Um protocolo padronizado de metabolômica para analisar mudanças metabólicas induzidas por exercícios em boxeadores de elite por cromatografia líquida-espectrometria de massas

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado de metabolômica sérica baseado em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem de tempo de voo quadrupolar (LC-QTOF-MS/MS) e análise de dados multivariados para perfilar mudanças metabólicas agudas e de curto prazo relacionadas à recuperação em boxeadores masculinos de elite.

Resumo

O boxe de elite induz mudanças metabólicas rápidas que não são totalmente capturadas pelas medições fisiológicas convencionais. Um fluxo de trabalho padronizado de metabolômica sérica não direcionada, baseado em cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem de tempo de voo quadrupolar (LC-QTOF-MS/MS), foi aplicado a amostras coletadas antes do sparring, imediatamente após o sparring e 24 horas após o sparring em sete boxeadores masculinos de elite. O fluxo de trabalho incluiu coleta padronizada de amostras, monitoramento de controle de qualidade agrupado, perfil de metabólitos, análise estatística multivariada e interpretação de vias. O sparring agudo esteve associado a alterações nos metabólitos relacionadas à glicólise e à gliconeogênese, enquanto o ponto de tempo de 24 horas esteve associado ao metabolismo do enxofre.

O fosfatidilinositol PI (16:0/18:2(9Z,12Z)) mostrou forte discriminação do estado imediato pós-sparring, e o tiosulfato esteve associado ao estado de recuperação de 24 horas. Esses achados apoiam o uso desse fluxo de trabalho para perfilamento reprodutível de alterações metabólicas relacionadas ao exercício nesta coorte de sete boxeadores masculinos de elite. O protocolo é destinado a estudos controlados em pequenas coortes de exercício agudo e recuperação de curto prazo, e enfatiza o manuseio reprodutível de amostras, monitoramento de controle de qualidade agrupado e análise interpretável a jusante.

Introdução

O boxe de elite, caracterizado por três rounds de 2 minutos de sparring de alta intensidade, depende de uma combinação de metabolismo anaeróbico e aeróbico e desencadeia rápidas mudanças nos substratos energéticos, mediadores de estresse oxidativo e metabólitos relacionados à reparação tecidual. Avaliações tradicionais (lactato sanguíneo e frequência cardíaca) capturam apenas desfechos fisiológicos isolados, falhando em resolver as mudanças metabólicas sistêmicas e interconectadas que abrangem "o estresse agudo pré-sparring → pós-sparring → recuperação a cada 24 horas."

A metabolômica não direcionada, viabilizada pela cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem de tempo de voo dos quadrupolos, aborda essa limitação ao perfilar de forma abrangente metabólitos de pequenas moléculas em amostras biológicas. Ele normalmente detecta milhares de picos metabólicos e anota centenas a milhares de metabólitos por meio da integração com bancos de dados^{curados 1,2,3}. Essa abordagem pode revelar dinâmicas metabólicas nuançadas que métodos tradicionais deixam passar, mas estudos metabolômicos existentes focados no boxe carecem de padronização: frequentemente omitem protocolos controlados de sparring, etapas rigorosas de controle de qualidade (QC) ou prazos de recuperação de longo prazo, levando a resultados irreproduzíveis e tradução limitada para estratégias de treinamento ou^{recuperação 4,5}.

Um fluxo de trabalho metabolômico padronizado baseado em cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem de tempo de voo e otimizado para boxeadores de elite é apresentado para capturar tanto respostas agudas ao exercício quanto recuperação retardada. O protocolo inclui três pontos-chave de tempo (pré-sparring [T0], imediatamente pós-sparring [T1], 24 horas pós-sparring [T2]) para distinguir o estresse transitório da adaptação ^{sustentada 6,7,8}. Características técnicas críticas incluem: (1) sparring controlado (80–85% da frequência cardíaca máxima) para garantir uma intensidade consistente do^{exercício 7,9}; (2) LC-QTOF de alta resolução para detecção sensível de metabólitos séricos^{de baixa abundância 2,3,10}; (3) análises multivariadas e univariadas, incluindo análise de componentes principais (PCA), análise ortogonal parcial de mínimos quadrados por discriminante (OPLS-DA) e testes estatísticos em pares, para identificar metabólitos responsivos ao^{exercício 6,8,11}; e (4) uma única amostra de QC sérica em pool (mistura em volume igual das amostras do estudo) com múltiplas injeções para avaliar a estabilidade do instrumento contra a deriva do sinal¹².

