Síntese verde de nanopartículas de ouro e prata usando extratos vegetais, filtrados fúngicos e culturas bacterianas

Resumo

Este protocolo descreve métodos reprodutíveis de síntese verde para fabricar nanopartículas de ouro e prata usando extratos de plantas, filtrados fúngicos e culturas bacterianas, seguidos por confirmação de nanopartículas por espectroscopia ultravioleta–visível e microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

A síntese verde de nanopartículas metálicas (NPs) usando sistemas biológicos oferece uma alternativa sustentável aos métodos convencionais de fabricação química. Este protocolo apresenta procedimentos experimentais e analíticos reprodutíveis para a síntese de NPs de ouro (Au) e prata (Ag) utilizando culturas bacterianas, filtrados fúngicos e extratos de folhas vegetais como agentes redutores e estabilizadores. AgNPs foram sintetizados usando extratos de Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicefera e Earliella sp., exibindo bandas características de absorção ultravioleta–visível (UV–Vis) entre 405 e 425 nm que confirmaram a formação de NP. Foi implementada uma abordagem de desenho de experimentos para avaliar a influência de fatores ambientais, incluindo condições de oxigênio, pH, concentração de Aau, concentração celular, tipo de doador de elétrons e temperatura, na síntese de AuNPs por Shewanella oneidensis e Cupriavidus metallidurans. Em condições ideais (0,2 mM Au e pH 5), S. oneidensis produziu predominantemente AuNPs esféricos com tamanho médio de 43,6 ± 11,0 nm e pico característico de absorção em 520 nm. A formação e morfologia NP foram confirmadas usando espectroscopia UV–Vis e microscopia eletrônica de transmissão. Esse fluxo de trabalho fornece uma plataforma reprodutível para a síntese de NP biogênico e apoia aplicações em biosensação, biorremediação e tecnologias antimicrobianas.

Introdução

Nanopartículas metálicas (NPs) possuem propriedades fisicoquímicas únicas associadas à sua alta área superficial, incluindo comportamentos eletrônicos, magnéticos e catalíticos distintos, além de alta reatividade. Essas características promoveram sua aplicação em múltiplos campos, incluindo medicina para diagnóstico de doenças e administração^{de medicamentos} 1,2,3,4,5,6, cosméticos para formulações de protetor^{solar 7}, eletrônica para transistores e células^{solares 8}, engenharia ambiental para tratamento^{de água 2,9,10}, e agricultura para fertilizantes e^{pesticidas 11,12}. A expansão contínua das aplicações de NP em diversas disciplinas reflete-se no número crescente de publicações relacionadas relatadas nos últimos^{anos 13,14}.

Métodos sintéticos para NPs metálicos permitem um controle preciso sobre características importantes como tamanho das partículas, morfologia e estabilidade, tornando o processo de síntese um determinante crítico do desempenho da NP. Os métodos convencionais de síntese química foram amplamente otimizados; no entanto, frequentemente envolvem reagentes tóxicos, alto consumo de energia e custos de produção^{elevados 14,15}. Essas limitações motivaram o desenvolvimento de alternativas mais verdes e sustentáveis. Abordagens de síntese verde empregam sistemas biológicos como extratos de plantas ^16,17, microrganismos incluindo fungos e^{bactérias 18}, e^{algas 19} como agentes naturais redutores e estabilizadores. Durante esses processos, os sais metálicos são reduzidos a formas zero-valentes, gerando NPs por meio de caminhos ambientalmente corretos e econômicos. Além disso, NPs biologicamente sintetizados são frequentemente biocompatíveis, facilitando seu uso em aplicações médicas, agrícolas e^{ambientais 8,14}.

A escolha de uma rota biológica adequada para a síntese de NP depende da aplicação pretendida, bem como da infraestrutura e dos requisitos operacionais disponíveis. A síntese à base de plantas é geralmente preferida para produção rápida e de baixo custo de NP porque requer manuseio estéril mínimo; no entanto, a variabilidade na composição dos extratos pode afetar a reprodutibilidade^20,21. A síntese mediada por fungos pode fornecer altos rendimentos de NP e enzimas extracelulares que melhoram a estabilização do NP e o processamento a jusante, embora essa abordagem exija períodos de cultivo mais longos e condições de crescimento^{controladas 22}. Em contraste, sistemas bacterianos permitem síntese ajustável sob condições metabólicas definidas e produção rápida de biomassa, tornando-os adequados para estudos mecanicistas e aplicações associadas^{ao NP 22}. No entanto, a síntese bacteriana frequentemente requer manuseio asséptico rigoroso, condições controladas de biorreator e processamento adicional a jusante quando os NPs intracelulares são^{recuperados 21,22}.

