Um método para adaptar Euglena gracilis a substratos à base de mandioca para cultivo heterotrófico

Resumo

Este protocolo descreve o método passo a passo para adaptar Euglena gracilis a substratos à base de mandioca e a subsequente avaliação do crescimento, viabilidade e produção de biomassa em múltiplos produtos de mandioca sob condições de cultivo heterotróficas.

Resumo

O processamento da mandioca gera subprodutos ricos em nutrientes que permanecem subutilizados devido à composição variável, compostos cianogênicos e comunidades microbianas ativas. Este protocolo apresenta uma estratégia de adaptação em múltiplos estágios para estabelecer uma linhagem tolerante à mandioca de Euglena gracilis , adequada para cultivo heterotrófico em substratos derivados da mandioca. O método começa com a exposição simultânea de culturas de Euglena a meios de mandioca autoclavados e não autoclavados e a um gradiente de concentração de garri de 10–30 g/L para avaliar a tolerância à complexidade microbiana e à carga do substrato. As culturas são então submetidas a um gradiente de concentração mais alto, de 30–50 g/L, para avaliar o desempenho com substratos mais densos. A linhagem resultante é comparada com uma cepa selvagem não adaptada em cinco produtos de mandioca; garri, polpa seca, pellets, cascas e ração para animais para avaliar a consistência do crescimento em materiais relevantes para o campo. O protocolo inclui a medição de mudanças de pH, níveis de cianeto usando tiras colorimétricas e preparação de biomassa seca para análise de proteínas baseada na quantificação total do nitrogênio. Juntos, esses procedimentos fornecem uma estrutura reprodutível para adaptar Euglena gracilis a substratos derivados da mandioca e para avaliar o desempenho da cepa em diversos produtos de mandioca. Esse método possibilita o desenvolvimento de linhagens de algas robustas para uso em bioprocessamento focado em mandioca e aplicações de valorização de resíduos.

Introdução

A mandioca (Manihot esculenta) é uma importante cultura alimentícia e industrial em toda a África Ocidental, gerando subprodutos processados como garri, polpa seca, cascas e^{pellets 1.}

Substratos derivados da mandioca são compostos principalmente por carboidratos fermentáveis e nutrientes residuais, além de teor mínimo de proteína e fibra, embora a composição possa variar dependendo das condições de processamento e do material^{de origem 2,3}. Eles permanecem subutilizados devido à sua composição heterogênea, à presença de glicosídeos cianogênicos e às diversas comunidades microbianas que surgem durante o processamento e fermentação tradicionais⁴. Essas características apresentam desafios para o cultivo microbiano direto e limitam a integração de subprodutos da mandioca nos fluxos de trabalho padronizados de bioprocessamento. Apesar da abundância de subprodutos derivados da mandioca, atualmente há falta de métodos reprodutíveis e biosustentáveis para cultivar sistemas microbianos nesses substratos quimicamente complexos e microbianamente ativos. Um sistema de cultivo capaz de enriquecer ou desintoxicar uma fonte de alimento tão popular, operando de forma confiável nessas condições, apoiaria fluxos de trabalho mais sustentáveis de processamento de mandioca e a utilização circular de recursos.

Euglena gracilis é um flagelado unicelular dentro dos Euglenozoa⁵ , reconhecido por sua película flexível, morfologia dinâmica e capacidade reversível de cistem em resposta a flutuações substanciais na disponibilidade de nutrientes, pressão osmótica e composição^{química 6}. Sua adaptabilidade metabólica também permite que sintetize o polissacarídeo de armazenamento^{paramilo 6} e regule o pH celular por meio do metabolismo do ácido orgânico. Essas características metabólicas, especialmente o acúmulo de paramilons, podem aumentar o armazenamento de energia e a tolerância ao estresse, apoiando a sobrevivência e adaptação sob as condições variáveis de nutrientes e químicos características dos substratos derivados da mandioca. Essas características permitem que E. gracilis persista sob condições quimicamente variáveis de água doce, tornando-a uma candidata promissora para cultivo em substratos heterogêneos e não^{refinados 7}.

Quando expostas a substratos quimicamente complexos ou microbianamente ativos, culturas de E. gracilis não adaptadas frequentemente apresentam respostas ao estresse, como aumento da cistinação e redução da motilidade, enquanto populações adaptadas podem manter morfologia e atividade metabólica mais^{estáveis 8}. Interações com comunidades microbianas associadas podem influenciar ainda mais o desempenho fisiológico durante exposição prolongada a substratos complexos. Essas características destacam a relevância de abordagens baseadas em adaptação ao cultivar E. gracilis em materiais derivados da^{mandioca 9}.

Para enfrentar esses desafios, esse método emprega uma estratégia de adaptação em etapas projetada para aclimatar gradualmente E. gracilis a substratos derivados da mandioca. A abordagem incorpora exposição controlada ao aumento da complexidade do substrato e à atividade microbiana, permitindo a seleção de populações capazes de manter viabilidade e crescimento sob condições heterogêneas de cultivo. Esse design permite que E. gracilis interaja com a microbiota associada e potencialmente obtenha vantagens da microbiota associada, além de se adaptar ao aumento das concentrações de meio.

Após a adaptação, o protocolo conduz uma avaliação comparativa das linhagens adaptadas e não adaptadas de E. gracilis em múltiplos produtos derivados da mandioca. Esse quadro comparativo permite a avaliação da consistência do crescimento, estabilidade morfológica e respostas fisiológicas sob condições de substrato relevantes para o campo, à medida que o processo de adaptação prepara gradualmente a E. gracilis para navegar pela variabilidade nutricional, estressores químicos e atividade microbiana características dos subprodutos da mandioca.

O método incorpora monitoramento padronizado dos níveis de pH e^{cianeto 10} durante o cultivo, bem como a preparação da biomassa colhida para análise de proteínas a jusante via quantificação total de^{nitrogênio 11}, permitindo a comparação do potencial nutricional entre substratos e cepas. Juntas, essas medições apoiam a avaliação da estabilidade metabólica, interações com substratos e características da biomassa durante o cultivo e adaptação à base de mandioca, demonstrando que a linhagem adaptada de E. gracilis pode crescer de forma robusta e consistente em múltiplos subprodutos da mandioca.

