscas mortas transferidas para o novo tubo.
- Registre esses valores separadamente para evitar contagem dupla.
- Calcule o número total de mortes em cada transferência usando a seguinte equação:
Mortes totais = moscas mortas no tubo antigo + moscas mortas transferidas para o novo tubo. - Determine o número de novas mortes desde a transferência anterior subtraindo o número de moscas registradas como “transferidas” na transferência anterior do total de mortes na transferência atual.
- Utilize esse cálculo para garantir que moscas transferidas entre tubos não sejam contadas múltiplas vezes.
- Identificação de moscas vivas, mas inativas
- Bata suavemente na lateral do tubo antes de considerar uma mosca como morta, quando moscas idosas parecerem imóveis ou estiverem deitadas de costas.
- Observe se algum movimento ocorre.
- Considere como vivas as moscas que apresentarem movimento após estimulação.
- Não registre como mortas as moscas que apresentarem movimento após estimulação.
- Bata suavemente no tubo para desalojar quaisquer moscas vivas aderidas à superfície do alimento no tubo antigo.
- Transfira as moscas vivas desalojadas para o novo tubo.
- Não considere como mortas as moscas vivas desalojadas.
OBSERVAÇÃO: A discriminação precisa entre moscas mortas e inativas é crítica nas fases finais da vida. A estimulação mecânica suave deve sempre ser utilizada antes de atribuir o status de morte.
- Critérios de censura
- Considere uma mosca como censurada à direita se ela sair do experimento antes da morte natural devido à fuga do tubo, lesão acidental ou problemas de manipulação.
- Registre as moscas censuradas em uma coluna separada no dia em que a mosca sair do experimento.
- Não registre moscas censuradas como mortas.
- Exclua moscas censuradas das contagens de mortalidade na análise de sobrevida.
- Utilize a censura com cautela, pois censura excessiva pode introduzir viés experimental.
OBSERVAÇÃO: Separar moscas “mortas” das “transferidas” durante a entrada de dados evita a superestimação das contagens de mortalidade e assegura a correta reconstrução da curva de sobrevida.
- Continuação do ensaio
- Repita as Etapas 4.1–4.4 ao longo do experimento.
- Continue o ensaio até que a última mosca sobrevivente morra.
5. Experimento de geotaxia negativa
- Preparação das moscas
- Coletar moscas de frascos experimentais sem anestesia com CO₂.
- Transferir as moscas cuidadosamente para um tubo de escalada, ou tubo de geotaxia negativa, usando um funil pequeno para evitar escapes.
- Permitir que as moscas se aclimatizem na câmara de teste por 5 min antes de iniciar o ensaio.
- Realizar todos os ensaios de escalada no mesmo horário do dia, por exemplo à tarde, para minimizar a variabilidade circadiana.
NOTA: Evitar luz solar direta durante o teste, pois a intensidade luminosa pode alterar o comportamento locomotor.
- Configuração do tubo de escalada
- Utilizar um tubo de escalada cilíndrico transparente com 12 cm de altura e 2 cm de diâmetro.
- Marcar uma linha horizontal a 10 cm da base do tubo.
- Posicionar o tubo verticalmente contra um fundo branco uniforme para facilitar o rastreamento por vídeo.
- Montar um smartphone ou câmera digital em um suporte estável.
- Garantir que todo o tubo esteja dentro do quadro.
- Procedimento do ensaio
- Bater firmemente três vezes no tubo sobre uma almofada de espuma ou mouse pad colocada sobre uma superfície sólida, de modo que todas as moscas caiam simultaneamente para o fundo.
- Iniciar imediatamente a gravação de vídeo por 10–12 s a aproximadamente 30 quadros/s.
- Permitir que as moscas subam livremente por 10 s.
- Registrar pelo menos três ensaios independentes por frasco.
- Deixar um intervalo de descanso de 10 min entre os ensaios.
- Realizar o ensaio para cada condição experimental, como grupos controle, tratados com fármaco e controle de solvente.
- Contar o número de moscas que alcançam ou ultrapassam a marca de 10 cm dentro de 10 s.
