Transplante cardíaco de camundongo heterópico cervical usando a técnica de anastomose ponta a lateral para estudar imunologia de transplante

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

Resumo

O transplante cardíaco heterotópico murino é um modelo pré-clínico fundamental na pesquisa em transplantes. O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos oferece vantagens distintas, incluindo monitoramento visual direto e palpável da viabilidade do enxerto, redução de traumas cirúrgicos e recuperação pós-operatória mais rápida. Portanto, tornou-se uma plataforma cada vez mais valiosa para o estudo da imunologia de transplantes, especialmente para animais com condições fisiológicas ruins devido à modificação genética ou indução de medicamentos, e para experimentos que exigem transplante de órgãos secundários ou combinados, a região cervical frequentemente se torna o único local viável. Técnicas convencionais de transplante cervical, seja usando sutura ponta a ponta ou métodos baseados em manguito, exigem a ligadura permanente da artéria carótida comum e da veia jugular externa do receptor, o que pode comprometer a perfusão cerebral e introduzir materiais estranhos ou distúrbios hemodinâmicos. Para abordar essas limitações, este artigo detalha uma técnica refinada de transplante cardíaco cervical utilizando uma anastomose vascular de ponta a ponta. O método preserva a artéria carótida comum e a veia jugular externa do receptor, mantendo a perfusão cerebral normal e evitando complicações associadas à ligadura permanente dos vasos. Este protocolo detalha as etapas desde a colheita do coração com doador até a anastomose do receptor e o cuidado pós-operatório. Resultados representativos demonstram alta taxa de sucesso cirúrgico (96,7%) e a eficácia do modelo no estudo da rejeição de aloenxertos. Essa técnica oferece um modelo fisiologicamente relevante e tecnicamente acessível para pesquisadores em imunologia de transplantes.

Introdução

Ao longo do último meio século, a imunologia de transplantes continuou sendo um foco central para imunologistas e especialistas em transplantes. Hoje, o transplante de órgãos sólidos é amplamente realizado e representa o tratamento mais eficaz para doenças em estágio terminal de órgãos. No entanto, a rejeição do enxerto não foi fundamentalmente resolvida e ainda representa um dos principais obstáculos no transplante e uma das principais causas de perda^{do enxerto 1}. Consequentemente, superar ou mitigar a rejeição enquanto se reduz ou evita a imunossupressão sistêmica continua sendo um desafio significativo e um objetivo fundamental de pesquisa na área.

Modelos vascularizados de transplante de órgãos animais, especialmente modelos murinos, desempenharam um papel crucial no avanço da imunologia de transplante e forneceram uma base científica essencial para a tradução^{clínica 2}. Por exemplo, muitos agentes imunossupressores usados clinicamente hoje — como ciclosporina, tacrolimus e rapamicina — foram validados com sucesso pela primeira vez em modelos de transplante de^{camundongos 3,4}.

O modelo de transplante cardíaco heterotópico (TH) em camundongos é um dos modelos pré-clínicos mais utilizados, preferido devido à abundância de cepas genéticas disponíveis e reagentes para pesquisa, além de seu procedimento relativamente simples e fácil monitoramento pós-operatório. Como tal, serve como uma plataforma fundamental para estudar mecanismos de rejeição aguda, induzir tolerância imunológica e avaliar novos imunossupressores in^{vivo 5,6}.

O primeiro modelo murinho heterotópico HT foi estabelecido por Corry et ^al.7 em 1973. Neste modelo, o coração doador é colocado na cavidade abdominal do receptor, com a aorta do enxerto e a artéria pulmonar (PA) anastomosadas de ponta a ponta com a aorta abdominal e da veia cava inferior (VCI) do receptor, respectivamente. Esse método permaneceu como a técnica padrão para a TH abdominal por décadas. Impulsionado pela necessidade de acomodar aloenxertos de terceiros em estudos de tolerância, um segundo local para a HT foi explorado. Isso levou ao desenvolvimento de modelos de TH cervical em camundongos, que oferecem outras vantagens, como avaliação visual direta da viabilidade do enxerto, menor trauma cirúrgico e menor risco de infecção^{pós-operatória 5,8,9}. Em 1991, Chen et ^al.8 descreveram pela primeira vez um modelo de HT cervical heterotópico em camundongos, envolvendo anastomose manual ponta a ponta da aorta doadora e PA na artéria carótida comum (CCA) e na veia jugular externa (EJV) do receptor, respectivamente. No entanto, esse modelo não teve adoção ampla devido ao desafio técnico significativo causado pela grave incompatibilidade entre a aorta doadora e a ACC receptora, que tornava a anastomose vascular extremamente difícil.