Esse protocolo pode ser adaptável a outros esportes de alta intensidade e curta duração (por exemplo, corrida de velocidade e luta livre), mas essa transferibilidade requer validação em coortes específicas de cada esporte. No presente estudo, o fluxo de trabalho fornece uma estrutura preliminar para identificar marcadores metabólicos de estresse e recuperação em boxeadores masculinos de elite. Esse fluxo de trabalho é mais adequado para estudos controlados de exercício agudo e recuperação de curto prazo em pequenas coortes atléticas bem caracterizadas, utilizando metabolômica não direcionada à base de soro. Pode ser menos adequado para extrapolação direta para outros esportes, atletas femininas, populações maiores e heterogêneas ou estudos de adaptação de longo prazo sem validação adicional.

O estudo teve como objetivo caracterizar as alterações metabólicas séricas induzidas pelo combate de boxe de elite e distinguir respostas agudas pós-sparring de mudanças relacionadas à recuperação em 24 horas. Foi hipotetizado que o sparring agudo afetaria predominantemente o metabolismo energético, enquanto a recuperação a cada 24 horas estaria associada a metabólitos ligados ao equilíbrio redox e à reparação tecidicular. O fluxo de trabalho geral é mostrado na Figura 1.

Protocolo

Realizar todos os procedimentos de acordo com aprovação do Comitê Institucional de Ética para Pesquisa Humana da Universidade de Educação Física e Esportes do Capital (aprovação nº 2025A005).

ATENÇÃO: Trate todas as amostras de sangue humano como potencialmente infecciosas. Use luvas, jaleco e proteção para os olhos. Realizar coleta venosa de sangue, manuseio do soro e descarte de resíduos de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança. Descontamine as superfícies de trabalho após o manuseio da amostra.

ATENÇÃO: Metanol, acetonitrila e ácido fórmico são produtos químicos perigosos. Realize as etapas de preparação, extração e reconstituição do solvente em uma exaustão química certificada. Evite contato com a pele e a inalação. Colete resíduos de solvente em recipientes aprovados.

1. Recrutamento e preparação de participantes para o estudo

1. Recrute sete boxeadores masculinos de elite entre 20 e 28 anos e competem nas categorias de peso 60–75 kg.
2. Confirme que cada participante tem pelo menos 5 anos de experiência profissional em treinamento e nenhum histórico de doenças metabólicas.
3. Exclua participantes com lesão musculoesquelética nos últimos 6 meses.
4. Instrua os participantes a seguirem uma dieta padronizada contendo 55% de carboidratos, 25% de proteína e 20% de gordura por 3 dias antes do teste.
5. Instrua os participantes a evitarem exercícios intensos em ou acima de 60% da frequência cardíaca máxima por 48 horas antes do teste.
6. Instrua os participantes a jejuarem por 12 horas antes da coleta de sangue. Permita a ingestão de água durante o período de jejum.
7. Determine a frequência cardíaca máxima por meio de testes de exercício graduados 1 semana antes do sparring.
8. Aumente a velocidade da esteira em 1 km/h a cada 3 minutos até o cansaço. Use a frequência cardíaca máxima medida para definir a intensidade-alvo do sparring.

2. Protocolo de sparring e coleta de amostras de soro

1. Prepare um ringue de boxe padrão de 6 × 6 m, luvas de 16 oz e um monitor de frequência cardíaca com faixa peitoral.
2. Realize um aquecimento padronizado de 10 minutos, consistindo em 5 minutos de corrida a 8 km/h, 3 minutos de alongamento dinâmico e 2 minutos de shadowboxing.
3. Execute o protocolo de sparring da seguinte forma.
   1. Realize três rounds de sparring de 2 minutos cada.
   2. Enfrente os adversários por categoria de peso e nível técnico.
   3. Permita um intervalo de descanso de 1 minuto entre as rodadas.
   4. Monitore a frequência cardíaca a cada 30 segundos durante a sessão.
   5. Ajuste a intensidade do sparring para manter a frequência cardíaca entre 80% e 85% da saúde mental.
   6. Pare o sparring se a frequência cardíaca exceder 90% da saúde mental. Retome o sparring somente depois que a frequência cardíaca voltar ao alvo.
4. Colete amostras de soro em três pontos de tempo, conforme segue.
   1. Colete 5 mL de sangue venoso da veia antecubital 30 minutos após o aquecimento para T0 usando um tubo de separação sérica (SST) de 8 mL.
   2. Colete 5 mL de sangue venoso em até 5 minutos após a rodada final para T1 usando um novo SST.
   3. Colete 5 mL de sangue venoso no mesmo horário do dia que T0 para T2 usando um novo SST. Certifique-se de que os participantes sigam as mesmas restrições de jejum e atividade usadas para o T0.
5. Processe as amostras de sangue da seguinte forma.
   1. Centrifuge cada SST a 11000 × g por 15 minutos a 4 °C dentro de 1 hora após a coleta.
   2. Transfira 2–3 mL da camada superior do soro para 1,5 mL de crioviais.
   3. Armazene os cryovials imediatamente a -80 °C.
   4. Limite cada amostra a no máximo dois ciclos de congelamento-descongelamento.
6. Prepare uma amostra de controle de qualidade em pool.
   1. Descongele todas as 21 amostras de soro estudado (T0, T1 e T2 de sete participantes) no gelo antes da preparação de QC em pool.
   2. Transfira uma alíquota igual de cada amostra do estudo para um tubo de 1,5 mL.
   3. Transfira 20 μL de cada amostra para obter um volume final de QC agrupado de 420 μL.
   4. Vortex a amostra de controle de qualidade agrupada por 10 s.
   5. Use a amostra de QC agrupada para injeções repetidas durante a análise LC-QTOF-MS para monitorar a estabilidade instrumental e a deriva do sinal.