- Registrar E como o número de moscas que alcançam 10 cm.
- Registrar T como o número total de moscas vivas testadas.
- Calcular a atividade de escalada percentual como (E/T) × 100.
- Média dos valores obtidos em três ensaios.
- Apresentar os valores como média ± DP.
- Análise de escalada semi-automatizada usando um script em Python
- Aquisição de vídeo
- Gravar ensaios de geotaxia negativa usando uma câmera de smartphone posicionada perpendicularmente a um tubo de escalada transparente com 12 cm de altura e 2 cm de diâmetro. Gravar vídeos usando um smartphone ou câmera digital a aproximadamente 30 quadros/s e resolução mínima de 1280 × 720 pixels. Posicionar a câmera a uma distância fixa de aproximadamente 15–20 cm do tubo de escalada e manter a mesma geometria de aquisição em todas as gravações. Utilizar a altura conhecida do tubo (12 cm) como referência interna de calibração espacial para medições baseadas em pixels.
- Colocar o tubo contra um fundo branco uniforme.
- Gravar vídeos por 10–12 s.
- Manter as condições de iluminação constantes em todas as gravações.
- Manter a distância da câmera constante em todas as gravações.
- Manter o posicionamento do tubo constante em todas as gravações.
- Minimizar a variabilidade na detecção do centróide.
- Salvar os vídeos gravados no formato .mp4.
- Transferir os vídeos gravados para um computador desktop para análise.
- Processamento de vídeo baseado em Python
- Analisar os vídeos usando um script personalizado em Python fornecido como Arquivo Suplementar 1. Realizar todas as análises usando Python 3.12.1 com OpenCV (cv2) versão 4.9.0, NumPy versão 1.26.4, Pandas versão 2.2.0, Matplotlib versão 3.5.2 e Scikit-learn versão 1.4.2.
- Especificar o caminho do vídeo de entrada e o diretório de saída dentro do Arquivo Suplementar 1 antes de executar o script a partir de um ambiente Python ou interface de linha de comando.
- Executar o script usando python climbing_analysis.py após editar as variáveis VIDEO_PATH e OUTPUT_CSV.
- Utilizar OpenCV, ou cv2, para processamento de quadros e detecção de objetos.
- Utilizar NumPy para cálculos numéricos.
- Utilizar Pandas para exportação de dados.
- Utilizar Matplotlib para visualização.
- Processar cada vídeo quadro a quadro.
- Ler o vídeo usando a função VideoCapture do OpenCV.
- Processar quadros individuais sequencialmente.
- Converter quadros para escala de cinza.
- Aplicar desfoque gaussiano para reduzir ruídos de fundo.
- Aplicar limiarização de Otsu em modo binário inverso para segmentar as moscas do fundo.
- Realizar operações morfológicas de abertura e fechamento para remover pequenos artefatos e preencher lacunas nos contornos.
- Identificar contornos que excedam um limiar mínimo de área de contorno de 60 pixels2 para excluir artefatos de fundo e partículas pequenas de ruído.
- Calcular momentos espaciais para cada contorno válido.
- Determinar as coordenadas do centróide, x e y, para cada contorno válido.
- Média das coordenadas do centróide quando múltiplas moscas são detectadas em um quadro.
- Obter uma única posição média da coorte por quadro.
- Analisar os vídeos usando um script personalizado em Python fornecido como Arquivo Suplementar 1. Realizar todas as análises usando Python 3.12.1 com OpenCV (cv2) versão 4.9.0, NumPy versão 1.26.4, Pandas versão 2.2.0, Matplotlib versão 3.5.2 e Scikit-learn versão 1.4.2.
- Avaliação de controle de qualidade
- Verificar a segmentação bem-sucedida das moscas confirmando que os contornos detectados correspondem às moscas visíveis ao longo da gravação.
- Garantir contraste adequado entre as moscas e o fundo utilizando um fundo branco uniforme e condições de iluminação estáveis.
- Excluir vídeos que contenham reflexos excessivos, sombras, movimento do tubo, sobreposição grave de moscas ou visibilidade incompleta do tubo.