Esse método é mais adequado para laboratórios ou pesquisas aplicadas com acesso a infraestrutura microbiológica básica e substratos derivados da mandioca localmente disponíveis. Considerações práticas incluem a necessidade de manuseio consistente de meios heterogêneos, acesso à microscopia para monitoramento da saúde da cultura e controle cuidadoso da mistura para evitar estresse de cisalhamento durante o cultivo.

Protocolo

Esse protocolo utiliza protistas não patogênicos e substratos vegetais derivados da mandioca. Realizar todos os procedimentos de acordo com os requisitos institucionais de biossegurança e segurança química para materiais vegetais cianogênicos.

1. Preparação e fermentação de meios à base de mandioca

ATENÇÃO: Materiais derivados da mandioca podem conter glicosídeos cianogênicos e liberar cianeto de hidrogênio sob certas condições. Realize todas as etapas de pesagem, hidratação, mistura e amostragem em uma exaustão química. Use jaleco, luvas de nitrilo e óculos de proteção. Descontamine as superfícies de trabalho após o manuseio de substratos de mandioca e descarte resíduos sólidos e líquidos como resíduos químicos perigosos, conforme as diretrizes institucionais.

1. Preparar suspensões garri
   Nota: O tipo selvagem Euglena gracilis foi cultivado sob condições de escuridade constante a 28°C com tremores orbitais a 120 x g. A composição do meio nutritivo heterotrófico foi preparada como uma formulação definida composta por 1,5% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, 0,1% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% de CaCL2,2H2O mais 0,4 mL/L de solução de estoque vitamínico (Vitamina B1: 2,50g/L; Vitamina B12: 12,5 mg/L; Vitamina B6: 0,5mg/L; Vitamina B7: 0,025 mg/L) e 2,0 mL/L de solução de estoque de metais traço (Na2EDTA.2H2O: 25,00 g/L; FeCl3.6H2O: 21,00 g/L; ZnSO4.7H2O: 11,0 g/L; MnCl2.4H2O: 4,0 g/L; CuSO4,5H2O: 0,39 g/L; H3BO3: 0,285 g/L; Na2MoO4,2H2O: 0,9 g/L).
   1. Rotule cada frasco estéril de 500 mL com capacete ventilada com o tipo de substrato (garri), concentração alvo (10, 20, 30, 40 ou 50 g ^L-1), identificação replicada e condição de esterilização planejada (autoclavada ou não autoclaveada).
   2. Coloque um barco de pesagem na balança analítica e pressione TARE/Zero para ajustar o display para 0,000 g.
   3. Pese o garri para corresponder ao volume final de trabalho (por exemplo, para 300 mL, pesar 3,0 g para 10 g ^L-1, 6,0 g para 20 g ^L-1, 9,0 g para 30 g ^L-1, 12,0 g para 40 g ^L-1, ou 15,0 g para 50 g ^L-1).
      NOTA: A faixa de concentração selecionada (10–50 g ^L-1) foi projetada para abranger condições desde o crescimento inicial até a alta carga do substrato, permitindo a avaliação da adaptação à crescente complexidade fisicoquímica.
   4. Adicione assépticamente o garri pesado em cada frasco estéril de 500 mL contendo 300 mL de água deionizada ou destilada e reaplique a tampa ventilada.
   5. Misture cada suspensão por 3 minutos, até que a mistura esteja homogeneizada usando uma das seguintes abordagens.
      NOTA: E. gracilis é sensível ao cisalhamento mecânico; portanto, condições de mistura foram selecionadas para minimizar o estresse induzido pela agitação, mantendo contato adequado entre as células e o substrato.
      1. Para mistura manual, aperte a tampa ventilada e gire o frasco manualmente em um movimento circular por 3 minutos até que os sólidos estejam distribuídos uniformemente.
      2. Para agitação magnética, adicione asépticamente uma barra de agitação estéril ao frasco, coloque o frasco sobre uma placa de agitação e ajuste a velocidade para 200 x g para formar um vórtice raso sem respingos.
   6. Deixe a suspensão hidratar sem perturbação por 10 minutos em temperatura ambiente (25 °C).
   7. Imediatamente antes da fermentação, homogeneize suavemente a mistura primeiro apertando a tampa da ventilação e girando os frascos manualmente por 5 vezes para resuspender o material sedimentado.
      NOTA: O garri usado neste estudo era um produto comercialmente derivado da mandioca. Com base nas informações nutricionais fornecidas pelo fabricante, consistia principalmente em carboidratos, com pequenas quantidades de proteína e teor de gordura negligenciável. Essa composição reflete substratos processados típicos de mandioca usados em contextos alimentares e industriais.
2. Prepare mídia adicional para produtos de mandioca
   1. Rotule cada frasco estéril de 500 mL com capacho ventilado com o tipo de substrato (polpa seca, pellets, cascas ou ração animal), concentração (30 g ^L-1), identificação replicada e condição de esterilização (autoclavada ou não autoclavada).
   2. Coloque um barco de pesagem na balança analítica e pressione TARE/Zero para ajustar o display para 0,000 g.
   3. Pese o substrato para alcançar 30 g ^L-1 com base no volume de trabalho (por exemplo, para 300 mL, pesar 9,0 g).
   4. Adicione assépticamente o substrato pesado em cada frasco estéril contendo 300 mL de água deionizada ou destilada e reaplique a tampa ventilada.
   5. Hidrate e misture cada suspensão usando uma das seguintes abordagens.
      1. Para misturar manualmente, aperte a tampa do ventilador e gire suavemente o frasco 10 vezes a cada 3 minutos durante o período de hidratação.
      2. Para agitação magnética, adicione assépticamente uma barra de agitação estéril e mexa a 200 x g até que o material fique visivelmente hidratado e distribuído uniformemente.
   6. Inspecione visualmente cada suspensão e confirme que os sólidos estão hidratados e que não restam grandes aglomerados secos.
      NOTA: Não filtre mídia de mandioca, a menos que seja necessário para uma medição analítica a jusante.
3. Fermentação aeróbica de mídia à base de mandioca
   1. Confirme que cada garrafa está equipada com uma tampa ventilada estéril permeável ao gás para permitir a troca de gás, minimizando a contaminação ambiental.
   2. Coloque os frascos em posição vertical em temperatura ambiente (25 °C) em uma área designada, longe da luz solar direta e do fluxo de ar de alto tráfego.
   3. Incube sem agitação por pelo menos 72 horas.
   4. Registre a data e o horário de início da fermentação para cada frasco e condição.
4. Prepare mídia autoclavada
   1. Após a fermentação, certifique-se de que cada garrafa de 500 mL contenha ≤300 mL de líquido (≤ dois terços do volume total) para evitar o transbordamento durante a esterilização.
   2. Afrouxe a tampa ventilada para uma posição "apertada com os dedos" adequada para autoclaving e aplique fita indicadora de autoclave no frasco.
   3. Coloque os frascos no autoclave em uma bandeja segura para autoclave e selecione o ciclo líquido P13.
   4. Certifique-se de que os parâmetros de esterilização estejam em 121 °C por 30 minutos (esterilização líquida) e inicie o ciclo.
   5. Após o ciclo, permita que a pressão da câmara do autoclave retorne à pressão atmosférica antes de abrir a porta. Remova os frascos usando luvas resistentes ao calor e deixe-os esfriar até a temperatura ambiente.
   6. Armazene os frascos resfriados durante a noite em temperatura ambiente antes da inoculação.
      ATENÇÃO: Líquidos quentes e vapor podem causar queimaduras. Abra a porta do autoclave lentamente e só remova os frascos depois que a pressão se equalizar e os líquidos esfriarem.
5. Prepare mídia não autoclavada
   1. Use meio de mandioca fermentado diretamente, sem autoclavar, para preservar comunidades microbianas nativas.
   2. Inocule meios não autoclavados imediatamente após o período de fermentação de 72h para minimizar a contaminação ambiental não intencional.
   3. Mantenha um manuseio consistente entre as réplicas usando o mesmo tipo de recipiente (frascos estéreis de 500 mL com tampa ventilada), o mesmo volume de trabalho (300 mL) e a mesma duração de fermentação (≥72h) para todas as condições do substrato.