3. Extração de metabólitos de amostras de soro

1. Remova amostras de soro congelado (T0, T1, T2 e QC) de -80 °C. Descongele as amostras no gelo por 30 minutos e faça vórtice em cada amostra por 10 segundos.
2. Pipete 100 μL de soro em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas. Adicione 500 μL de solvente de extração gelado composto por metanol:acetonitrilo (1:1, v/v). Vórtice por 30 segundos.
   1. Não adicione um padrão interno durante a extração. Não aplique correção de extração baseada em padrão interno ou normalização a jusante no fluxo de trabalho finalizado.
3. Sonice o tubo em banho de água gelada a 4 °C por 10 minutos a 300 W e 40 kHz. Incube o tubo a -20 °C por 1 hora para precipitar a proteína.
4. Centrifuge o tubo a 13200 × g. por 20 minutos a 4 °C. Transfira aproximadamente 450 μL de sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e descarte o pellet como resíduo biológico perigoso.
5. Seque o sobrenadante em um concentrador a vácuo a 37 °C e -0,09 MPa por 45 minutos ou até que a secura completa seja alcançada.
6. Reconstitua o extrato seco em 100 μL de acetonitril:água (1:1, v/v). Vórtice por 30 segundos.
   Nota: Acetonitrila:água (1:1, v/v) foi usado porque era compatível com a coluna de cromatografia de fase reversa usada nesse fluxo de trabalho e não produziu precipitação visível nos testes preliminares.
7. Centrifuge a solução reconstituída a 13200 × g . por 15 minutos a 4 °C. Transfira aproximadamente 90 μL de sobrenadante para um frasco de vidro LC-MS equipado com um inserto de 200 μL e sele o frasco.

4. Cromatografia líquida-detecção por espectrometria de massa

1. Instale uma coluna de cromatografia em fase reversa adequada para metabolômica sérica (veja Tabela de Materiais) no sistema de cromatografia líquida. Ajuste o forno de coluna para 40 °C.
2. Prepare a fase móvel A como ácido fórmico de 0,1% (v/v) em água ultrapura. Prepare a fase móvel B como ácido fórmico a 0,1% (v/v) em acetonitrila.
3. Filtre ambas as fases móveis através de uma membrana de 0,22 μm.
4. Ajuste a vazão para 400 μL/min e o volume de injeção para 5 μL.
5. Aplique o seguinte gradiente: 0,0–0,5 min, 95% A e 5% B; 0,5–5,5 min, gradiente linear para 50% A e 50% B; 5,5–9,0 min, gradiente linear para 5% A e 95% B; 9,0–10,5 min, 5% A e 95% B; 10,5–12,0 min, retorne a 95% A e 5% B e reequilibre
6. Acople o sistema de cromatografia líquida a um espectrômetro de massa de alta resolução equipado com uma fonte de ionização por eletrospray.
7. Adquira dados em modos de íons positivos e negativos em execuções separadas.
8. No modo íon positivo, ajuste a tensão capilar para 2500 V e a tensão do cone para 30 V.
9. No modo de íons negativos, ajuste a tensão capilar para -2000 V e a tensão do cone para 25 V.
10. Ajuste a temperatura do gás de desolvação para 500 °C, o fluxo de gás de desolvação para 800 L/h e o fluxo de gás cone para 50 L/h.
11. Adquira dados acima de m/z 50–1200 com tempo de varredura de 0,2 s.
12. Adquira dados de espectrometria de massa tandem usando baixa energia de colisão a 0 V e alta energia de colisão a 10–40 V.
13. Analise as amostras na seguinte ordem: Uma injeção em branco de solvente de reconstituição; Três injeções consecutivas da amostra de QC agrupada; Todas as amostras do estudo com uma injeção de blank e uma injeção de QC a cada cinco amostras do estudo; Uma última injeção de controle de qualidade; e Uma última injeção de festim
14. Avalie a qualidade dos dados e a estabilidade analítica em ambos os modos iônicos por meio de análise de correlação de QC agrupada e agrupamento de análise de componentes principais (PCA).
15. Interprete coeficientes de correlação de QC agrupados maiores que 0,8 como indicando estabilidade analítica aceitável ao longo da sequência analítica.