Também em 1991, Matsuura et ^al.9 introduziram uma técnica de manguito sem sutura para anastomose vascular no modelo de HT cervical. Esse método simplifica o procedimento ao eliminar a sutura manual tecnicamente exigente, facilitando o domínio. Posteriormente, foram relatadas diversas melhorias técnicas na técnica do^{punho 10,11}. Atualmente, o método do manguito é amplamente utilizado na TH cervical, especialmente por pesquisadores sem experiência prévia em suturas microvasculares. No entanto, a técnica do manguito introduz materiais artificiais, que podem induzir inflamação local e interferir nas avaliações imunológicas, além de apresentar desafios técnicos em vasos de pequeno^{calibre 5,6}. Recentemente, Liao et ^al.12 propuseram uma técnica de manga sem manga na TH cervical, na qual vasos doadores e receptores são anastomosados diretamente usando o método da manga. Ao evitar materiais artificiais e acomodar pequenos vasos, essa abordagem oferece uma plataforma fisiológica e reprodutível para transplante cardíaco secundário.

No entanto, tanto as técnicas de ponta a ponta quanto as de manguito sem sutura exigem a ligadura permanente do CCA unilateral e do EJV do receptor. Isso compromete o suprimento unilateral de sangue cerebral ao sistema nervoso central, o que pode levar a complicações neurológicas, como distúrbio direcional e hemiplegia 13,14,15. Além disso, essas abordagens de ponta a ponta podem levar a alterações na hemodinâmica, como jatos arteriáis de alta velocidade, e apresentam um risco maior de trombose e estenose, que são prejudiciais à sobrevivência do enxerto a longo prazo. Além disso, a técnica do manguito também traz um risco inerente de trombose devido à presença do manguito.

Para resolver essas limitações, adotamos uma técnica refinada de sutura manual ponta a lateral, onde a aorta ascendente e a PA do doador são anastomosadas ao CCA e EJV do receptor, respectivamente. Esse método preserva a integridade e continuidade dos principais vasos cervicais do receptor, mantendo assim a perfusão cerebral normal e seguindo o princípio 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento) da pesquisa animal. Usando essa técnica, alcançamos uma taxa de sucesso cirúrgico de aproximadamente 96,7% (29/30, com apenas uma mortalidade por hemorragia). Nenhuma complicação relacionada à isquemia cerebral foi observada em nenhum camundongo receptor após a cirurgia. Esse método se assemelha muito aos modelos abdominais padrão e é particularmente adequado para cirurgiões com experiência em suturas vasculares para estabelecer modelos de TH cervical.

Protocolo

O cuidado animal cumpriu as diretrizes internacionais, e todos os procedimentos foram realizados no Instituto de Transplante de Órgãos, Hospital Tongji, Faculdade de Medicina Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia Huazhong, China. A aprovação ética para o estudo foi obtida pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Tongji (Número de aprovação: TJH-202310010). Os instrumentos apropriados usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação Pré-Operatória

1. Esterilize a sala de cirurgia usando uma lâmpada ultravioleta por 30 minutos. Desinfete a mesa cirúrgica com etanol 70% e autoclave em todos os instrumentos cirúrgicos (121 °C por 20 minutos).
2. Use machos adultos C57BL/6 e camundongos BALB/c (pesando 20–25 g; 8–10 semanas de idade). Para transplante sintegênico, use camundongos C57BL/6 tanto como doadores quanto como receptores. Para transplante alogênico, use camundongos BALB/c como doadores e camundongos C57BL/6 como receptores.
3. Administrar analgesia pré-operatória ao camundongo receptor por meio de injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 1 hora antes da cirurgia.
   NOTA: A analgesia pré-operatória não é realizada no camundongo doador, pois o doador é eutanasiado imediatamente após o procedimento de colheita do coração.
4. Prepare a solução anestésica contendo cetamina (20 mg/mL) e xilazina (2 mg/mL). Anestesie o camundongo com anestesia cetamina preparada por meio de injeção intraperitoneal com volume de dose de 5 μL/g. Confirme a eficácia da anestesia observando respiração lenta e regular, perda do reflexo de endireitamento e ausência do reflexo pedal.
5. Raspe o pelo das áreas torácica e abdominal. Prenda o rato em posição supina sobre uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal. Desinfete o local cirúrgico alternando povidona-iodo e etanol a 70% por três ciclos. Estenda o pescoço do receptor retraindo os incisivos superiores para cima com um fio de seda 6-0 para otimizar a exposição.
6. Use luvas cirúrgicas estéreis. Faça uma abertura oval um pouco maior que o local da incisão em um drapeado estéril. Depois, use para cobrir o mouse do destinatário.

