Cápsulas entéricas de Sophora flavescens com cinco sabores Alíviam Colite Experimental e Alterações Relacionadas à Ferroptose

Resumo

Em um modelo murino de colite ulcerativa, cápsulas de Sophora flavescens revestidas entéricamente de cinco sabores aliviaram a lesão do cólon e melhoraram o estresse oxidativo, o desequilíbrio das citocinas inflamatórias, a sinalização JAK2/STAT3 e alterações nos marcadores relacionados à ferroptose.

Resumo

A colite ulcerativa continua difícil de gerenciar porque as opções terapêuticas eficazes e direcionadas são limitadas, e o estresse oxidativo, a sinalização inflamatória e as vias reguladas de morte celular podem contribuir para a lesão mucosa. Este estudo avaliou se cápsulas de Sophora flavescens com cinco sabores revestidas por entérico (FSEC) aliviam a colite experimental e explorou as mudanças associadas no estresse oxidativo, inflamação e marcadores de ferroptose. Um modelo murino de colite ulcerativa foi estabelecido usando exposição cíclica a 2,5% de sulfato de dextrano de sódio, combinado com desafio alfa do fator de necrose tumoral. Os camundongos foram tratados com FSSEC de baixa, média ou alta dose ou com o antagonista TLR4 CRX-526 como intervenção de controle positivo. A histopatologia do cólon foi avaliada por coloração de hematoxilina e eosina. Os níveis de superóxido sérico dismutase, catalase, glutationa, mieloperoxidase e Fe²⁺ foram medidos por meio de ensaios bioquímicos. Citocinas do tecido do cólon foram quantificadas por ensaio imunossorvente ligado a enzimas, a expressão de JAK2 e STAT3 foi avaliada por imunohistoquímica, e a expressão de GPX4, FTH1 e ACSL4 foi analisada por western blotting. O tratamento com FSEC reduziu a lesão da mucosa do cólon e a infiltração de células inflamatórias, aumentou os índices antioxidantes e diminuiu os níveis de mieloperoxidase. A FSEC também reduziu os níveis de TNF-α e IL-1α, restaurou parcialmente os níveis de IL-13 e esteve associada a uma imunocoloração mais fraca de JAK2 e STAT3. Paralelamente, o FSEC melhorou as mudanças nos marcadores relacionados à ferroptose, incluindo a redução dos níveis de Fe²⁺ e ACSL4 e o aumento da expressão de GPX4 e FTH1. Esses achados sugerem que a FSEC alivia a colite ulcerativa experimental em camundongos, ao menos em parte melhorando o status de estresse oxidativo, moderando a sinalização inflamatória e restaurando os perfis de marcadores relacionados à ferroptose.

Introdução

A colite ulcerativa () é um distúrbio inflamatório crônico que afeta principalmente a mucosa do cólon e do recto e é caracterizada por episódios recorrentes de inflamação mucosa, ulceração e função da barreira ^{comprometida 1,2,3}. Embora suscetibilidade genética, fatores ambientais, disfunção da barreira epitelial e desregulação imunológica tenham sido implicados na patogênese da, os mecanismos subjacentes à lesão mucosa persistente permanecem incompletamente compreendidos. Os tratamentos farmacológicos atuais, incluindo aminosalicilatos, corticosteroides, imunossupressores e agentes biológicos, podem reduzir a atividade da doença em muitos pacientes; no entanto, seu uso clínico pode ser limitado por recaídas após a interrupção do tratamento, efeitos adversos, alto custo e respostas terapêuticas^{incompletas 3}.

A ferroptose, uma forma de morte celular regulada dependente do ferro caracterizada por peroxidação lipídica e metabolismo alterado do ferro, tem sido cada vez mais implicada na inflamação intestinal e na lesão epitelial associada^à 4,5,6,7,8. Paralelamente, as formulações da medicina tradicional chinesa têm atraído cada vez mais atenção como abordagens complementares para o tratamento da devido ao seu potencial terapêutico^{multi-alvo 9}.

Cápsulas entéricas de cinco sabores de Sophora flavescens (FSEC) são usadas clinicamente para o tratamento da leve a moderada na prática da medicina tradicional chinesa. Estudos anteriores sugerem que a FSEC pode melhorar os sintomas da por meio de mecanismos multicomponentes e^{multi-alvo 10}. No entanto, os efeitos do FSEC sobre o estresse oxidativo, sinalização inflamatória, atividade do JAK2/STAT3 e alterações relacionadas à ferroptose na experimental permanecem insuficientemente caracterizados.

