Avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura e perfil antioxidante do extrato fresco de gel de aloe vera

Resumo

Este protocolo descreve a preparação asséptica do extrato fresco de gel interno de Aloe vera , medição potenciométrica do pH, avaliação da capacidade antioxidante total por meio de um ensaio colorimétrico automatizado baseado em ABTS, avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura sob condições definidas de incubação e triagem preliminar antimicrobiana de uma Aloe vera 70:30 (v/v).Mistura de teste de N-acetil-L-cisteína por difusão de disco e diluição qualitativa em tubo duplo.

Resumo

A aloe vera (Aloe barbadensis Miller) é amplamente utilizada em produtos de medicina tópica e complementar. No entanto, fluxos de trabalho laboratoriais padronizados para avaliação simultânea da capacidade antioxidante total (TAC), comportamento do pH, status de crescimento não detectável baseado em cultura sob condições definidas e triagem antimicrobiana preliminar permanecem limitados. Extrato fresco de gel interno de Aloe vera foi preparado assépticamente e formulado com 5%, 10%, 15% e 20% (p/v). O pH foi medido potenciometricamente, e o TAC foi determinado por um ensaio colorimétrico automatizado baseado em radicais catiônicos ABTS. A avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura foi realizada inoculando o extrato em ágar sanguíneo, ágar azul de metilena eosina e ágar dextrose Sabouraud, seguida de incubação aeróbica e inspeção visual às 24 horas, 48 e 72 horas. A triagem antimicrobiana de uma mistura de teste 70:30 (v/v) de Aloe vera/N-acetil-L-cisteína foi realizada contra cepas de referência padrão por difusão de disco e ensaios qualitativos de diluição em tubo duplo. A TAC diferiu significativamente entre os grupos (Kruskal-Wallis, p = 0,014), com os maiores valores observados na formulação de 20%. Nenhum crescimento visível de bactérias ou fungos foi observado nas condições de cultura testadas durante o período de observação de 72 horas. A mistura de teste Aloe vera/N-acetil-L-cisteína produziu zonas de inibição variando de 11 mm a 17 mm, sendo a maior zona observada contra Pseudomonas aeruginosa. Esse fluxo de trabalho oferece uma abordagem prática de laboratório para preparar e caracterizar preliminarmente Aloe vera fresca.formulações baseadas em medicina complementar em estágio inicial.

Introdução

A aloe vera continuou a atrair considerável atenção científica devido ao seu uso de longa data na medicina tradicional e à sua relevância crescente em pesquisas farmacêuticas, biomédicas, cosméticas e^{alimentares 1,2,3}. Esta planta medicinal contém uma ampla variedade de constituintes biologicamente ativos, incluindo polissacarídeos, compostos fenólicos, antracinonas, vitaminas, minerais, enzimas e outros metabólitos de baixo peso molecular que podem contribuir para suas propriedades terapêuticas e ^{funcionais 1,2,3}. Entre esses componentes, o acemanano tem sido enfatizado devido ao seu potencial biomaterial e aos papéis relatados na reparação de tecidos, imunomodulação e aplicações regenerativas ^4,5. Paralelamente, compostos fenólicos e outros antioxidantes têm sido associados aos efeitos de eliminação de radicais livres, protetores e biologicamente suportadores da Aloe vera. Preparações ^2,3.

Nos últimos anos, houve um interesse crescente na incorporação da Aloe vera em sistemas avançados de formulação e materiais bioativos. Hidrogéis à base de aloe vera, tintas de biomateriais, nanocompósitos e andaimes impressos tridimensionalmente foram investigados para cicatrização de feridas e aplicações de suporte tecidular devido à sua alta capacidade de hidratação, biocompatibilidade e propriedades biológicas^{multifuncionais} 4,6,8,9,10,11. Estudos experimentais mostraram que materiais contendo Aloe vera podem apoiar o manejo da ferida ao contribuir para um ambiente úmido, melhorar as propriedades fisicoquímicas da formulação e fornecer suporte antioxidante ou antimicrobiano sob condições selecionadas in vitro, in vivo e dependentes da^formulação 4,7,8,9,10,11. Além disso, a Aloe vera tem sido explorada em aplicações de preservação e formulação de alimentos, onde revestimentos à base de gel e sistemas relacionados foram associados a maior estabilidade oxidativa, melhor qualidade sensorial e desempenho microbiológico^{aprimorado12,13}. Esses desenvolvimentos indicam que a Aloe vera é cada vez mais vista não apenas como um produto herbal tradicional, mas também como um material natural multifuncional com amplo potencial de formulação ^2,3,12,13.