- Considerar vídeos inadequados para análise quando o rastreamento do centróide falhar em partes significativas da gravação ou quando a limiarização produzir artefatos persistentes de fundo.
- Extração de métricas de escalada
- Calcular manualmente a pontuação de escalada conforme descrito no Passo 5.3.7.
- Calcular a altura de escalada em pixels como a diferença entre as posições verticais iniciais e finais do centróide.
- Calcular a velocidade média em pixels/s como o comprimento total da trajetória dividido pela duração da gravação.
- Calcular a velocidade máxima em pixels/s como o deslocamento máximo instantâneo entre quadros consecutivos.
- Calcular o comprimento da trajetória em pixels como a distância acumulada percorrida entre quadros.
- Calcular a área da trajetória em pixels2 como a área do envoltório convexo que encerra todas as posições do centróide.
- Calcular o número de mudanças de direção horizontal.
- Calcular o número de paradas como o número de quadros em que o deslocamento do centróide permanece abaixo de um limiar de distância de parada de 3 pixels entre quadros consecutivos.
- Plotar a posição vertical em função do tempo para obter uma medida objetiva do desempenho ativo de escalada.
- Calcular a inclinação da escalada em pixels por segundo usando uma janela de regressão linear móvel de 1 segundo durante a fase ativa de escalada da gravação.
- Utilizar o valor da inclinação como a métrica primária de desempenho motor para integração com análise de sobrevivência.
- Exportar métricas quantificadas de locomoção, incluindo altura de escalada, velocidade média, velocidade máxima, comprimento da trajetória, área da trajetória, número de mudanças de direção, número de paradas e inclinação da escalada, em arquivos .csv. Salvar os gráficos de visualização da inclinação em arquivos de imagem .png para verificação de qualidade e análise posterior.
- Aquisição de vídeo
6. Integração da saúde motora inicial e análise de sobrevida
- Exporte os dados de sobrevivência como um arquivo .csv contendo colunas para grupo, dia e número de moscas vivas.
- Calcule a fração de sobrevivência para cada grupo em cada ponto temporal dividindo o número de moscas vivas pelo tamanho inicial do grupo.
- Calcule a área sob a curva de sobrevivência, ou AUC, utilizando integração numérica trapezoidal da fração de sobrevivência em função do tempo.
- Exporte os dados de desempenho motor como um arquivo .csv contendo a inclinação da subida no Dia 7 para cada grupo.
- Normalize o desempenho motor do Dia 7 em relação ao grupo controle, Canton S, dividindo o valor da inclinação do Dia 7 de cada grupo pela inclinação correspondente do controle.
- Combine os valores normalizados do desempenho motor do Dia 7 com os valores correspondentes de AUC de sobrevivência para cada genótipo.
- Realize uma comparação descritiva do desempenho motor normalizado no Dia 7 e da AUC de sobrevivência para avaliar a relação entre a queda precoce do desempenho motor e os desfechos de sobrevivência.
- Gere uma visualização gráfica dos valores normalizados de desempenho motor no Dia 7 e da AUC de sobrevivência (Arquivo Suplementar 2).
NOTA: Realize todas as análises de integração entre sobrevivência e desempenho motor utilizando o script personalizado em Python fornecido como Arquivo Suplementar 2. Utilize Pandas para manipulação e fusão dos conjuntos de dados, NumPy para integração numérica trapezoidal e Matplotlib para visualização gráfica.
7. Análise estatística
- Apresente as medidas de locomoção e sobrevivência como conjuntos de dados representativos obtidos de frascos com réplicas biológicas.
- Relate as medidas de locomoção como valores médios calculados a partir de ensaios independentes de escalada.
- Utilize a visualização gráfica da inclinação da escalada (pixels/s) e dos valores de AUC de sobrevivência para demonstrar as relações representativas entre desempenho motor e resultados de sobrevivência.