O estresse oxidativo e a sinalização inflamatória são importantes contribuintes para a lesão da mucosa intestinal na. A produção excessiva de espécies reativas de oxigênio pode prejudicar a integridade epitelial, promover a infiltração das células inflamatórias e prejudicar os sistemas de defesa antioxidantes. Vias mediadas por citocinas, como a sinalização JAK2/STAT3, contribuem para amplificação inflamatória e lesão^tecidular 11,12,13,14,15. Além disso, o estresse oxidativo e a ferroptose estão intimamente ligados por alterações nas defesas antioxidantes, metabolismo do ferro e peroxidação^lipídica 16,17,18,19,20. Portanto, a avaliação simultânea de índices de estresse oxidativo, citocinas inflamatórias, sinalização JAK2/STAT3 e marcadores relacionados à ferroptose pode fornecer uma compreensão mais abrangente da lesão mucosa e respostas terapêuticas em experimental.

No presente estudo, um modelo de camundongo alfa-desafiado com fator alfa de dextrano sulfato de sódio e necrose tumoral foi utilizado para avaliar os efeitos de FSC em doses baixas, médias e altas. Uma força metodológica chave deste desenho é a integração da avaliação histopatológica com medições de índices de estresse oxidativo sérico, citocinas do tecido do cólon, imunohistoquímica JAK2/STAT3 e análise por western blot de proteínas relacionadas à ferroptose dentro de um único arcaboucão experimental. Essa abordagem foi usada para determinar se o FSEC alivia a experimental e para caracterizar as mudanças associadas no estresse oxidativo, sinalização inflamatória e perfis de marcadores relacionados à ferroptose. O desenho experimental geral e o fluxo de trabalho analítico são resumidos na Figura 1.

Figura 1: Fluxo de trabalho experimental do modelo de camundongo e análises a jusante. A colite ulcerativa experimental crônica foi induzida pela exposição cíclica a 2,5% de dextrano sulfato de sódio (DSS) combinada com o desafio do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) durante a última semana do protocolo experimental. Os camundongos foram designados para os grupos controle normal, modelo, FSC de baixa dose, FSC de dose média, FSAC de alta dose e CRX-526 de controle positivo. A FSEC foi administrada por gavage intragástrico em doses de 108, 216 ou 432 mg/kg de peso corporal. O CRX-526 foi usado como intervenção de controle positivo. Após o tratamento final, amostras foram coletadas para avaliação histopatológica, ensaios bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo, análise de citocinas pelo ELISA, imunohistoquímica e análise do western blot. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética da Faculdade de Medicina de Nanchang (aprovação nº NY2SC 20250407). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os produtos químicos, reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais e tratamento

Ratos machos C57BL/6J (tipo selvagem, 8 semanas de idade) foram usados neste estudo. Os animais eram alojados em condições laboratoriais padrão, com temperatura e umidade controladas, e tinham acesso livre a comida e água. Após a aclimatação, a colite crônica foi induzida pela administração de três ciclos de dextrano sulfato de sódio (DSS) a 2,5% na água potável. Cada ciclo durava 1 semana e era separado por um período de recuperação de 2 semanas com água potável regularmente. Durante a última semana do protocolo experimental, camundongos dos grupos modelo e de tratamento receberam fator alfa de necrose tumoral (TNF-α; 10 μg/100 g de peso corporal, duas vezes ao dia) por gavage intragástrico, para agravar ainda mais a lesão do cólon. Os camundongos controle normais receberam apenas veículos e não foram expostos ao DSS ou TNF-α.

Cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens foram usadas como um medicamento patenteado comercial e aprovado na China. A formulação continha Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., e Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. O conteúdo das cápsulas do mesmo lote de produção era pesado e suspenso em água destilada estéril para preparar novas suspensões de dosagem antes da administração. As suspensões eram cuidadosamente misturadas antes de cada gavage para garantir uma dispersão uniforme. Fonte do produto, número de aprovação, especificações farmacêuticas e informações de controle de qualidade são fornecidas na Tabela de Materiais. A qualidade do produto foi descrita de acordo com a especificação farmacêutica aprovada e as informações fornecidas pelo fabricante, incluindo especificações da cápsula, aparência, requisitos de liberação e desintegração entérica, requisitos de limite microbiano e padrões de controle de qualidade.

Camundongos tratados com FSC receberam FSEC de baixa dose (108 mg/kg de peso corporal), FSEC de dose média (216 mg/kg de peso corporal) ou FSEC de alta dose (432 mg/kg de peso corporal) por gavage intragástrico duas vezes ao dia durante a última semana de modelagem. Os níveis de dose foram selecionados com base na dose clínica aprovada, na conversão da área de superfície corporal e nas considerações preliminares de variação de dose. Ratos tratados com veículo receberam o mesmo volume de água destilada estéril por gavage intragástrico.