2. Estabelecimento de culturas iniciais de E. gracilis

1. Manutenção de culturas de animais de E. gracilis
   1. Inocular E. gracilis em meio nutritivo fresco heterotrófico e incubar culturas em completa escuridão a 28 °C, com agitação orbital contínua a 120 x g até que as culturas atinjam crescimento logarítmico médio.
   2. Examinar culturas usando um microscópio óptico composto (campo claro) com ampliação total de 100× a 400× (10× ocular com objetivos de 10× a 40×) para confirmar motilidade ativa, morfologia celular típica alongada e baixos níveis de cistismo.
      NOTA: A viabilidade foi avaliada com base na presença de células intactas com limites celulares definidos e detritos mínimos. Motilidade ativa foi definida como movimento direcional observável das células dentro do campo de visão. A estabilidade morfológica foi avaliada com base na predominância de formas celulares características e baixa frequência de formas colapsadas ou altamente irregulares.
   3. Exclua culturas que apresentem detritos celulares excessivos, morfologia anormal ou enquestação elevada antes do uso em experimentos de adaptação.
2. Preparar o inoculo para adaptação
   1. Homogeneize suavemente as culturas iniciadoras apertando a tampa do ventilador e girando os frascos manualmente por 15 segundos para garantir uma distribuição uniforme das células sem induzir tensão de cisalhamento.
   2. Determine a densidade celular usando um hemocitometro de Neubauer.
      1. Misture suavemente a cultura girando manualmente por 15 segundos.
      2. Pipete 1,0 mL de cultura em um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Limpe o hemocitômetro e o slip com etanol a 70% e deixe secar ao ar.
      4. Pipete 10 μL de cultura nas duas grades do hemocitômetro e coloque o coverslip sobre a amostra úmida.
      5. Usando microscopia de campo claro (objetivo 10×), foque na grade e conte as células em um conjunto definido de quadrados (por exemplo, os 4 quadrados de canto da grade grande).
      6. Aplique as regras padrão de limites (conte as células que toquem as bordas superior e esquerda; exclua as células que toquem as bordas inferior e direita).
      7. Repita as contagens na segunda câmara (e/ou recarregue) e calcule a média de células/mL.
      8. Calcule a densidade celular usando a seguinte equação: células/mL= (média das células por quadrado × 10⁴× fator de diluição)/1
         Nota: Para melhorar a visualização das células, dilua a amostra com água desionizada conforme necessário (por exemplo, retire uma aliquota de 100 μL da amostra e dilua em 600 μL de água desionizada, e repita a avaliação de densidade celular)
   3. Ajuste os volumes de inoculação para alcançar um inóculo final de 5% (v/v) em todos os meios experimentais.
      NOTA: As proporções selecionadas de inoculum são escolhidas para garantir densidade celular inicial suficiente e manutenção das culturas.
   4. Prepare unóculos separados para cada condição de tratamento para manter densidades celulares iniciais consistentes entre os grupos experimentais.