Apesar das vantagens mencionadas, os métodos de síntese verde continuam enfrentando desafios associados à reprodutibilidade e padronização. Além disso, protocolos visuais detalhados passo a passo para a síntese verde de NPs metálicos permanecem^{limitados a 23}, restringindo a capacidade dos pesquisadores de reproduzir e implementar metodologias existentes com sucesso. O objetivo deste trabalho é apresentar protocolos reprodutíveis de síntese verde para NPs de ouro (Au) e prata (Ag) usando extratos de plantas, filtrados fúngicos e culturas bacterianas. Especificamente, extratos aquosos de Psidium guayaquilensis e Acanthophora spicefera, filtrados fúngicos extracelulares de Earliella sp. e sistemas bacterianos envolvendo Shewanella oneidensis e Cupriavidus metallidurans foram empregados para a síntese de NP. Os protocolos apresentados enfatizam etapas críticas na preparação de extratos biológicos, síntese de NP e caracterização preliminar de NPs. Além disso, o fluxo de trabalho integra o design de experimentos, procedimentos padronizados de preparação e caracterização em linha para apoiar a síntese de NP biogênico reprodutível e otimizável.

Protocolo

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais da Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Equador). A biomassa vegetal, algal e fúngica utilizada neste estudo foi coletada em ambientes acessíveis e não envolveu espécies protegidas ou áreas restritas. De acordo com regulamentos institucionais e nacionais, não eram necessárias permissões específicas para a coleta de biomassa disponível livremente nessas condições. Consulte a Figura 1 para o fluxo de trabalho experimental integrado utilizado para a síntese verde de AgNPs e AuNPs utilizando sistemas biológicos de plantas, algas, fungos e bactérias.

Figura 1: Fluxo de trabalho integrado para síntese verde de nanopartículas (NPs) de prata (Ag) e ouro (Au) usando sistemas biológicos. Esquema do fluxo de trabalho experimental para a síntese verde de AgNPs e AuNPs usando sistemas de plantas, algas, fungos e bactérias. O fluxo de trabalho ilustra a seleção de fontes biológicas, preparação de extratos ou biomassa, reação com precursores metálicos (_{AgNO 3} ou HAuCl₄), condições de reação e formação de NP. Os sistemas biológicos incluem extrato foliar de Psidium guayaquilensis , extrato de algas Acanthophora spicifera , filtrado extracelular de Earliella sp. e culturas bacterianas MR-1 de Shewanella oneidensis . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

NOTA: Siga todas as diretrizes de segurança dos laboratórios institucionais ao manusear produtos químicos e materiais biológicos. Consulte as fichas de dados de segurança de todos os reagentes antes do uso.