A relevância biológica da Aloe vera também se estende a aplicações de orientação antimicrobiana e microbiológica. Estudos recentes descreveram efeitos inibitórios de Aloe vera ou preparações contendo Aloe vera contra microrganismos clinicamente importantes, incluindo Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, espécies de Candida e isolados clínicos de infecções de^{feridas 14,15,16,17}. Evidências in vitro anteriores também mostraram atividade de Aloe vera em gel interno contra cepas de referência e isolados clínicos de Helicobacter ^{pylori 18}. Além disso, sistemas híbridos contendo Aloe vera foram relatados como apresentando capacidades combinadas de antimicrobianos, antioxidantes e cicatrização de feridas, apoiando ainda mais a natureza multifuncional desse material derivado de plantas¹⁹. No entanto, o desempenho biológico da Aloe vera é influenciado por várias variáveis metodológicas, incluindo a fração da planta utilizada, procedimento de extração, concentração, condições de manuseio, frescura do gel e se a preparação testada contém apenas gel interno ou inclui componentes associados ao^{látex 2,20}. Esses fatores são especialmente importantes porque as frações do gel interno e das folhas externas diferem tanto em composição quanto em perfil^{toxicológico 20}.

Apesar do crescente corpo de literatura, permanecem importantes lacunas metodológicas. Em muitos estudos publicados, comportamento antioxidante, propriedades fisicoquímicas, avaliação microbiológica e desempenho antimicrobiano são frequentemente avaliados separadamente, em vez de dentro de um único fluxo de trabalho integrado. Para pesquisas focadas em formulação, entretanto, esses parâmetros estão intimamente interligados. Uma preparação pode apresentar atividade antioxidante favorável, mas ainda assim exigir cuidadosa avaliação microbiológica e caracterização fisicoquímica antes de ser considerada adequada para desenvolvimento experimental posterior. Portanto, fluxos de trabalho laboratoriais que combinam avaliação relacionada à redox, avaliação de pH, testes de crescimento não detectável baseados em cultura sob condições definidas e triagem antimicrobiana preliminar podem fornecer uma base mais prática e informativa para a caracterização em estágio inicial de formulações frescas de Aloe vera .

Assim, este estudo teve como objetivo avaliar formulações frescas de extratos de Aloe vera em gel interno preparadas em diferentes concentrações em termos de características de pH, capacidade total de antioxidantes, status de crescimento não detectável baseado em cultura sob condições laboratoriais definidas e triagem antimicrobiana preliminar por difusão em disco e diluição qualitativa em tubo duplo. Ao integrar essas avaliações em um único fluxo de trabalho experimental, o estudo foi projetado para fornecer uma abordagem prática de base para a caracterização preliminar da Aloe vera.formulações baseadas em Medicina Complementar.

Protocolo

1. Preparação de Aloe vera. Extrato e série de diluição

1. Colha as folhas maduras de uma planta de aloe vera cultivada em temperatura ambiente e enxágue-as bem sob água corrente para remover qualquer resíduo.
2. Em um gabinete de biossegurança nível 2 (BSL-2), desinfete a superfície da folha com etanol 70% usando luvas estéreis. Após aplicar 70% de etanol, deixe a superfície da folha secar completamente ao ar por pelo menos 2 minutos antes da incisão asséptica.
3. Usando um bisturi estéril, remova a ponta distal e as margens da folha, deixe o exsudato de látex amarelo drenar completamente por aproximadamente 30 minutos e então filete a folha longitudinalmente. Separe cuidadosamente e recolha apenas o gel interno transparente, evitando a casca externa e a camada residual de látex.
4. Transfira cuidadosamente o gel interno de Aloe vera para um recipiente estéril e homogeneize por meio de vórtices intermitentes por aproximadamente 5-10 minutos a aproximadamente 2.500 rpm (ou configuração equivalente de vórtice médio-alto); realize o procedimento em temperatura ambiente, a menos que o controle de temperatura seja necessário para o instrumento específico.
5. Em condições assépticas, prepare formulações frescas de extrato de Aloe vera em gel interno a 5%, 10%, 15% e 20% (p/v) usando água destilada estéril; por exemplo, prepare 5% (p/v) como gel de 5 g levado a um volume final de 100 mL, e ajuste as concentrações restantes de forma análoga.