3. Adaptação inicial em mídia de mandioca autoclavada e não autoclavada

1. Mídia de adaptação inoculada
   NOTA: Os volumes do inoculo foram selecionados para equilibrar densidade celular inicial suficiente com sensibilidade aos efeitos de adaptação, com volumes menores usados durante a adaptação inicial e volumes maiores usados para manter culturas estáveis durante a passagem rotineira.
   1. Adicione o inóculo preparado de E. gracilis a meios de mandioca autoclavados e não autoclavados preparados em concentrações finais de garri de 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 e 30 ^gL-1.
   2. Use volumes iguais de inoculação em todas as condições de tratamento para padronizar a densidade celular inicial.
   3. Para misturar as culturas, aperte a tampa ventilada e enrole o frasco suavemente em um movimento circular por 15 segundos para distribuir as células.
   4. Incubar culturas na completa escuridão a 25 °C para iniciar o crescimento heterotrófico.
2. Manter as condições culturais
   1. Para meios não autoclavados, minimize a agitação para preservar a estrutura da comunidade microbiana nativa e a estratificação do substrato.
   2. Misture todas as culturas uma vez ao dia usando um movimento manual suave por 15 segundos para manter o contato entre as células de E. gracilis e o material de mandioca suspenso.
      ATENÇÃO: Evite sacudidas vigorosas ou agitação contínua para evitar estresse de cisalhamento e interrupções não intencionais das interações microbianas-substrato.
3. Monitorar a adaptação precoce
   1. A cada 48 horas, colete asepticamente 1 mL de amostras de cada cultura usando pontas de pipeta estéreis.
      1. Aperte a tampa ventilada e agite suavemente o frasco de cultura por 15 segundos antes da amostra para garantir uma distribuição uniforme das células e do material suspenso.
      2. Transfira uma aliquota de cultura para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Dilua a amostra com água desionizada conforme necessário para melhorar a visualização das células individuais. (por exemplo, 100 μL de amostra diluída em 600 μL de água desionizada).
      4. Prepare a lâmina de microscópia de montagem úmida pipetando 10 μL da amostra diluída em uma lâmina de microscópio limpa e cubra com uma lâmina de tampo.
   2. Avaliar culturas por microscopia óptica
      1. Examine amostras usando um microscópio óptico composto (campo claro) com ampliação total de 100×–400× (10× ocular com 10×–40× objetivos).
      2. Avalie a motilidade celular, morfologia e frequência de cistos como indicadores do status de adaptação.
         NOTA: A viabilidade foi avaliada com base na presença de células intactas com limites celulares definidos e detritos mínimos. Motilidade ativa foi definida como movimento direcional observável das células dentro do campo de visão. A estabilidade morfológica foi avaliada com base na predominância de formas celulares características e baixa frequência de formas colapsadas ou altamente irregulares.
4. Executar passagem serial durante a adaptação
   NOTA: Intervalos de amostragem e transferência são fornecidos como intervalos definidos para acomodar a variabilidade na dinâmica de crescimento, mantendo um tempo experimental consistente entre as réplicas.
   1. A cada 7 dias, transfera assépticamente 20% (v/v) de cada cultura para meios de mandioca recém-preparados com a mesma concentração de garri e condição de esterilização.
   2. Mantenha volumes de transferência consistentes entre as passagens para preservar a pressão seletiva.
   3. Repita a passagem serial até que as culturas apresentem crescimento consistente, motilidade sustentada e baixa frequência de cistinação em meio mandioca ^L-1 de 30 g.
      Ponto de Pausa: As culturas podem permanecer intocadas por até 24 horas entre as etapas rotineiras de mistura e amostragem.

4. Seleção de alta concentração (30–50 g/L)

1. Prepare substratos de alta carga
   1. Prepare meios de mandioca à base de garri em concentrações finais de 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 e 50 ^gL-1 , seguindo os procedimentos descritos no Método 1.
   2. Permita que os substratos se hidratem completamente durante o período de fermentação para garantir uma exposição uniforme das células aos componentes dissolvidos e particulados.
   3. Resuspenda suavemente as partículas sedimentadas, girando os frascos manualmente por 10–15 segundos imediatamente antes da inoculação.
2. Inocular culturas de alta carga
   1. Inocule cada meio de mandioca de alta concentração com 5% (v/v) da linhagem de E. gracilis previamente adaptada a 30 ^gL-1 garri.
   2. Padronize os volumes de inoculação em todas as concentrações para manter densidades celulares iniciais comparáveis.
   3. Incubar culturas em completa escuridão a 25 °C com agitação orbital contínua a 120 x g para manter condições de crescimento heterotrófico.
   4. Misture culturas uma vez ao dia por meio de um movimento manual suave por 15 segundos para manter o contato entre as células e o substrato suspenso sem induzir tensão de cisalhamento
3. Monitorar desempenho sob alta carga de substrato
   1. Inspecionar culturas a cada 48 horas em busca de mudanças visíveis na turbidez, pigmentação e interação entre as células de E. gracilis e o material sedimentado de mandioca.
   2. Colete asépticamente pequenas alíquotas e examine células usando um microscópio óptico composto com ampliação total de 100×–400× (10× ocular com 10×–40× objetivos).
   3. Avalie motilidade, morfologia celular e frequência de cistem como indicadores de tolerância fisiológica ao aumento da concentração no substrato (Consulte o Método 2).
4. Confirmar adaptação a altas concentrações de substrato
   1. Identifique culturas que mantenham motilidade sustentada, morfologia consistente e baixa frequência de cystação em concentrações de mandioca de ≥40 g ^L-1.
   2. Designe culturas que atendam a esses critérios como a linhagem grácil adaptada à mandioca para avaliação experimental subsequente.

5. Testes comparativos de crescimento em mídias de produtos de mandioca

1. Preparar condições de teste pareadas
   1. Para cada produto de mandioca, incluindo garri, polpa seca, pellets, cascas e ração animal, prepare dois recipientes idênticos contendo a mesma concentração e volume de substrato.
   2. Inocule um vaso com a linhagem adaptada à mandioca de E. gracilis e o vaso pareado com a cepa selvagem não adaptada.
   3. Use volumes de inoculação iguais para cada condição pareada para garantir densidades celulares iniciais comparáveis entre linhagens
2. Manter culturas pareadas
   1. Incubar todas as culturas pareadas na escuridão total a 25 °C com sacusão orbital contínua a 120 x g para manter condições de crescimento heterotrófico.
   2. Misture culturas uma vez ao dia por inversão manual suave para manter o contato entre as células e o substrato suspenso.
   3. Registre mudanças visíveis, incluindo turbidez, pigmentação e padrões de sedimentação, ao longo do período de incubação.
3. Registro de diferenças morfológicas observadas
   1. Em intervalos de amostragem definidos, colete asépticamente alíquotas de cada cultura para análise microscópica (veja o Método 2.2 para coleta de alíquotas e análise ao microscópio)
   2. Examine amostras usando um microscópio óptico composto (campo claro) com ampliação total de 100×–400× (10× ocular com 10×–40× objetivos).
   3. Documente diferenças entre culturas adaptadas e do tipo selvagem em relação à motilidade, frequência de cistos e morfologia celular geral.