5. Pré-processamento de dados e análise estatística

1. Importar arquivos brutos de cromatografia líquida-espectrometria de massa para softwares de processamento de dados para alinhamento de tempo de retenção, deconvolução, alinhamento de picos e extração de características (veja Tabela de Materiais).
   1. Selecione a primeira injeção de QC em pool como referência de alinhamento.
   2. Realize alinhamento de tempo de retenção, desconvolução e alinhamento de picos usando o fluxo de trabalho padrão do software selecionado. Use uma tolerância de tempo de retenção de ± 0,1 min e uma tolerância de massa de ± 5 ppm.
   3. Realize picos de detonação e mantenha características com intensidade maior que 1000 contagens presentes em pelo menos 80% das amostras de pelo menos um grupo.
   4. Não aplique normalização adicional pós-pré-processamento em nenhum dos modos iônicos.
   5. Exporte a tabela de características processadas contendo m/z, tempo de retenção e valores de área de pico.
   6. Transformadas Log2 mantiveram todas as intensidades máximas.
   7. Impute valores ausentes com um quinto do valor positivo mínimo para cada característica.
   8. Centralize cada característica e divida por seu desvio padrão antes da análise multivariada.
   9. Use a matriz transformada e escalonada para análise de componentes principais (PCA), análise parcial de mínimos quadrados por discriminante (PLS-DA), análise ortogonal parcial de mínimos quadrados por discriminante (OPLS-DA), agrupamento e análise de correlação. Use as intensidades de características processadas originais para os gráficos de abundância.
2. Anote metabólitos comparando recursos com bancos de dados públicos de metabolômica, incluindo o Human Metabolome Database (HMDB), a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e LIPID MAPS quando aplicável.
   1. Pontuar cada anotação pelo erro de massa do íon precursor, distribuição de isótopos e correspondência de fragmentos em espectrometria de massa tandem. Atribua um máximo de 20 pontos a cada critério.
   2. Aplique uma janela de erro de massa de íons precursores de 100 ppm e uma janela de erro de massa íon de fragmento de 50 ppm. Não aplique uma janela fixa de tempo de retenção.
   3. Mantenha anotações com uma pontuação total de pelo menos 40 de 60. Exclua anotações de pontuação mais baixa.
3. Defina explicitamente os grupos de comparação da seguinte forma: A = T0 (antes do sparring), B = T1 (imediatamente após o sparring) e C = T2 (24 h após o sparring).
4. Realizar análises estatísticas a jusante usando softwares de computação estatística e pacotes de análise associados (veja Tabela de Materiais).
   1. Execute a análise de componentes principais (PCA) após a escala de variância unitária e visualize os gráficos de pontuação.
   2. Construa modelos de análise parcial de mínimos quadrados discriminantes (PLS-DA) e análise ortogonal de mínimos quadrados parciais discriminante (OPLS-DA) para A versus B, B versus C e A versus C.
   3. Use a validação cruzada 7 vezes quando o número da amostra for pelo menos 7. Se o número de amostras for menor que 7, defina o número de dobras igual ao número de amostras.
   4. Realize 200 testes de permutação para avaliar a validade do modelo.
   5. Analise metabólitos diferenciais aplicando os seguintes limiares: mudança de dobra (FC) ≥ 2 ou FC ≤ 0,5, importância variável na projeção (VIP) ≥ 1, e teste t P. < 0,05.
   6. Gerar gráficos de vulcões e gráficos estatísticos relacionados para comparações par a par.
   7. Gerar mapas de calor usando a matriz transformada em log2 e escalada por variância unitária.
   8. Gere mapas de calor de correlação com um limiar de significância de P ≤ 0,05 e exiba até 20 metabólitos.
   9. Determine o número ótimo de clusters antes do agrupamento k-means. Realize clustering k-means após a escalonação de variância unitária.
   10. Gerar gráficos de barras de abundância a partir das intensidades de características processadas originais.
   11. Gerar diagramas de Venn para resumir a sobreposição entre comparações par a par.
   12. Realizar análise de características operacionais do receptor (ROC) para metabólitos selecionados. Avalie o desempenho diagnóstico pela área sob a curva (AUC).
5. Mapeie metabólitos diferenciais para as vias KEGG usando uma função de enriquecimento de vias em um pacote de bioinformática apropriado (veja Tabela de Materiais).
   1. Interprete caminhos com P. < 0,05. Nenhuma correção de múltiplos testes foi reportada no registro final de análise.