1. Síntese de AgNPs usando folhas de P. guayaquilensis

1. Coleção de Folhas
   1. Colete folhas frescas de P. guayaquilensis durante a estação seca em Guayaquil, Província de Guayas, Equador (2°10′S, 80°0′W).
      NOTA: Exemplares voucher desta espécie endêmica foram depositados no Herbário GUAY, Faculdade de Ciências Naturais da Universidade de Guayaquil, Equador, e no Herbário Steere do Jardim Botânico de Nova York (NYBG), Nova York, EUA. Informações adicionais estão disponíveis em: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Preparação do Extrato de Folha
   1. Lave bem o material vegetal fresco com água destilada.
      NOTA: Garanta a remoção completa das impurezas superficiais.
   2. Seque as folhas em uma secadora de bandeja com fluxo de ar forçado a 40°C.
      NOTA: Baixas temperaturas de secagem minimizam a degradação dos compostos orgânicos termolábeis envolvidos na redução do Ag⁺ .
   3. Moa o material seco usando um moinho manual para obter um pó fino.
   4. Suspenda 10 g de material em pó em 200 mL de água destilada.
   5. Aqueça a suspensão a 70°C sob agitação contínua por 1 hora.
   6. Deixe o extrato esfriar até a temperatura ambiente (RT, ~28°C).
   7. Filtre o extrato sob vácuo através de papel filtro qualitativo (Grau 1, tamanho de poro 11 μm, diâmetro 110 mm).
      NOTA: Remova todos os resíduos sólidos do material vegetal.
   8. Armazene o extrato filtrado a 4°C em garrafas âmbar até o uso adicional.
3. Fabricação de AgNPs Fitogênicos usando extratos de folhas
   NOTA: Durante os experimentos de otimização, varie um parâmetro por ensaio mantendo os parâmetros restantes constantes. Avalie a concentração de nitrato de prata (_{AgNO 3)} (1–5 mM), fração de extração (10%–50% v/v), tempo de reação (0,5–1 h) e temperatura (25°C–80°C). Otimize os parâmetros de síntese usando a metodologia da superfície de resposta baseada em um DoE composto central. Estude cada fator em cinco níveis (-α, -1, 0, +1 e +α). Use o comprimento de onda do pico de ressonância de plasmon de superfície (SPR) (λ_SPR), que se correlaciona com o tamanho NP, como variável de resposta²⁴. O desenho experimental consiste em 16 pontos fatoriais, 8 pontos axiais e 5 réplicas em pontos centrais, resultando em um total de 29 experimentos.
   1. Prepare soluções de_{AgNO 3} dissolvendo a massa apropriada de_{AgNO 3} em água destilada para obter concentrações entre 1 e 5 mM.
      ATENÇÃO: O_{AgNO 3} é corrosivo e um agente oxidante forte que pode causar irritação na pele e nos olhos. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e proteção ocular. Evite exposição à luz e descarte resíduos contendo Agro conforme as diretrizes institucionais de segurança.
   2. Misture a solução de_{AgNO 3} com o extrato da planta para obter frações do extrato entre 10% e 50% (v/v).
   3. Aqueça e mexa a mistura de reação na temperatura selecionada (25°C–80°C) para o tempo de reação desejado (0,5–1 h).
   4. Deixe a mistura de reação em RT por 24 horas.
   5. Centrifuge a mistura marrom de reação a 1660 × g por 15 minutos em RT. Descarte o sobrenadante e colete a fração sólida.
   6. Seque os NPs recuperados em um forno a 60°C.

2. Síntese de AgNPs usando extratos de algas A. spicifera

1. Coleção de Algas
   1. Colete a alga A. spicifera em Valdivia, Província de Santa Elena, Equador (1°57′23,91′′S, 80°43′51,33′′W).
2. Preparação do Extrato de Algas
   1. Prepare o extrato de alga seguindo o procedimento descrito no Passo 1.2. Substitua as folhas da planta por biomassa de algas A. spicifera .
3. Fabricação de AgNPs Ficogênicos Usando Extratos de Algas
   NOTA: Realize uma série de 12 experimentos variando um parâmetro por vez, mantendo os parâmetros restantes constantes. Avalie a concentração de_{AgNO 3} (1–5 mM), a fração de extração (5%–25% v/v), o tempo de reação (1–4 h) e a temperatura (25°C–70°C).
   1. Prepare as soluções de_{AgNO 3} e o extrato de algas conforme descrito nos Passos 1.3.1 e 2.2.
   2. Misture a solução de_{AgNO 3} com o extrato de algas para obter uma fração de extrato de 5%–25% (v/v). Aqueça e mexa a mistura de reação na temperatura selecionada (25°C–70°C) para o tempo de reação desejado (1–4 h).
   3. Deixe a solução resfriar para RT por 24 horas. Recolha a fração sólida após a centrifugação e seque-a em um forno conforme descrito nos Passos 1.3.5 e 1.3.6.