Resultados
Perfis reprodutíveis de longevidade sob condições padronizadas de criação
Quando as moscas foram mantidas sob condições ambientais controladas (25 °C, 60% de umidade, ciclo claro–escuro de 12 h:12 h) utilizando alimento padronizado recém-preparado, os grupos controle exibiram trajetórias de sobrevivência consistentes em experimentos independentes. As moscas controle Canton S demonstraram uma longevidade mediana de aproximadamente 65–72 dias, com sobrevivência máxima prolongando-se até 75 dias (Figura 2). Os experimentos de longevidade foram realizados com 2 réplicas biológicas por condição, cada uma contendo 20 moscas. As trajetórias representativas de sobrevivência obtidas sob condições padronizadas de ambiente e alimento demonstraram perfis reprodutíveis de longevidade nos grupos controle.
Em contraste, moscas que expressavam amilóide-β em todos os neurônios exibiram sobrevida reduzida em relação aos controles Canton S, consistente com fenótipos neurodegenerativos previamente relatados em modelos de doença de Alzheimer em Drosophila4,5,6.
Resultados subótimos de longevidade podem ocorrer quando a qualidade da comida se deteriora ou quando as condições de manuseio são inconsistentes. Nessas condições, foram detectados picos precoces de mortalidade nos primeiros 7–10 dias e maior variabilidade entre frascos (>25%), indicando reprodutibilidade experimental comprometida e menor consistência entre réplicas biológicas.
Declínio Motor Dependente da Idade Detectado por Análise Semi-automatizada de Subida
A pontuação convencional manual da geotaxia negativa detectou declínio locomotor dependente da idade em moscas que expressam amiloide-β em comparação com os controles Canton SFigura 3). No dia 7, o desempenho na escalada permaneceu amplamente comparável entre os grupos, enquanto que no dia 28, as moscas que expressavam β-amiloide exibiram atividade de escalada reduzida em relação às moscas controle. Os grupos controle mantiveram um desempenho relativamente estável na escalada ao longo dos pontos temporais de envelhecimento. Essas tendências comportamentais pontuadas manualmente corresponderam às reduções nos valores de inclinação de escalada obtidos pelo fluxo de trabalho semi-automatizado FlyTrDT, mostrando tendências dependentes da idade semelhantes às observadas na pontuação convencional do ponto final e no fluxo de trabalho de rastreamento computacional (Figura 4). A diminuição da locomoção observada em moscas que expressam amiloide-β é consistente com o prejuízo comportamental dependente da idade já estabelecido em modelos de neurodegeneração em Drosophila, utilizando ensaios convencionais de geotaxia negativa6,7.
A análise semi-automatizada da subida utilizando o FlyTrDT revelou preservação da função motora inicial em moscas controle. No Dia 7, as moscas controle exibiram uma inclinação média de subida de 86,64 pixels/s, refletindo um deslocamento ascendente sustentado durante a fase ativa de subida (Figura 4). No Dia 28, a inclinação aproximou-se de zero (−1,50 pixels/s), compatível com a diminuição associada à idade.
Em contraste, moscas que expressavam amiloide-β exibiram prejuízo motor precoce. No Dia 7, a inclinação da escalada foi reduzida a 34,25 pixels/s, representando aproximadamente 39% do desempenho do controle após a normalização. Até o Dia 28, a inclinação da escalada diminuiu substancialmente para −72,25 pixels/s, indicando comprometimento no desempenho locomotor ascendente.
A métrica baseada na inclinação capta o segmento ativo de escalada e reduz as contribuições da latência inicial ao susto, fases de platô e artefatos de movimento estocástico. Inclinações positivas indicam locomoção ascendente líquida, inclinações próximas de zero indicam deslocamento vertical limitado e inclinações negativas indicam deslocamento descendente líquido. Essas trajetórias representativas ilustram a deterioração motora progressiva em moscas que expressam amiloide-β em comparação com controles de mesma idade.
Em condições ideais de gravação, o pipeline FlyTrDT gerou trajetórias contínuas de centróides com segmentação de contorno estável e perfis consistentes de deslocamento vertical (Figura 4A). O desempenho locomotor reduzido em moscas que expressavam amiloide-β foi refletido por trajetórias ascendentes menos sustentadas e valores de inclinação mais baixos (Figura 4B–D). Vídeos gravados com excesso de reflexo, posicionamento instável do tubo, iluminação inconsistente ou contraste de fundo inadequado produziram trajetórias de centróide descontínuas e artefatos intermitentes de rastreamento e foram excluídos durante a avaliação de controle de qualidade.