6. Monitoramento do pH

1. Coletar amostras de pH
   1. Nos dias 0, 3, 6, 9 e 12, retire-se assepticamente 1 mL de cultura de cada condição experimental usando pontas de pipeta estéreis.
   2. Deixe as amostras permanecerem intocadas por 2 minutos para permitir o assentamento dos sólidos suspensos.
   3. Transfira cuidadosamente o sobrenadante clarificado para um tubo de microcentrífuga limpo sem perturbar o material sedimentado.
2. Meça o pH
   1. Calibre o medidor de pH conforme as instruções do fabricante usando buffers padrão apropriados antes da medição.
   2. Insira a sonda de pH calibrada no sobrenadante clarificado sem perturbar nenhum material residual sedimentado.
   3. Registre os valores de pH imediatamente após a leitura estabilizar.
   4. Enxágue a sonda cuidadosamente com água desionizada entre as amostras para evitar contaminação cruzada.

7. Teste de Cianeto usando Tiras Colorimétricas

ATENÇÃO: Os sobrenadantes contendo cianeto são perigosos. Realize todas as etapas de amostragem e teste em uma exaustão química ou em uma área bem ventilada. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e proteção ocular. Evite contato direto com a pele com amostras e tiras de teste e descarte tiras usadas e resíduos líquidos conforme as diretrizes institucionais de descarte de resíduos químicos perigosos.

1. Coletar amostras de cianeto
   1. Nos dias 0, 4, 8 e 12, retire-se asépticamente 1 mL de sobrenadante de cultura de cada condição experimental usando pontas de pipeta estéreis.
   2. Deixe as amostras permanecerem intocadas por 2 minutos para permitir o assentamento dos sólidos suspensos.
   3. Colete cuidadosamente o sobrenadante clarificado, sem perturbar o material particulado.
2. Realize um ensaio colorimétrico com cianeto.
   1. Imerga um teste de fita de teste de cianeto colorimétrico no sobrenadante clarificado durante a duração especificada pelo fabricante.
   2. Remova a tira e permita o revelado completo da cor pelo tempo recomendado em condições ambientes.
   3. Compare a tira desenvolvida com a escala de referência fornecida pelo fabricante para determinar a concentração de cianeto.
3. Níveis recordes de cianeto
   1. Registre as concentrações de cianeto para cada amostra em todos os momentos de acordo com a escala de referência.
   2. Fotografe cada tira de teste desenvolvida ao lado da escala de referência ou mantenha a tira conforme as recomendações do fabricante para verificação futura.

8. Manutenção e consolidação de culturas adaptadas de E. gracilis

1. Combinar culturas adaptadas
   1. Após adaptação bem-sucedida em concentrações de mandioca de ≥40 ^gL-1 garri, confirma-se visualmente a presença de células viáveis de E. gracilis em cada cultura replicada.
   2. Combine suavemente todos os frascos replicados da linhagem adaptada em um único vaso estéril usando técnica asséptica para gerar uma cultura mestre homogênea.
2. Preparar o meio de manutenção
   1. Prepare meios frescos à base de mandioca na concentração de manutenção selecionada seguindo os procedimentos descritos no Método 1.
   2. Selecione mídias autoclavadas ou não autoclavadas com base nos requisitos experimentais posteriores.
   3. Mantenha a mesma condição de esterilização em todas as passagens subsequentes para garantir consistência na exposição microbiana.
3. Inocular culturas de manutenção
   1. Inocular meios de manutenção frescos com 20% (v/v) da cultura mestre consolidada.
   2. Misture suavemente as culturas por meio de um movimento manual para distribuir as células uniformemente sem induzir tensão de cisalhamento.
   3. Incubar culturas em completa escuridão a 25 °C com agitação orbital contínua a 120 x g para manter condições de crescimento heterotrófico.
4. Realizar manutenção rotineira e passaging
   1. Mantenha as culturas por inversão manual suave uma vez ao dia para evitar sedimentação prolongada das células e do material do substrato.
   2. A cada 30 dias, consolide culturas de manutenção combinando frascos replicados usando técnica asséptica.
   3. Reinocule meios de manutenção frescos usando a cultura consolidada, conforme descrito na Seção 8.3.
5. Monitorar a estabilidade da cultura
   1. Em cada passagem, avalie a morfologia e motilidade celular usando um microscópio de luz composto (campo claro) com ampliação total de 100×–400× (10× ocular com 10×–40× objetivos).
   2. Mudanças recordes para aumento do enquisto, acúmulo de detritos celulares ou redução da motilidade como indicadores de diminuição da estabilidade da cultura.

9 Colheita de Biomassa para Análise de Proteínas a Jusante

1. Coletar amostras de cultura
   1. No ponto final desejado, transfira os volumes de cultura para tubos centrífugas estéreis.
   2. Certifique-se de que as amostras sejam representativas da cultura completa, misturando suavemente os frascos antes da transferência.
2. Colheita de biomassa por centrifugação
   1. Centrifuge amostras a ≥3.500 × g por 10 minutos para pelletar a biomassa. Repita essa etapa se o sedimento ainda não tiver se assentado completamente.
   2. Confirme a formação de um pellet de célula compacta no fundo do tubo.
3. Remover o sobrenadante
   1. Decante cuidadosamente ou faça uma pipeta para remover o sobrenadante sem mexer na bola.
   2. Descarte o supernadante conforme os protocolos de resíduos laboratoriais.
4. Preparar biomassa para análise a jusante
   1. Guarde o pellet celular para processamento posterior (por exemplo, secagem, armazenamento ou análise de proteínas).
   2. Se não for processado imediatamente, armazene os pellets a 4 °C para uso de curto prazo ou congele conforme apropriado para armazenamento prolongado.

10. Manuseio e Arquivamento de Dados

1. Organize o conjunto de dados
   1. Insira todas as medições quantitativas, incluindo pH, concentração de cianeto, avaliações de viabilidade, contagem celular e valores de biomassa, em uma planilha eletrônica rotulada.
   2. Salve imagens de microscopia e notas observacionais associadas usando nomes de arquivos padronizados que indicam tipo de substrato, concentração, identidade da deformação, número de replicação e data de amostragem (por exemplo, 25-01-NAG40G_WT1_05).
2. Preparar conjuntos de dados para análise
   1. Verifique se todas as réplicas experimentais e os pontos de tempo programados estão representados e completos dentro do conjunto de dados.
   2. Digitalize quaisquer anotações manuscritas de laboratório e faça backup de todos os arquivos eletrônicos para armazenamento seguro e evitar perda de dados. A análise de dados e a geração de figuras foram realizadas usando software de planilha (Microsoft Excel) e, quando aplicável, R (R Foundation for Statistical Computing). Todas as análises principais podem ser reproduzidas usando cálculos baseados em planilhas, com R sendo usado apenas para visualização suplementar.