3. Síntese de AgNPs usando Earliella sp.

1. Coleta e Manutenção da Cultura
   1. Transfira fragmentos miceliiais em crescimento ativo de Earliella sp. para placas de ágar de batata com dextrose.
      NOTA: A cepa fúngica usada neste estudo foi isolada de amostras ambientais coletadas no campus da ESPOL, no Equador. O isolado foi identificado taxonômicamente com base em características morfológicas e preservado na coleção de culturas do Centro de Pesquisa em Biotecnologia do Equador (CIBE, ESPOL) sob o código interno E2. Como essa cepa é mantida em uma coleção institucional e não foi depositada em um repositório internacional, não há RRID ou número de acesso externo disponível.
   2. Incube as placas a 28°C por 48 horas.
   3. Transfira um fragmento micelial para o Caldo de Batata Dextrose e incube a cultura sob agitação constante a 150 rpm por 5 dias.
      NOTA: Esta etapa promove a produção de biomassa e a secreção de metabólitos extracelulares.
   4. Filtre a cultura fúngica através de papel filtro estéril para separar a biomassa micelial do caldo extracelular. Colete o filtrado para a síntese subsequente de NP.
      NOTA: O caldo extracelular contém biomoléculas que atuam como agentes redutores e estabilizadores durante a síntese de AgNP.
2. Fabricação de AgNPs Micogênicos
   NOTA: Gerar 14 condições experimentais variando um parâmetro por ensaio, mantendo razões de volume constantes entre o caldo fúngico e a solução de_{AgNO 3} . Avalie a concentração de_{AgNO 3} (1–10 mM), pH (4–10 ajustado usando HCl ou NaOH), tempo de reação (1–4 h) e temperatura (25°C–70°C).
   ATENÇÃO: Ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH) são altamente corrosivos. Use equipamentos de proteção individual adequados e ajuste o pH lentamente sob agitação contínua para evitar respingos e superaquecimento localizado. Use 1 M de soluções ácidas ou basicas durante o ajuste do pH.
   1. Misture o caldo extracelular fúngico com uma solução de_{AgNO 3} na concentração desejada (1–10 mM) usando uma razão de volume entre 2,5% e 10% (v/v) para obter um volume final de reação de 50 mL. Ajuste o volume final da reação de acordo com a condição experimental a ser testada.
   2. Mexa a mistura de reação na temperatura selecionada (25°C–70°C) pelo tempo de reação desejado (1–4 h). Deixe a solução resfriar para RT por 24 horas. Recolha a fração sólida após a centrifugação e seque-a em um forno conforme descrito nos Passos 1.3.5 e 1.3.6.