O grupo controle positivo recebeu o antagonista TLR4 CRX-526 a 1 mg/kg por injeção na veia caudal durante a última semana de modelagem. O CRX-526 foi usado como intervenção anti-inflamatória de referência. O estudo incluiu seis grupos (n = 6 por grupo): grupo controle normal, modelo, FSC de baixa dose, FSC de dose média, FSC de dose alta e CRX-526 grupo controle positivo. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após o último tratamento do estudo. A eutanásia foi realizada por luxação cervical sob anestesia isoflurana, de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.

2. Avaliação histológica por coloração de hematoxilina e eosina

Os tecidos do cólon foram coletados da região macroscópicamente mais afetada entre o ânus e a área ileocecal. Para cada camundongo, um segmento representativo do cólon dessa região foi fixado em formalina tamponada neutra a 10%, embutido em parafina, seccionado e corado com hematoxilina e eosina. Para avaliação histológica, pelo menos três seções foram preparadas de cada animal, e cinco campos de alta potência não sobrepostos foram examinados por seção. Os campos eram selecionados sistematicamente e aleatoriamente, escaneando a seção de uma borda à outra, evitando áreas rasgadas, dobradas ou mal manchadas. Alterações histopatológicas, incluindo ulceração mucosa, destruição glandular, congestão e infiltração de células inflamatórias, foram avaliadas por microscopia óptica.

3. Medição de indicadores bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo

Amostras de sangue (0,5 mL) foram coletadas em tubos contendo anticoagulantes e centrifugadas a aproximadamente 1160 × g por 10 minutos a 4 °C. O supernadante foi coletado e usado para medir os níveis de ferro sérico, superóxido dismutase (SOD), glutationa (GSH), catalase (CAT) e mieloperoxidase (MPO) usando os kits de ensaio correspondentes listados na Tabela de Materiais conforme as instruções do fabricante.

4. Análise imunohistoquímica de JAK2 e STAT3

Seções de tecido do cólon embutidas em parafina (5 μm) foram desparafinizadas em xileno, reidratadas por uma série graduada de etanol e enxaguadas com soro salino tamponado com fosfato. A coleta de antígeno foi realizada em tampão de citrato (pH 6,0) usando aquecimento por micro-ondas. Após resfriar até a temperatura ambiente, a atividade endógena da peroxidase foi bloqueada com 3% de H₂O₂ por 10 minutos. As seções foram bloqueadas com soro normal de cabra a 5% por 30 minutos em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra JAK2 e STAT3 em diluições de 1:50 e 1:80, respectivamente. Após lavagens salinas tamponadas com fosfato, as seções foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte, conforme as instruções do fabricante. Sinais imunorreativos foram visualizados usando 3,3′-diaminobenzidina, e núcleos foram contra-coloridos com hematoxilina. As seções foram desidratadas, montadas e examinadas sob um microscópio óptico.

5. Quantificação de citocinas por ensaio imunossorvente ligado a enzimas

Os tecidos do cólon foram cortados em pedaços de 2–^{3 mm,} homogeneizados em gelo em soro tamponado com fosfato e centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi coletado, e as concentrações de TNF-α, IL-1α e IL-13 foram medidas usando os kits ELISA correspondentes, conforme as instruções do fabricante. Os valores de absorvância foram medidos usando um leitor de microplacas, e as concentrações de citocinas foram calculadas a partir de curvas padrão geradas para cada ensaio.

6. Análise Western blot de proteínas relacionadas à ferroptose

Proteínas totais foram extraídas dos tecidos do cólon, e as concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio de ácido bicinconínico. Quantidades iguais de proteína de cada amostra foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas. Após o bloqueio com leite desnatado a 5% ou um tampão de bloqueio equivalente por 2 horas em temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra GPX4, FTH1, ACSL4 e a proteína de controle de carga β-actina, conforme listado na Tabela de Materiais. No dia seguinte, as membranas foram lavadas e incubadas com o correspondente anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano forte por 2 horas em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando um substrato quimioluminescente e imagens usando um sistema de imagem quimioluminescente. As intensidades das bandas foram quantificadas usando software de densitometria. Os níveis de expressão de GPX4, FTH1 e ACSL4 foram normalizados para β-actina, e a expressão relativa da proteína foi calculada para análise estatística.

7. Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância, seguidas pelo teste post hoc de Bonferroni, quando as suposições de normalidade e homogeneidade da variância foram atendidas. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O FSEC alivia lesões histopatológicas e melhora os índices relacionados ao estresse oxidativo em camundongos com colite ulcerativa
Como mostrado na Figura 2, o grupo controle normal apresentou arquitetura mucosa do cólon intacta, com glândulas bem organizadas e infiltração mínima de células inflamatórias. Em contraste, o grupo modelo apresentou lesão mucosa grave caracterizada por perturbação epitelial, ulceração mucosa, destruição glandu...