Resultados

Os seguintes resultados representativos ilustram os desfechos esperados quando o protocolo descrito é aplicado com sucesso, bem como a gama de desfechos observados sob condições subótimas. Dados representativos correspondentes a esses resultados são mostrados nas Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. Juntos, esses resultados fornecem orientações práticas para interpretar dinâmicas de crescimento, viabilidade, morfologia e resultados proteicos ao adaptar E. gracilis a substratos à base de mandioca sob condições de cultivo heterotróficas e totalmente escuras. Além disso, esses resultados validam os principais resultados biológicos do protocolo, incluindo adaptação bem-sucedida, crescimento sustentado, alta viabilidade, morfologia estável, desempenho consistente entre substratos e produção mensurável de proteínas.

Ao longo dos experimentos, foram utilizados três réplicas por tratamento (todos os tipos de meios de mandioca). Reconhecemos que o número de réplicas depende da discricionariedade e das limitações logísticas de qualquer grupo que siga os protocolos acima. A aplicação bem-sucedida desse protocolo resulta em crescimento heterotrófico sustentado de E. gracilis em meios baseados em garri sob condições totalmente escuras. Desfechos positivos são caracterizados por trajetórias de crescimento suaves e sigmoidais, divergência limitada entre réplicas e densidades celulares estáveis em fase tardia. Características morfológicas que indicaram resultados positivos e foram consistentemente observadas em populações adaptadas incluíram arredondamento celular e membranas celulares espessas. Em contraste, células colapsadas não saudáveis tipicamente aparecem irregulares, fragmentadas ou estruturalmente comprometidas e estão associadas à viabilidade reduzida, distinguindo-as das formas intactas, arredondadas ou semi-encistadas observadas em culturas adaptadas. Para referência, imagens representativas de E. gracilis do tipo selvagem exibindo morfologia alongada característica são incluídas (Figura 8) para distinguir a estrutura celular de base das formas adaptadas ou alteradas. Culturas cultivadas com 30 g de ^L-1 garri apresentaram crescimento integrado mais alto, medido pela área sob a curva de crescimento (AUC), em comparação com concentrações menores, sugerindo uma utilização mais eficiente do substrato da mandioca e uma adaptação fisiológica bem-sucedida (Figura 1).

Desfechos subótimos são comumente observados em concentrações de garri mais baixas (10–20 g ^L-1), onde o crescimento é detectável, mas reduzido em magnitude e mais variável entre as réplicas. Em concentrações mais altas (40–50 g ^L-1), as culturas podem atingir densidades celulares de pico elevadas; no entanto, essas condições frequentemente apresentam estabilização tardia ou aumento da variabilidade temporal (Figura 2).

Em experimentos bem-sucedidos, a viabilidade celular permanece alta durante todo o período de cultivo, com apenas pequenas flutuações no meio do experimento. Ensaios de exclusão com Tripan Blue indicam que culturas mantidas a 30 g de ^L-1 garri mantêm uma alta proporção de células viáveis (não coradas) em relação às não viáveis (coloridas de azul) em pontos de tempo amostrados (Figura 3). Desvios desse padrão, incluindo maior proporção de células coloridas, motilidade reduzida ou deslocamentos para morfologias arredondadas ou colapsadas, podem indicar condições subótimas e servir como gatilhos precoces para a resolução de problemas. As avaliações de viabilidade e morfológicas foram baseadas em critérios observacionais consistentes, incluindo integridade celular, motilidade direcional e prevalência relativa de formas alongadas versus arredondadas ou colapsadas.

Resultados subótimos são caracterizados por reduções transitórias na viabilidade, mais comumente observadas em concentrações de garri mais altas. Recuperação parcial pode ser observada em momentos posteriores; no entanto, essas condições apresentam maior variabilidade na viabilidade ao longo do período de cultivo (Figura 4). Esses padrões de crescimento mostram que concentrações intermediárias de substrato (por exemplo, 30 g ^L-1) fornecem um equilíbrio entre disponibilidade de nutrientes e estresse, resultando em um crescimento mais estável. Essas tendências refletem o impacto das condições de pré-processamento e da adaptação em etapas no desempenho da cultura, já que a exposição gradual ao aumento da complexidade do substrato apoia a melhor estabilidade fisiológica e o comportamento de crescimento reproduzível. Concentrações mais baixas limitam a produção de biomassa, enquanto concentrações mais altas levam a maior variabilidade e estabilização atrasada.

A avaliação morfológica fornece um indicador qualitativo do status de adaptação. Desfechos positivos incluem o surgimento e persistência de células arredondadas ou semi-encistadas com motilidade reduzida que permanecem intactas após subculturas repetidas (Figura 5).

Em contraste, culturas subótimas, mais associadas a cepas selvagens ou adaptação em estágio inicial, apresentam transições abruptas de células alongadas e móveis para morfologias irregulares ou colapsadas que coincidem com redução da estabilidade do crescimento.

Quando o protocolo é aplicado a substratos derivados de mandioca adicionais, incluindo polpa, pellets e cascas, culturas adaptadas de E. gracilis apresentam crescimento reprodutível em múltiplos tipos de substrato. Os resultados positivos são caracterizados por estabilização precoce das curvas de crescimento e redução do declínio em estágio tardio em relação às culturas do tipo selvagem (Figura 6).

Desfechos subótimos incluem atraso no início do crescimento ou aumento da variabilidade replicada, especialmente em substratos com maior heterogeneidade física.

A implementação bem-sucedida do protocolo gera biomassa de E. gracilis com teor mensurável de proteína bruta, conforme quantificado por análise laboratorial externa usando o método de Combustão (Dumas). As porcentagens de proteína observadas em culturas adaptadas são comparáveis às medidas em culturas selvagens, com maior produção total de proteínas correspondente ao aumento do acúmulo de biomassa (Figura 7).