4. Síntese de AuNPs usando C. metallidurans e S. oneidensis

1. Coleta e Manutenção da Cultura
   1. Inocular estoques celulares congelados preservados em 20% de glicerol a −80°C de C. metallidurans CH34 ou S. oneidensis MR-1 em placas de ágar de soja trípticas sob condições aeróbicas. Incube as placas a 28°C por 24 horas.
   2. Selecione uma colônia individual de cada prato e inocule-a em 250 mL de caldo de soja tríptico em condições aeróbicas. Incube a cultura a 28°C em um agitador rotativo operando a 120 rpm.
   3. Colhe as células na fase estacionária após 72 horas de incubação, quando a densidade óptica em 610 nm (OD₆₁₀) atinge aproximadamente 1. Centrifuge as culturas a 10.000 × g por 10 minutos a ~20°C.
   4. Lave os pellets coletados duas vezes com solução estéril de NaCl a 0,9% (p/v). Concentre as células lavadas em um valor OD₆₁₀ de aproximadamente 7.
   5. Gerar estoques de células concentradas anóxicas desgaseificando as suspensões e preenchendo o espaço de cabeça com gás_N2 .
2. Fabricação de AuNPs Bacteriogênicos
   NOTA: Use uma matriz fatorial fracionária para avaliar a influência dos fatores ambientais na síntese do AuNP²⁵. Construa a matriz usando 7 fatores em 2 níveis selecionados de acordo com estudos anteriores^26,27. Organize os experimentos em uma matriz ortogonal e randomize a ordem experimental para minimizar o viés entre tentativas e combinações. A ordem experimental resultante é apresentada em Tabela 1.
   1. Dissolva cloreto de ouro triidrato (HAuCl₄) em água desionizada para preparar uma solução de estoque a 5 g ^L−1.
      ATENÇÃO: HAuCl₄ é tóxico e um agente oxidante forte. Manuseie todas as soluções dentro de uma exaustão química certificada, usando equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jaleco, luvas e óculos de proteção. Evite contato com materiais orgânicos e descarte resíduos de acordo com os protocolos institucionais de resíduos perigosos.
   2. Prepare os reatores experimentais diluindo a solução original até a concentração-alvo em 0,9% (p/v) de solução de NaCl e ajustando o pH de acordo com as condições experimentais listadas na Tabela 1.
   3. Dispense 50 mL da solução metálica preparada em frascos limpos de soro de 120 mL. Selar imediatamente cada frasco usando uma rolha de borracha butílica.
   4. Prenda a tampão usando uma vedação de alumínio e uma crimpadora portátil. Esterilize os frascos de soro lacrados autoclavando a 121°C por 21 minutos.
   5. Deixe as garrafas esfriarem para RT e inspecione visualmente cada garrafa para ver se há precipitação.
      NOTA: Descarte quaisquer garrafas que mostrem precipitação visível e prepare reatores de reposição.
   6. Estabelecimento de Condições Anóxicas
      1. Conecte cada garrafa de soro esterilizada a um sistema de coletor de gás equipado com uma fonte de nitrogênio de alta pureza (N₂) e uma bomba de vácuo.
      2. Gerar um headspace anóxico realizando 21 ciclos consecutivos de purga para cada reator que requer condições anóxicas, conforme a Tabela 1. Durante cada ciclo, aplique vácuo seguido de recarga de nitrogênio por aproximadamente 30 s até que a pressão interna retorne aproximadamente à pressão atmosférica (~1 atm).
         NOTA: Não é necessária verificação direta de condições anóxicas; no entanto, a análise de gases no espaço de saída, como cromatografia gasosa, pode ser usada para confirmar a remoção de oxigênio quando necessário.
         ATENÇÃO: O gás nitrogênio pode deslocar o oxigênio e criar risco de asfixia em espaços fechados. Garanta ventilação adequada do laboratório e verifique as conexões seguras das linhas de gás antes do uso.
      3. Mantenha os reatores sob uma leve pressão positiva de_N2 após o ciclo final de purga.
      4. Rotule os reatores de 1 a 8 de acordo com a ordem experimental. Por exemplo, rotule a quinta condição experimental como R5.
   7. Adição de Doadores de Elétrons e Inoculação
      1. Injete o volume necessário de solução estéril anóxica de doador de elétrons líquidos, como lactato de sódio, na fase líquida dos reatores designados conforme a Tabela 1 , usando uma seringa e agulha estériles.
      2. Injete o volume necessário de doador gasoso de elétrons, como H₂, no espaço de cabeça designado do reator usando uma seringa hermética a gás.
      3. Inocular todos os reatores bióticos injetando assépticamente o volume necessário de cultura anóxica anóxica concentrada na fase líquida.
         NOTA: Armazene culturas concentradas de estoque a 4°C antes da inoculação para manter a viabilidade celular.
   8. Configuração de Experimentos de Controle
      1. Prepare um controle abiótico seguindo todas as etapas descritas no Passo 4.2, enquanto substitui o inóculo microbiano por um volume equivalente de meio ou tampão anóxico estéril.
      2. Prepare um controle de células mortas seguindo todas as etapas descritas no Passo 4.2 usando um inóculo esterilizado por autoclave.
         NOTA: Use os controles para considerar a redução e biosorção de metais abióticos. Prepare o controle de células mortas autoclavando estoques celulares viáveis a 121°C por 21 minutos para avaliar a contribuição dos mecanismos microbianos ativos.
   9. Tempo de Incubação e Reação
      1. Coloque todos os frascos de soro em incubadoras com controle de temperatura.
      2. Ajuste a temperatura de incubação de acordo com as condições experimentais especificadas na Tabela 1.
      3. Coloque as incubadoras em plataformas rotativas de agitação e incube os reatores a 120 rpm.
      4. Permita que as reações continuem por 72 horas.
         NOTA: Pause o experimento após a incubação e armazene os frascos de soro a 4°C até o processamento da amostra.
         NOTA: Opcionalmente, quantifique o metal dissolvido residual após a biossíntese de NP usando espectroscopia de emissão óptica de plasma acoplado indutivamente para avaliar a eficiência da remoção de metais e distinguir a formação de NP de espécies residuais dissolvidas.
3. Replicação de Condições Ótimas
   1. Identifique a condição do reator associada à remoção máxima de metal após triagem primária e análise de dados.
   2. Replicar a condição ótima selecionada em três garrafas independentes do reator para confirmar a reprodutibilidade.
   3. Realize a preparação, configuração do reator e procedimentos de incubação para os experimentos de verificação triplicada de acordo com os Passos 4.1 e 4.2.
      NOTA: Após a conclusão dos experimentos, armazene temporariamente e rotule todas as soluções dissolvidas como resíduos aquosos até o descarte por empresas certificadas de gestão de resíduos, conforme o Código Orgânico Nacional do Meio Ambiente e as diretrizes técnicas institucionais.