Associação entre desempenho motor precoce e desfechos de sobrevida
Para examinar as associações entre desempenho motor precoce e desfechos de sobrevida, os valores normalizados da inclinação de subida no Dia 7 foram comparados com a AUC de sobrevida (área sob a curva) entre genótipos (Figura 5). Moscas-controle com desempenho motor precoce preservado (índice motor normalizado = 1,0) exibiram valores mais altos de AUC de sobrevida (48,2), enquanto moscas que expressavam amiloide-β com desempenho motor precoce reduzido (índice motor normalizado = 0,395) apresentaram valores mais baixos de AUC de sobrevida (24,65). Conjuntos de dados locomotores representativos foram gerados a partir de 2 frascos por condição, com réplicas biológicas. Esses conjuntos de dados representativos sugerem uma associação entre redução do desempenho motor precoce e sobrevida reduzida no modelo de doença por amiloide-β. Como apenas dois genótipos representativos foram analisados, esses achados são apresentados de forma descritiva, e não como uma correlação preditiva com poder estatístico.
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do pipeline FlyTrDT semi-automatizado, integrando métricas de longevidade funcional com análise de sobrevivência. O fluxo de trabalho inclui criação padronizada de moscas e análise de longevidade, avaliação manual e semi-automatizada da resposta de geotaxia negativa, extração quadro a quadro do centróide a partir de vídeos de escalada, cálculo da inclinação da escalada (pixels/s), análise da área sob a curva (AUC) de sobrevivência e integração do desempenho motor com os resultados de sobrevivência. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de sobrevida de Kaplan-Meier de moscas controle Canton S e moscas que expressam a proteína amiloide-β. As curvas de sobrevida ilustram as trajetórias de longevidade sob condições ambientais e dietéticas padronizadas. As moscas controle Canton S exibiram sobrevida prolongada em relação às moscas que expressam a amiloide-β em neurônios pan-neurais, as quais demonstraram redução da longevidade ao longo dos pontos temporais de envelhecimento. Os dados representam trajetórias de sobrevida representativas obtidas a partir de 2 frascos por condição, em réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Desempenho manual na geotaxia negativa em moscas controle e expressando amiloide-β nos dias 7 e 28. Os gráficos em caixa mostram medições representativas da atividade de escalada expressas como a porcentagem de moscas que ultrapassaram o limite de 10 cm em 10 s. As moscas controle da linhagem Canton S (CS) mantiveram uma atividade de escalada relativamente estável ao longo dos pontos temporais de envelhecimento, enquanto as moscas que expressavam amiloide-β exibiram desempenho reduzido na escalada no dia 28. Cada ponto representa uma medição individual de frasco. Conjuntos de dados representativos foram gerados a partir de 2 frascos replicados biologicamente por condição. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Extração semi-automatizada de trajetórias de escalada e inclinação ativa de escalada em moscas controle e que expressam amiloide-β. Foram extraídas trajetórias médias representativas da posição vertical a partir de vídeos de geotaxia negativa utilizando o pipeline de rastreamento FlyTrDT. Os traços azuis representam a posição média do centróide vertical quadro a quadro das moscas detectadas ao longo do tempo, e os segmentos vermelhos indicam um segmento representativo de escalada ativa identificado por meio de uma janela de regressão linear móvel. Os valores de inclinação são expressos em pixels/s. (A) Moscas controle Canton S no dia 7. (B) Moscas que expressam amiloide-β no dia 7. (C) Moscas controle Canton S no dia 28. (D) Moscas que expressam amiloide-β no dia 28. As trajetórias representativas foram geradas a partir de 2 frascos por condição, com réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Associação entre desempenho motor precoce e desfechos de sobrevivência em um modelo de Drosophila de toxicidade por amiloide-β. Valores normalizados da inclinação de escalada no Dia 7 foram plotados contra a área sob a curva (AUC) de sobrevivência para moscas controle Canton S (CS) e moscas que expressam amiloide-β (AD) (n = 2). As moscas controle exibiram maior desempenho motor precoce e valores aumentados de AUC de sobrevivência em comparação com as moscas que expressam amiloide-β. Esses conjuntos de dados representativos ilustram uma associação entre o desempenho locomotor precoce e os desfechos de sobrevivência. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Script em Python FlyTrDT para análise de escalada, utilizado para quantificação semi-automatizada da locomoção em vídeos de geotaxia negativa. O script realiza processamento de imagem quadro a quadro, detecção de centróides, extração de trajetórias e cálculo de métricas de escalada, incluindo inclinação de escalada, velocidade, comprimento da trajetória, área da trajetória, contagem de paradas e contagem de mudanças de direção.Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Script Python para integração dos dados de longevidade funcional do sistema motor e longevidade. O script realiza o cálculo da fração de sobrevida, análise da área sob a curva (AUC) pelo método trapezoidal, normalização dos valores da inclinação de subida no Dia 7, fusão dos conjuntos de dados e visualização gráfica dos desempenhos motores e resultados de sobrevida.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Aqui apresentamos um protocolo que integra a análise de longevidade com a quantificação semi-automatizada do período saudável de locomoção em Drosophila melanogaster. A integração confiável entre medidas de longevidade e de locomoção depende fortemente da consistência ambiental, da qualidade da dieta e de procedimentos padronizados de manipulação entre as réplicas biológicas.7. A variabilidade na secagem dos alimentos, transferências atrasadas ou contabilização inconsistente de mortalidade pode introduzir picos precoces de mortalidade e maior variação entre frascos, afetando assim a reconstrução das curvas de sobrevivência e a interpretação subsequente dos fenótipos de envelhecimento.
Durante o ensaio de geotaxia negativa, são necessárias condições de iluminação constantes, posicionamento adequado da câmera e alinhamento do tubo para garantir a detecção confiável do centróide durante o processamento de vídeo. A exposição excessiva a CO₂ durante a seleção deve ser minimizada, pois a anestesia pode afetar tanto a longevidade quanto o desempenho locomotor. Ao realizar medições comportamentais repetidas no mesmo grupo, os ensaios devem ser conduzidos no mesmo horário do dia para reduzir a variabilidade circadiana. Um contraste de fundo inadequado ou iluminação inconsistente pode prejudicar a limiarização e a detecção de contornos durante a análise automatizada. Se ocorrer fragmentação do contorno ou trajetórias de centróide instáveis durante o processamento de vídeo, melhore o contraste de fundo, reduza reflexos, estabilize o posicionamento da câmera e mantenha uma iluminação uniforme em todos os registros. Artefatos persistentes de limiarização podem ser minimizados ajustando o ângulo de gravação, reduzindo sombras ou garantindo que todo o tubo de escalada permaneça continuamente visível dentro do quadro. O agrupamento excessivo de moscas dentro do tubo pode comprometer a estimativa precisa do centróide e deve ser minimizado mantendo tamanhos de grupo consistentes entre os experimentos.
Ensaios tradicionais de geotaxia negativa geralmente quantificam a proporção de moscas que atingem uma altura predeterminada dentro de um intervalo de tempo fixo e são amplamente utilizados para avaliar a deterioração locomotora durante o envelhecimento e a neurodegeneração5,6. Em contraste, o presente fluxo de trabalho semi-automatizado extrai uma fase ativa de subida e calcula a inclinação ativa de escalada (pixels/s) a partir das trajetórias centróides quadro a quadro. Como as posições dos centróides são médias de todas as moscas detectadas em cada quadro, as trajetórias locomotoras individuais e a heterogeneidade comportamental entre moscas não são resolvidas. Essa abordagem reduz as contribuições da latência ao susto, pausas transitórias e comportamentos de agrupamento que influenciam a pontuação manual baseada em pontos finais. Diferentemente da pontuação convencional baseada em pontos finais, o presente fluxo de trabalho também fornece medidas contínuas de inclinação ascendente (pixels/s), que permitem comparação quantitativa da deterioração motora entre idade e genótipo. Abordagens computacionais de rastreamento semelhantes têm sido aplicadas com crescente frequência para melhorar a objetividade e a consistência na análise comportamental de Drosophila utilizando plataformas automatizadas de quantificação locomotora8,9,10,11,12.