2. Colheita de coração por doador

1. Faça uma incisão abdominal na linha média seguida de uma incisão transversal (cruciforme) para expor totalmente a cavidade peritoneal.
2. Retraa suavemente o intestino delgado para a esquerda usando um cotonete estéril umedecido com soro fisiológico para expor a aorta abdominal e a CCI.
3. Injete 0,3 mL de soro fisiológico heparinizado (300 UI/mL) na VCI e espere 1 minuto pela heparinização sistêmica. Transecte a aorta abdominal e a VI para exsanguinar o doador.
4. Incenda o diafragma junto com a parede torácica anterior para fazer uma incisão em forma de U através da caixa torácica usando tesoura para expor a cavidade torácica.
5. Injete 2 mL de soro fisiológico frio (4 °C) no coração através da VCI intratorácica para eliminar o sangue residual.
   NOTA: O objetivo principal desta etapa é induzir hipotermia e fazer o coração parar de bater rapidamente. O segundo objetivo é eliminar completamente o sangue do coração, especialmente das artérias coronárias.
6. Cubra o coração com uma gaze estéril embebida em soro frio (4 °C). A tração suave para baixo nessa gaze facilita a exposição ideal da aorta e do PA. Além disso, a gaze embebida em soro frio serve para manter a hipotermia do enxerto durante a dissecação subsequente.
7. Identifique e isole a CCI intratorácica. Ligue-a usando um ponto de seda 6-0 e transeita distal à ligadura com microtesoura.
8. Identifique e remova o timo para expor o arco aórtico e a PA. Identifique e isole a veia cava superior. Ligue usando um ponto de seda 6-0. Transecto distal da ligadura.
9. Identifique e isole a aorta ascendente. Transecte a aorta proximal à artéria inominada para maximizar o comprimento dos vasos.
10. Identifique e isole o PA. Transecto-o apenas proximal à sua bifurcação. Liga todos os vasos posteriores ao coração (as veias pulmonares) com uma seda 6-0. Corte cuidadosamente o coração com uma microtesoura.
11. Mova suavemente o coração e mergulhe-o em soro fisiológico frio (4 °C) colocado sobre gelo para armazenamento até o transplante.

3. Operação do destinatário

1. Isolamento do recipiente destinatário
   1. Faça uma incisão longitudinal de 1 cm no lado direito do pescoço, estendendo-se da borda superior do ponto médio da clavícula direita até a borda inferior da mandíbula.
   2. Retirar o lobo direito da glândula submandibular. Transecte o músculo esternocleidomastoide direito para criar um bolso suficiente para implantação do coração doador.
   3. Identifique e isole o EJV correto e o CCA correto. Mobilize a EJV cauterizando seus ramos. Depois, isole a CCA dos tecidos ao redor. Evite danificar o nervo vago acompanhante ao dissecar o CCA.
2. Anastomose arterial
   1. Simultaneamente, ocluir o EJV e o CCA usando duas pinças microvasculares, com uma presa aplicada nas extremidades cranianas de ambos os vasos e a outra nas extremidades caudais. Aplique primeiro a pinça craniana, seguida pela grampa caudal.
      NOTA: As pinças microvasculares são preferencialmente introduzidas do lado direito do mouse para a esquerda, com as alças das grampos posicionadas no lado direito. Essa orientação facilita a subsequente anastomose vascular e ajuda a reduzir a compressão da traqueia.
   2. Gire o mouse 90° no sentido horário. Faça uma incisão longitudinal no CCA, garantindo que o comprimento corresponda ao diâmetro da aorta ascendente doadora. Lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado para remover completamente quaisquer coágulos residuais.
   3. Para criar a janela anastomótica, use uma sutura 11-0. Passe a agulha pela parede do vaso a uma distância aproximadamente igual ao diâmetro do vaso doador, levantando suavemente a parede do vaso com o ponto e então retirando uma pequena porção com uma microtesoura.
   4. Coloque o coração doador no bolso cervical. Ancore a aorta ascendente do doador ao CCA receptor colocando dois pontos 11-0 com agulhas nas extremidades proximal e distal. Posicione o coração doador do lado direito do receptor e cubra-o com gaze úmida e estéril.
   5. Utilizando a sutura distal, realize uma sutura contínua nas paredes posteriores em direção distal a proximal com 6–8 pontos.
   6. Após concluir a sutura da parede posterior, gire o rato 180°. Refleta o coração doador para a esquerda do receptor e cubra-o com gaze estéril úmida. Completar a anastomose suturando as paredes dos vasos anteriores na direção proximal a distal com 6–8 pontos. Lave o lúmen com soro fisiológico antes de amarrar o nó final para remover as bolhas de ar.
3. Anastomose veiosa
   1. Faça uma incisão longitudinal no EJV, correspondendo ao diâmetro do PA doador. Lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado para remover completamente quaisquer coágulos residuais.
   2. Fixe o PA doador ao EJV receptor colocando dois pontos 11-0 com agulhas nas extremidades proximal e distal.
   3. Utilizando a sutura proximal, suture continuamente as paredes posteriores na direção proximal a distal com 5 a 7 pontos.
   4. Continue com o mesmo ponto para fechar as paredes anteriores de fora em direção distal a proximal com 5 a 7 pontos. Amarre o ponto no ápice proximal. Lave o lúmen com soro fisiológico antes de amarrar o nó final para remover as bolhas de ar.
4. Reperfusão
   1. Solte primeiro a pinça distal, seguida pela pinça proximal, para iniciar a reperfusão. Após a reperfusão, o enxerto cardíaco deve ficar imediatamente vermelho. Ritmo normal e contração normalmente se recuperam em 1–2 minutos.
   2. Uma vez confirmada a hemostasie, posicione cuidadosamente o enxerto cardíaco dentro do bolso subcutâneo, garantindo que não haja torção dos vasos. Feche a incisão da pele com pontos 5-0.
5. Cuidados pós-operatórios
   1. Coloque o rato em uma gaiola limpa e coloque-o em uma incubadora infantil ajustada a 34 °C para facilitar a recuperação. Monitore o rato a cada 1–2 horas até que ele acorde espontaneamente, depois o coloque de volta na gaiola de alojamento.
      NOTA: O reaquecimento é necessário para prevenir a depressão respiratória induzida por hipotermia e facilitar a recuperação da anestesia.
   2. Administrar analgesia pós-operatória por meio de injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) a cada 12 horas nas primeiras 48 horas após a cirurgia.
   3. Monitore diariamente as pulsações do enxerto cardíaco e registre o status de sobrevivência do enxerto.