Discussão

Este estudo investigou os efeitos das cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens em um modelo murino de colite ulcerativa experimental () e avaliou as alterações associadas nos índices relacionados ao estresse oxidativo, citocinas inflamatórias, sinalização JAK2/STAT3 e marcadores relacionados à ferroptose. Os principais achados foram que o tratamento com FSEC aliviou a lesão histopatológica do cólon, melhorou os índices bioquímicos relacionados a antioxida...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Chromogen substrate para imunohistoquímica baseada em HRP.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Anticorpo primário monoclonal de camundongo para western blot; usado em 1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Buffer de recuperação de epítopo induzido por calor para imunohistoquímica de seção de parafina.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	Quantificação de proteínas antes do western blotting.
C57BL/6J mice	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Camundongos SPF machos, 8 semanas de idade; fonte animal consistente com os materiais de aprovação ética submetidos.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Kit colorimétrico para medição da atividade do CAT no soro.
ChemiDoc XRS+ imaging system	Bio-Rad Laboratories	1708265	Sistema de imagem de quimiluminescência para detecção de western blot.
CRX-526	TargetMol	T27090	Antagonista TLR4 usado como intervenção de controle positivo; CAS no. 245515-64-4.
Dextran sulfate sodium salt (DSS), colitis grade	MP Biomedicals	160110	DSS, grau de colite, peso molecular de 36.000–50.000 Da; usado em 2,5% na água potável.
ECL chemiluminescent substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	Substrato ECL de clareza Western para detecção de sinal de western blot baseado em HRP.
ELISA kit, mouse IL-13	Abcam	ab219634	Kit ELISA colorimétrico sanduíche para quantificação de IL-13 em camundongos; leitura em 450 nm.
ELISA kit, mouse IL-1α	Abcam	ab199076	Kit ELISA colorimétrico sanduíche para quantificação de IL-1α em camundongos; leitura em 450 nm.
ELISA kit, mouse TNF-α	Abcam	ab208348	Kit ELISA colorimétrico sanduíche para quantificação de TNF-α em camundongos; leitura em 450 nm.
Ethanol, absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Usado para processamento de tecido, desidratação e preparação de reagentes.
Ferrous iron (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Kit colorimétrico para medição de Fe2+ em amostras de soro ou tecido.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA approval no. Z20150002	Medicina patente chinesa; 0,4 g/cápsula; formulação inclui Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., e Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; especificação farmacêutica YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Kit de ensaio de glutationa reduzida para medição de GSH no soro.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Anticorpo primário monoclonal de camundongo para western blot; usado em 1:500; RRID: não listado na folha de dados do fornecedor.
Hematoxylin and eosin staining kit	Solarbio	G1120	Corante H&E de seções de tecido de cólon embutido em parafina.
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Anticorpo secundário para western blot; usado em 1:50.000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Version 1.54	Software de análise de imagem e densitometria usado para quantificação de bandas de western blot.
Immunohistochemistry detection kit	ZSGB-BIO	PV-9000	Kit de detecção HRP baseado em polímero para imunohistoquímica de seção de parafina.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Anticorpo primário monoclonal de coelho para imunohistoquímica de JAK2 em seções de parafina; RRID: AB_2128522.
Microplate reader	BioTek Instruments	Synergy H1	Leitor de placa para medição de absorvância ELISA em 450 nm.
Myeloperoxidase (MPO) activity assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Kit colorimétrico para medição da atividade do MPO no soro.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fixação do tecido do cólon antes da incorporação em parafina.
Normal goat serum	Solarbio	SL038	Reagente de bloqueio para imunohistoquímica.
Paraffin	Leica Biosystems	39601006	Meio de incorporação para processamento de tecido do cólon.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio	P1020	Buffer para procedimentos de homogeneização de tecido, lavagem e imunomarcação.
PVDF membrane	MilliporeSigma	IPVH00010	Membrana de transferência de proteínas para western blotting.
Recombinant mouse TNF-α protein	R&D Systems	410-MT	TNF-α recombinante de camundongo usado para o desafio inflamatório da semana final.
SDS-PAGE and transfer system	Bio-Rad Laboratories	1658004	Sistema Mini-PROTEAN Tetra para workflow de SDS-PAGE e transferência de western blot.
SPSS Statistics software	IBM	Version 24.0	Software de análise estatística para ANOVA de uma via e testes pós-hoc de Bonferroni.
STAT3 antibody (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Anticorpo primário monoclonal de camundongo para imunohistoquímica de STAT3; RRID: AB_331757.
Superoxide dismutase (SOD) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	Kit do método WST-1 para medição da atividade do SOD no soro.
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418	Reagente de desparafinização para processamento de seções em parafina.
β-actin antibody (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Anti