Reator / Bactérias	Temperatura (°C)	Atmosfera	Doador de elétrons	Densidade óptica (OD610)	pH	[Gold] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tabela 1: Desenho experimental fatorial fracionado usado para a síntese de AuNP bacteriogênica. Esta tabela resume as condições experimentais avaliadas para a síntese de AuNP usando S. oneidensis MR-1 (SOM) ou C. metallidurans CH34 (CMC). As variáveis incluíram temperatura de incubação, atmosfera de espaço de cabeça, doador de elétrons, densidade óptica do inoculo (OD₆₁₀), pH da solução e concentração inicial de Au³⁺ .

5. Caracterização de AgNPs e AuNPs

NOTA: Use espectroscopia ultravioleta–visível (UV–Vis) como método acessível para confirmar a formação de NP por ressonância de plasmons de superfície. Use microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para avaliar diretamente a morfologia e o tamanho dos NP. Caracterizações fisicoquímicas adicionais podem ser realizadas usando técnicas complementares como espalhamento dinâmico da luz (DLS), difração de raios X (XRD), espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de raios X dispersiva de energia (EDS) para avaliar a distribuição de tamanho, cristalinidade, química da superfície e composição elementar quando uma caracterização mais abrangente for^{necessária 28,29}.

1. Espectroscopia UV–Vis
   1. Configuração do Instrumento
      1. Ligue o espectrofotômetro UV–Vis e permita que o instrumento aqueça por pelo menos 15 minutos para garantir a estabilidade do sinal.
      2. Selecione o modo de varredura espectral e configure a faixa de comprimentos de onda de 300 a 800 nm usando um intervalo de dados de 1 nm.
2. Preparação de Amostras
   1. Colete aliquotas de suspensões recém-sintetizadas de AgNP ou AuNP. Dilua as amostras com água destilada quando necessário para manter os valores de absorção dentro da faixa linear de detecção.
3. Medição UV–Vis de NPs
   1. Realize a correção de base usando água destilada como solução em branco.
   2. Transfira a amostra preparada para uma cubeta, coloque a cubeta no suporte da amostra e registre o espectro UV–Vis na faixa de 300–800 nm.
   3. Identifique a faixa SPR correspondente à formação do NP.
      NOTA: As AgNPs normalmente exibem bandas SPR entre 405 e 425 nm, enquanto as AuNPs geralmente exibem bandas SPR entre 520 e 550 nm.
4. Microscopia Eletrônica de Transmissão
   NOTA: Analise a morfologia e o tamanho do NP usando TEM operado a 80 kV e equipado com uma câmera digital de alta resolução.
   1. Transfira 1,5 mL de suspensão NP para um tubo centrífugo e centrifuge a 5000 × g por 5 minutos em RT.
   2. Descarte o sobrenadante e retenha a pastilha.
   3. Adicione 1 mL de solução de fixação contendo 4% de paraformaldeído e 5% de glutaraldeído preparado em tampão de 0,1 M de cacodilato ao pellet. Incube a amostra por 25 horas na RT. Depois, lave o pellet durante a noite com 0,1 M de cacodilato de sódio.
   4. Centrifuge a amostra a 5000 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
   5. Adicione 1 mL de tetróxido de ósmio (_{OsO 4}) a 1% (p/v) preparado em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M para fixação por 3 horas.
      ATENÇÃO: O_{OsO 4} é altamente tóxico e volátil. Manuseie todas as soluções exclusivamente dentro de uma exaustão química certificada, usando equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jaleco, luvas e óculos de segurança.
   6. Centrifuge a amostra a 5000 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
   7. Desidrate a amostra usando uma série de etanol graduada. Adicione 50% de etanol, incube por 15 minutos. Repita o procedimento sequencialmente usando 70% e 90%. Desidratação completa com três incubações consecutivas em etanol absoluto por 30 minutos por incubação.
   8. Embutida o pellet em resina epóxi no RT conforme as instruções do fabricante.
   9. Prepare seções semifinas (~1 μm) e tinga as seções com azul toluidina para observação preliminar.
   10. Corte seções ultrafinas (~60 nm) usando uma faca de diamante e tinga as seções com acetato de uranila seguido de citrato de chumbo.
   11. Monte as seções em grades TEM e coloque-as no microscópio eletrônico de transmissão.
   12. Adquira imagens TEM para avaliar a morfologia e o tamanho dos NPs.