2. Medição de pH

1. Realize calibração de medidor de pH em três pontos usando soluções tampão padrão de pH 4,01, 7,00 e 10,01 com rastreabilidade NIST antes de cada série de medições.
2. Meça o pH para cada concentração em temperatura ambiente (20–25 °C); Registre pelo menos três réplicas técnicas por concentração.

3. Medição da capacidade total de antioxidantes (TAC)

1. Use as formulações de extrato de Aloe Vera preparadas no Passo 1 (5%, 10%, 15% e 20%) para medição do TAC.
2. Leve todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente (20–25 °C) antes da análise para garantir consistência analítica.
3. Calibre o analisador bioquímico automatizado (Rel Assay, Turquia) de acordo com os procedimentos operacionais padrão do fabricante antes de iniciar o ensaio.
4. Carregue os reagentes da capacidade total de antioxidantes (TAC) baseados no método Erel nos compartimentos dos reagentes do analisador.
5. Pipete a Aloe vera. Extraia as amostras nos copos ou poços de reação apropriados usando micropipetas calibradas. (Volume da amostra: 5 μL)
6. Inicie a execução do ensaio TAC usando o protocolo programado pelo analisador para o método baseado em cátions radicais ABTS, seguindo os volumes de reagentes e as configurações de incubação especificadas pelo fabricante.
7. Permita que a reação prossiga automaticamente, durante a qual os antioxidantes presentes na amostra reduzem o cátion radical ABTS colorido, resultando em uma diminuição da absorção.
8. Meça a variação na absorvância espectrofotometricamente no comprimento de onda especificado definido pelo método TAC. (Comprimento de onda: 660 nm)
9. Calcule os valores totais da capacidade antioxidante usando o software do analisador comparando as mudanças de absorção da amostra com a curva de calibração equivalente ao Trolox.
10. Expresse os resultados do TAC como equivalentes de mmol Trolox / L por unidade de volume de extrato.
11. Realize todas as medições em duplicado para garantir a confiabilidade analítica.

4. Avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura da Aloe vera. Gel interno

1. Inocule 10 μL de cada extrato em ágar sanguíneo, ágar azul de metileno de eosina e ágar de dextrose Sabouraud usando um laço calibrado (10 μL) (método de contagem de colônias).
2. Para avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura, dispense assépticamente uma alíquota padronizada de 50 μL usando uma micropipeta calibrada sobre placas de ágar sanguíneo, ágar azul de metileno eosina e ágar de dextrose Sabouraud, espalhando-a suavemente usando um alça descartável estéril (10 μL) (avaliação de reprodução baseada em cultura usando o método de gotejamento direto).
3. Incubar placas de ágar sanguíneo e ágar azul de metileno-esina aeróbicamente a 37 °C e placas de ágar de dextrose Sabouraud aeróbicamente a 25–28 °C, depois inspecionar visualmente as placas para crescimento às 24, 48 e 72 horas. Incube uma placa não inoculada de cada meio em paralelo como controle negativo.