O monitoramento da química dos meios apoiou as interações cultura–substrato durante a adaptação e validou a inclusão de medições de pH e cianeto no protocolo. Os valores de pH apresentaram mudanças graduais ao longo do tempo, indicando atividade metabólica e utilização do substrato, com tendências mais estáveis em culturas adaptadas. Medições com cianeto reforçaram ainda mais isso, já que culturas adaptadas mostraram reduções nos níveis detectáveis, enquanto culturas selvagens permaneceram mais variáveis. Juntos, esses resultados demonstram que essas etapas de monitoramento capturam efetivamente mudanças na química da mídia associadas à adaptação e apoiam a interpretação do desempenho cultural. Embora os mecanismos subjacentes não tenham sido investigados, isso representa uma área importante para pesquisas futuras, especialmente para aplicações em escala industrial.

O fluxo de trabalho de manutenção e consolidação de longo prazo apoiou a viabilidade contínua da linhagem adaptada de Euglena gracilis ao longo de períodos prolongados de cultura. Culturas mantidas por passagens repetidas mantiveram consistentemente motilidade, morfologia característica e comportamento de crescimento estável ao longo dos ciclos de manutenção. Embora o desempenho a longo prazo não tenha sido avaliado quantitativamente, essas observações fornecem evidências representativas de que a linhagem adaptada pode ser mantida de forma confiável sob as condições especificadas.

Juntos, esses resultados confirmam que o protocolo de adaptação suporta crescimento robusto, viabilidade e produção de biomassa de E. gracilis em substratos à base de mandioca, com desempenho consistente e níveis reduzidos de cianeto ao longo do tempo.

Todas as figuras e tabelas são fornecidas como arquivos separados e não estão incorporadas ao documento manuscrito. Preferências de posicionamento de figuras e tabelas são indicadas no texto do manuscrito usando notas entre parênteses (por exemplo, (Figura 1)). Salvo especificação em contrário, todos os números e tabelas devem aparecer abaixo da seção de Resultados Representativos na publicação final.

Todas as figuras são enviadas como arquivos individuais, com figuras multipainel fornecidas como uma única imagem combinada. Imagens de microscopia incluem barras de escala em cada painel. As figuras de dados incluem eixos rotulados com unidades de medição definidas, e barras de erro são especificadas nas legendas correspondentes das figuras.

Todas as tabelas são enviadas como arquivos individuais .xls ou .xlsx e contêm dados numéricos brutos ou resumidos, sem formatação decorativa.

Figura 1: Dinâmica de crescimento de E. gracilis cultivada com 10, 20 e 30 gL-1 garri sob condições totalmente escuras. Densidades médias de células são mostradas ao longo do tempo para cada concentração de substrato. Barras de erro representam o SEM entre réplicas biológicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Desempenho de crescimento de E. gracilis em concentrações elevadas de garri (30–50 g ^L-1). Trajetórias de densidade celular ilustram diferenças na densidade máxima, no momento de estabilização e na variabilidade entre concentrações mais altas de substrato. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Tendências de viabilidade celular de E. gracilis cultivadas em 30 gL-1 garri medidas por exclusão de Trypan Blue. A proporção de células viáveis é mostrada em pontos de tempo amostrados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Flutuações de viabilidade de E. gracilis cultivadas em concentrações maiores de garri. Mudanças transitórias na viabilidade celular são mostradas ao longo do período experimental. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Morfologia representativa de populações adaptadas de E. gracilis . Imagens representativas da microscopia de luz invertida mostram células arredondadas e semi-incisadas observadas após a adaptação. Barra de escala = XX μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Desempenho de crescimento de E. gracilis adaptado e selvagem em substratos derivados da mandioca. Trajetórias de crescimento são mostradas para culturas adaptadas e silvestres cultivadas em múltiplos produtos de mandioca. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Conteúdo de proteína bruta e produção total de proteína da biomassa de E. gracilis cultivada em mandioca. O teor de proteína foi quantificado por análise externa usando o método de Combustão SGS (Dumas). A produção total de proteínas é mostrada junto com o acúmulo de biomassa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Morfologia representativa do tipo selvagem de E. gracilis sob condições padrão (ampliação 40X). Imagem representativa de Euglena gracilis saudável e não adaptada, mostrando morfologia alongada característica sob microscopia óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Um determinante central do sucesso neste protocolo é o equilíbrio entre a concentração do substrato de mandioca e a estabilidade fisiológica durante o cultivo heterotrófico de E. gracilis. Materiais derivados da mandioca introduzem heterogeneidade física, partículas residuais e cinética variável de liberação de nutrientes que influenciam diretamente o comportamento de crescimento e a estabilidade da cultura ^2,3. Entre as etapas do protocolo, a preparação do substrato e a seleção de concentração representam, portanto, os pontos de controle mais sensíveis. Como demonstrado pelos Resultados Representativos, as concentrações intermediárias de substrato sustentam de forma confiável o crescimento sustentado com divergência replicada limitada, enquanto concentrações mais baixas limitam o acúmulo de biomassa e concentrações mais altas aumentam a variabilidade temporal e as respostas de estresse transitório. Esses resultados ressaltam que a carga máxima do substrato não necessariamente proporciona desempenho ótimo ou estável no cultivo ao trabalhar com materiais agroindustriais heterogêneos. As etapas selecionadas de pré-processamento e as faixas de concentração do substrato foram projetadas para desafiar progressivamente E. gracilis sob crescente complexidade química e microbiana. As diferenças observadas na estabilidade e viabilidade do crescimento entre essas condições apoiam a validade dessa abordagem em etapas e confirmam que as concentrações intermediárias de substrato proporcionam um equilíbrio entre a disponibilidade de nutrientes e o estresse fisiológico.

O manuseio da cultura durante o crescimento heterotrófico influencia ainda mais os resultados de adaptação. A mistura consistente, porém suave, sob condições totalmente escuras, foi fundamental para manter o contato entre as células de E. gracilis e o material do substrato suspenso, evitando estresse de cisalhamento excessivo. Mistura insuficiente promoveu sedimentação e gradientes de nutrientes localizados, confundindo tanto as medições de crescimento quanto de viabilidade, especialmente em meios não^{autoclavados 12}. Essas observações estão alinhadas com relatórios anteriores que mostraram que a heterogeneidade espacial e a exposição desigual ao substrato podem obscurecer respostas fisiológicas em sistemas de cultivo microbiano. Portanto, o protocolo enfatiza a inversão rotineira em vez da agitação contínua como um compromisso prático entre homogeneidade e integridade cultural.