Resultados

Validação de Controle de Qualidade (QC) de Dados LC-QTOF-MS/MS

Para avaliar a estabilidade e reprodutibilidade do sinal, injeções repetidas da amostra de QC agrupada foram analisadas em ambos os modos iônicos. Os coeficientes de correlação de Spearman entre injeções de QC agrupadas excederam 0,8 em ambos os modos iônicos, o que indicou desempenho estável do instrumento em toda a sequência analítica. A PCA de todas as amostras do estudo e injeç...

Discussão

Esse fluxo de trabalho padronizado caracterizou as alterações de metabólitos associadas ao combate de boxe de elite e à recuperação de curto prazo em uma coorte pequena e controlada. As injeções de QC agrupadas, a análise de correlação baseada em QC, o agrupamento PCA e as análises multivariadas juntas sustentaram uma estabilidade analítica aceitável. O sucesso do protocolo dependia principalmente de quatro fatores: manter a intensidade do sparring dentro de 80%–85% da frequência cardíac...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes	Acetonitrila	Merck	Grau LC-MS, CAS 75-05-8
Reagentes	Metanol	Merck	Grau LC-MS, CAS 67-56-1
Reagentes	Ácido fórmico	TCI	Grau LC-MS, CAS 64-18-6
Consumíveis	TUBO VACÚA CAT Ativador de Coágulos Sérum	Greiner Bio-One	8 mL de tubo ativador de coágulos séricos
Consumíveis	Frasco criogênico de Nalgene	Thermo Fisher Scientific	1,5 mL, rosca externa
Consumíveis	Tubo de Ligação de Proteína	Eppendorf	Gato. Nº 0030108442, 1,5 mL
Vidraria	Frasco de vidro com tampa roscada e inserto	Agilent	Frasco de 2 mL com 200 e mu; Inserção de vidro em L; Insira Cat. Nº 5183-2090
Consumíveis	Filtro Millex-GP	Merck	Gato. Não. SLGP033RS, 0,22 & mu; Membrana m
Instrumentos	Ringue de Boxe Personalizado 6x6 m	Muay Thai Esporte	6 e vezes; Anel de treinamento de 6 m
Consumíveis	Luvas de Boxe Estilo Profissional 2	Everlast	16 oz
Instrumentos	Polar H10	Polar	Sensor de frequência cardíaca com faixa torácica
Instrumentos	Quasar	h/p/cosmos	Esteira motorizada
Instrumentos	Centrífuga 5425 R	Eppendorf	Microcentrífuga refrigerada
Instrumentos	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	Banho ultrassônico digital de 40 kHz
Instrumentos	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Concentrador de vácuo integrado
Instrumentos	Misturador Mini Vórtice VWR	Avantor / VWR	Gato. Nº 10153-688
Instrumentos	TSX ULT Freezer	Thermo Fisher Scientific	Modelo TSX50086A
Instrumentos	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Águas	Sistema UHPLC
Instrumentos	Xevo G2-XS QTof	Águas	Espectrômetro de massa QTOF
Instrumentos	Coluna T3 ACQUITY UPLC HSS	Águas	P/N 176001132, 1,8 & mu; m, 2.1 e vezes; 100 mm
Software	MassLynx	Águas	Versão 4.2
Software	Progenesis QI	Águas	Versão 2.3
Software	R	Fundação R para Computação Estatística	Versão 3.6.1
Software	PRCOMP	R base	Função base R
Software	ROPLS	Biocondutor	Pacote R
Software	pheatmap	CRAN	Pacote R
Software	Corrplot	CRAN	Pacote R
Software	kmeans	R base	Função base R
Software	NbClust	CRAN	Pacote R
Software	venn	CRAN	Pacote R
Software	MetaboAnalystR	CRAN / Laboratório Xia	Versão 1.0
Software	pROC	CRAN	Versão 1.15.0
Software	clusterProfiler	Biocondutor	Pacote Bioconductor
Bancos de dados	Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB)	HMDB	Banco de dados online
Bancos de dados	Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)	KEGG	Banco de dados online
Bancos de dados	MAPAS LIPÍDICOS	MAPAS LIPÍDICOS	Banco de dados online