Resultados

As AgNPs foram sintetizadas com sucesso por meio de rotas verdes e biossintéticas usando diferentes agentes redutores biológicos, e condições ideais de síntese foram identificadas para cada método. Na síntese verde mediada pelo extrato foliar de P. guayaquilensis , as condições ideais consistiram em uma concentração de_{AgNO 3} de 5 mM, uma razão extrato-solução metálica de 25% (v/v), uma temperatura de reação de 80°C e um tempo de agitação de 60 minutos seguido de um pe...

Discussão

Ao comparar as rotas de síntese avaliadas em termos de viabilidade, controle do tamanho do NP, custo operacional, reprodutibilidade e eficiência geral do processo, a síntese mediada por plantas usando extrato de folha de P. guayaquilensis demonstrou o equilíbrio mais favorável entre os métodos de síntese de AgNP investigados. Esse protocolo proporcionou melhor controle sobre o tamanho do NP por meio de otimização sistemática e caracterização microscópica direta, operando sob con...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Absolute ethanol	Merck	E7023	Série de desidratação TEM
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	Para frascos de soro
Amber glass bottles	Duran	2180154	Armazenamento protegido da luz
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Faixa espectral: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Esterilização a 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	Selagem hermética
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Centrífuga de bancada
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Precursor de ouro
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	Seção ultrafina TEM
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	Preparação de solução
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	Meio de incorporação TEM
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Tamanho de poros: 11 µm; diâmetro: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Faixa espectral: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	Para ciclos de purga
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	Glutaraldeído 5%, paraformaldeído 4% em tampão de 0,1 M de sódio cacodílico
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Preservação de estoque 20%
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	Cripar e selar frascos de soro
Hand mill/grinder	Corona	L10000	Mói biomassa vegetal
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	Ajuste de pH
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	Gás doador de elétrons
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	Quantificação de metais
Incubator	Memmert	SM 400	Incubação com temperatura controlada
Laboratory oven	Barnstead	M100	Secagem de nanopartículas
Lead citrate	Merck	7398	Coloração TEM
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Reagente ácido
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	Condições anóxicas
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	Fixação TEM
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	Glutaraldeído 5%, paraformaldeído 4% em tampão de 0,1 M de sódio cacodílico
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	Cultivo de fungos
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	Meio microbiológico
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubação com agitação controlada
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	Vidro borossilicato
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	Reagente ACS, ≥99,0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	Glutaraldeído 5%, paraformaldeído 4% em tampão de 0,1 M de sódio cacodílico
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	Solução de lavagem 0,9%
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Ajuste de pH
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	Doador de elétrons/fonte de carbono
Sterile syringes and needles	BD	Various	Manuseio estéril de líquidos
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	Aquecimento e agitação
Toluidine blue	EMS	DcU-10	Coloração de seção semifina
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Equipado com câmera digital de alta resolução
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	Secagem de biomassa a 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Meio microbiológico
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Meio microbiológico
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	Coloração TEM
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	Análise espectral UV–Vis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	Para condições anóxicas
Materiais Biológicos
Material Biológico	Origem	Identificador	Comentários/Descrição
Acanthophora spicifera	Coleção local	N/A	Biomassa de alga marinha
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Cepa bacteriana
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Coleta fúngica institucional
Psidium guayaquilensis	Coleção local	N/A	Biomassa de planta selvagem
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Cepa de coleção de cultura