Várias limitações adicionais devem ser consideradas. As medições baseadas em pixels da inclinação de escalada (pixels/s) dependem de uma calibração de câmera e geometria de gravação consistentes entre os experimentos. Diferenças na distância ou resolução da câmera podem afetar os valores absolutos da inclinação, exigindo normalização em relação a controles internos. Além disso, embora a diminuição motora precoce tenha sido qualitativamente associada à redução da sobrevida no modelo de amiloide-β apresentado aqui, uma validação mais ampla em diferentes genótipos, intervenções ou tratamentos farmacológicos fortaleceria a interpretação da relação entre desempenho motor e desfechos de sobrevida. Os conjuntos de dados representativos apresentados aqui têm a finalidade de demonstrar a implementação e interpretação do fluxo de trabalho, e não de estabelecer um modelo preditivo generalizado em diferentes contextos de doença.
Apesar dessas limitações, este protocolo fornece uma estrutura reprodutível e econômica para vincular métricas funcionais de longevidade saudável a desfechos de sobrevida em estudos de envelhecimento. O método adapta-se facilmente a manipulações genéticas, modelos de triagem de fármacos e modelos de neurodegeneração nos quais a declínio funcional precede a mortalidade. Ao integrar a quantificação objetiva da inclinação de subida (pixels/s) com análise padronizada de sobrevida, esta abordagem facilita a fenotipagem abrangente de trajetórias de envelhecimento em Drosophila. Estudos futuros que incorporem genótipos neurodegenerativos adicionais, intervenções farmacológicas e conjuntos de dados comportamentais longitudinais poderão reforçar ainda mais a utilidade do fluxo de trabalho para análise integrada de longevidade saudável13,14.
Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado com recursos da Escola de Biotecnologia Amrita, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar | Himedia | GRM666 | Agente solidificante |
| Ácido benzóico | Himedia | GRM488 | Conservante antimicrobiano |
| Canton-S | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC #1 | Estirpe de referência selvagem |
| Tubo de escalada | Construído sob medida | N/A | Tubo cilíndrico transparente, altura de 12 cm × diâmetro de 2 cm, em plástico transparente ou vidro |
| Farelo de milho | Fornecedor local | N/A | Preparação da dieta para moscas |
| Computador desktop/portátil | Qualquer fabricante | Definido pelo usuário | Processador mínimo dual-core, ≥8 GB de RAM, sistema operacional compatível com Python 3.x |
| D-glicose | Himedia | MB037 | Componente da dieta para moscas |
| elav-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC #458 | Condução pan-neuronal com GAL4 |
| Matplotlib | Biblioteca de código aberto | Versão 3.5.2 | Plotagem e visualização |
| NumPy | Biblioteca de código aberto | Versão 1.26.4 | Cálculos numéricos |
| OpenCV | Biblioteca de código aberto | Versão 4.9.0 | Processamento de vídeo |
| Pandas | Biblioteca de código aberto | Versão 2.2.0 | Manipulação de dados |
| Ácido propiônico | Himedia | GRM3658 | Conservante antifúngico |
| Python | Python Software Foundation | Versão 3.12.1 | Ambiente de análise |
| Scikit-learn | Biblioteca de código aberto | Versão 1.4.2 | Análise de regressão linear |
| Câmera de smartphone / câmera digital | Qualquer fabricante | Definido pelo usuário | Gravação mínima de 30 quadros/s, foco estável, posicionamento perpendicular, resolução mínima de 1280 × 720 |
| Sacarose | Himedia | GRM601 | Componente da dieta para moscas |
| UAS-APP.Aβ.E693G | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC #33774 | Modelo da mutação humana APP Ártica |
| Levedura | Himedia | RM027 | Suplemento nutricional |
Referências
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Reimpressões e permissões
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