Resultados

Trinta casos foram realizados usando esse modelo modificado; a taxa de sucesso operacional foi de 96,7% (29/30). Apenas uma mortalidade ocorreu devido a hemorragia intraoperatória. Os 29 casos restantes foram incluídos para análise dos tempos operacionais e dos desfechos do enxerto. Nenhuma complicação relacionada à isquemia cerebral foi observada em nenhum receptor após a cirurgia. A colheita do coração doado foi concluída em 6,4 ± 0,7 min, e a operação do receptor em 28,7 ± 1,2 min. Es...

Discussão

O modelo de TH cervical usando a técnica de anastomose de ponta a ponta oferece várias vantagens. Comparado à sutura ponta a ponta ou ao método de cuff, essa abordagem preserva completamente a continuidade da ACC e da VEJ, mantendo assim a hemodinâmica cerebral normal e evitando efetivamente complicações relacionadas à isquemia. A anastomose ponta a lateral também evita dificuldades técnicas causadas por uma incompatibilidade nos diâmetros dos vasos doador e receptor. Comparado à TH abdo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1mL Syring	Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd	B309628
11-0 sutures with needles	Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	H1101	Para anastomoses vasculares
3mL Syring	Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd	B309657
5-0 sutures with needles	Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	CR537	Para fechamento da pele
6-0 silk suture	Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	2650182
Blood Stop Cautery	Ningbo Shunye Medical Co., Ltd.	BDD-YE-DT-1
Buprenorphine	Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd	H12020275	Analgésico
Cotton swabs	Fuqing Health & Integral Medical	20230R
Curved micro forceps	RWD life Science Co.	F11031-11	Ferramenta cirúrgica
Curved micro scissors	66 Vision Tech Co., Ltd.	54108B	Ferramenta cirúrgica
Gauze swabs	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Heparin sodium injection	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Micro needle holder	World Precision Instruments Co., Ltd.	555408NT	Ferramenta cirúrgica
Micro vessel clip	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5481T
Micro Vessel clip applicator	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5480
Needle holder	RWD life Science Co.	F31025-13	Fechamento abdominal
Saline	Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd	716092103
Straight micro forceps	RWD life Science Co.	F11029-11	Ferramenta cirúrgica
Surgical microscope	Leica	M650
Surgical platform			Personalizado, magnético
Tissue forceps	RWD life Science Co.	F12002-12	Ferramenta cirúrgica
Tissue scissor	RWD life Science Co.	S12003-09	Ferramenta cirúrgica