5. Avaliação da atividade antimicrobiana da mistura de teste de Aloe vera

1. Em condições estéreis, prepare uma solução de teste homogênea misturando extrato de gel interno de Aloe vera 70% estéril com solução de N-acetil-L-cisteína a 30% (10% w/v em água estéril).
   NOTA: Essa mistura reduz a alta viscosidade do gel raspado da folha e obtém uma consistência mais fluida. Considere essa formulação composta como uma mistura preliminar de triagem. Portanto, interprete os achados antimicrobianos para refletir a atividade combinada de ambos os componentes.
2. Faça vórtice na mistura homogeneizada até obter uma solução uniforme.
3. Subculturam os estoques bacterianos padrão previamente crioppreservados de Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli. ATCC 25922, armazenado a -80 °C, sobre ágar sanguíneo padrão (para bactérias Gram-positivas) e ágar padrão de eosina e azul de metileno (para bactérias Gram-negativas), e incubado a 37 °C por 18-24 horas.
4. Ao final da incubação, prepare suspensões bacterianas ajustadas a 0,5 de turbidez McFarland usando soro fisiológico estéril das colônias cultivadas, seguindo as recomendações padrão de preparação de inoculos para testes de suscetibilidade^{antimicrobiana 38}.
5. Inocule uniformemente as placas de ágar Mueller-Hinton com cada suspensão bacteriana padronizada usando um swab estéril.
6. Aplique um volume padronizado de 15 μL da mistura estéril de teste Aloe vera/NAC em cada disco antimicrobiano estéril de 6 mm usando uma micropipeta calibrada. O mesmo volume de carga, tempo de absorção (pelo menos 2 min) e tempo de secagem ao ar (aproximadamente 5 min) foram aplicados a todos os discos entre as réplicas para garantir consistência procedural. Esse volume foi selecionado como uma quantidade prática de carga para discos de 6 mm em triagem de difusão de disco baseada em extrato vegetal e foi mantido constante para todos os experimentos.
7. Coloque os discos impregnados com extrato na superfície das placas de ágar inoculadas usando pinças estéreis.
8. Incube as placas a 37 °C por 18–24 horas em condições aeróbicas.
9. Após a incubação, meça manualmente o diâmetro de cada zona de inibição, incluindo o diâmetro do disco, até o milímetro mais próximo usando uma régua. Realize o experimento como uma única medição descritiva, reportando os diâmetros das zonas registrados como valores individualmente observados. Realize medições inspecionando visualmente as placas conforme as recomendações padrão de leitura de difusão^{de disco 38}.
10. Prepare diluições em série dupla (1/2, 1/4, 1/8 e 1/16) da mistura de teste 70:30 (v/v) de Aloe vera/NAC em caldo Mueller-Hinton.
11. Inocule cada tubo com 500 μL da correspondente suspensão bacteriana padronizada de 0,5 McFarland preparada em soro fisiológico estéril. Prepare uma série de diluição separada para cada cepa de referência e incube os tubos inoculados sob as condições especificadas abaixo.
12. Incube os tubos inoculados a 37 °C por 18–24 horas.
13. Avaliar visualmente o crescimento microbiano pela turbidez em relação ao caldo controle; interprete o ensaio qualitativamente, em vez de como uma determinação formal de CIM.
14. Use um disco de ciprofloxacina (5 μg) como controle positivo em paralelo com discos impregnados de aloe vera/NAC. Aplique o mesmo disco controle positivo para Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli ATCC 25922 para confirmar suscetibilidade sob condições de difusão do disco.
    NOTA: Realize todos os procedimentos microbiológicos sob condições de BSL-2 e registre todas as observações de diâmetro de zona e turbidez imediatamente após a incubação para análise descritiva subsequente. Este protocolo combina preparação asséptica de A. vera.extrato com ensaios bioquímicos e microbiológicos complementares para apoiar o desenvolvimento de formulações à base de plantas para uso em medicina tópica e complementar. O fluxo de trabalho é projetado para ser prático em laboratórios rotineiros: a triagem de pH e redox (TAC) pode ser realizada juntamente com a cultura de esterilidade e dois ensaios antimicrobianos comumente usados (difusão de disco e diluição em tubos).

Resultados

Valores de pH do extrato de Aloe Vera em diferentes concentrações

O perfil de pH mostrou um padrão não monotônico entre as concentrações. Os valores médios de pH foram 6,47, 6,60, 6,26 e 6,28 para as formulações 5%, 10%, 15% e 20%, respectivamente. As diferenças gerais entre grupos foram significativas (p = 0,024). As formulações de 5% e 10% apresentaram valores de pH relativamente mais altos, enquanto as formulações de 15% e 20% se a...

Discussão

O presente estudo oferece um fluxo de trabalho integrado de laboratório para a caracterização preliminar de formulações frescas de extratos de Aloe vera em gel interno, combinando medição de pH, análise da capacidade total de antioxidantes (TAC), avaliação de crescimento não detectável baseada em cultura e triagem antimicrobiana descritiva. Concentrações crescentes de Aloe vera fresca em gel interno estiveram associadas a valores mais altos de TAC, enquanto nenhum cresc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Armazenamento de amostras	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Preparação de amostras	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	Inoculação de cultura	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	Inoculação de cultura	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	Inoculação de cultura	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	Inoculação de cultura	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	Diluição de cultura	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	Preparação de amostras	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	Análises de amostras	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	Análises TAC de amostras	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	Kit	RL0017