Para acomodar a variabilidade inerente aos substratos baseados em mandioca, o protocolo incorpora múltiplos pontos de solução de problemas e flexibilidade. A autoclavização de meios de mandioca fermentados melhorou a consistência de curto prazo ao reduzir a carga microbiana e alterar a estrutura do substrato, especialmente durante os estágios iniciais de adaptação. Em contraste, meios não autoclavados podem ser usados de forma eficaz após adaptação bem-sucedida, desde que a densidade e a mistura do inoculo sejam suficientes para manter o crescimento estável. Essa abordagem em etapas é consistente com estudos anteriores que demonstram que a pressão seletiva gradual permite que populações microbianas tolerem a crescente complexidade ambiental ao longo do^{tempo 13,14}. O monitoramento longitudinal foi essencial nesse contexto, pois reduções transitórias no crescimento ou viabilidade frequentemente se recuperavam durante passagens subsequentes sem comprometer o sucesso geral da adaptação.

Ensaios de viabilidade e monitoramento morfológico serviram como ferramentas diagnósticas rápidas durante todo o processo de adaptação. A exclusão do Trypan Blue forneceu um indicador quantitativo de robustez fisiológica, enquanto a avaliação de motilidade e cistarização baseada em microscopia forneceu alerta precoce para condições subótimas, como carga excessiva do substrato ou aclimatação^{tardia 15}. Importante, o protocolo enfatiza tendências ao longo do tempo, em vez de medições em ponto único, já que flutuações de curto prazo na viabilidade ou morfologia nem sempre foram preditivas de falha cultural a longo prazo. Essa perspectiva longitudinal mostrou-se fundamental para distinguir respostas transitórias ao estresse do declínio fisiológico sustentado. Reduções nos níveis detectáveis de cianeto observadas durante o cultivo sugerem desintoxicação parcial de substratos derivados da mandioca sob as condições descritas. Essas reduções podem resultar de uma combinação de degradação associada à fermentação, volatilização e atividade microbiana. Embora os mecanismos bioquímicos específicos e a cinética da remoção do cianeto não tenham sido diretamente investigados neste estudo, essas observações apoiam a inclusão do monitoramento do cianeto como um indicador prático da transformação do substrato e da viabilidade da cultura durante a adaptação.

Várias limitações do método devem ser reconhecidas. Primeiro, a porcentagem de proteína bruta sozinha não captura totalmente o valor nutricional ou a qualidade funcional da proteína, e a interpretação deve considerar a produção total de biomassa junto com métricas^{composicionais 16}. Segundo, o uso de substratos minimamente processados e heterogêneos introduz variabilidade que não pode ser eliminada, mesmo com preparação padronizada. Esse desafio é bem reconhecido no bioprocessamento agroindustrial¹⁷ e reflete restrições do mundo real, e não deficiências experimentais. Terceiro, embora o protocolo seja otimizado para cultivo em laboratório e em escala piloto, a ampliação além dos volumes em escala de laboratório exigirá controle adicional da dinâmica de mistura, transferência de oxigênio e manuseio de sólidos, bem como consideração da configuração do reator e das condições hidrodinâmicas, como já foi demonstrado para outros sistemas microalgais e^{protistas 18}.

Em comparação com métodos existentes de cultivo de E. gracilis que dependem de açúcares refinados ou sistemas fototróficos rigidamente controlados, esse protocolo oferece uma vantagem metodológica distinta ao permitir o crescimento em substratos derivados da mandioca de baixo custo sob condições totalmente heterotróficas. A abordagem evita a dependência de fontes de carbono^{purificado 19,20} e não requer infraestrutura especializada de iluminação, ampliando a flexibilidade operacional do cultivo de E. gracilis. Isso é particularmente relevante para aplicações focadas em eficiência de recursos, valorização de resíduos e produção descentralizada em regiões produtoras de mandioca.

A importância mais ampla desse método está em sua aplicabilidade a áreas de pesquisa focadas em adaptação microbiana, bioprocessamento sustentável e valorização da biomassa. Ao combinar a exposição incremental de substratos com ferramentas simples e de baixo custo de monitoramento, o protocolo fornece uma estrutura reprodutível para integrar substratos não tradicionais nos fluxos de trabalho de cultivo microbiano. Embora desenvolvidos para E. gracilis, os princípios subjacentes de adaptação em etapas, avaliação longitudinal de desempenho e tomada de decisão informada pela morfologia são amplamente transferíveis para outros sistemas microalgais e protistas explorados para aplicações em bioeconomia^{circular 21,22}. Assim, esse protocolo serve não apenas como método de cultivo, mas também como um arcabouço generalizável para adaptação microbiana aplicada sob restrições reais do substrato do mundo real. Esse método foi projetado com acessibilidade como objetivo principal e, portanto, é mais adequado para laboratórios ou ambientes de pesquisa aplicada com infraestrutura microbiológica básica e acesso a recursos biológicos essenciais, especificamente culturas de Euglena gracilis e substratos derivados da mandioca. Além disso, o sistema oferece flexibilidade temporal, já que meios à base de mandioca podem ser preparados e fermentados durante todo o ano sem restrições sazonais. Embora esse protocolo tenha sido desenvolvido e validado em escala laboratorial, seu uso de substratos derivados de mandioca de baixo custo e requisitos mínimos de processamento apoiam a escalabilidade potencial para sistemas de cultivo maiores.

Embora esse protocolo estabeleça uma estrutura reprodutível para adaptação e cultivo, análises quantitativas adicionais da cinética de crescimento, produtividade da biomassa e eficiência de conversão de substratos serão importantes para otimizar o desempenho em aplicações em escala ou industriais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Autoclave - 533LS Steam Sterilizer	Getinge	533LS	Esterilização a vapor de meios de mandioca. Esterilize os meios usando o ciclo líquido.
Bright-Line™ Hemacitômetro substituição lâmina de cobertura	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Lâminas de cobertura espessas especializadas projetadas para uso em hemacitômetro.
Polpa seca de mandioca	Psaltry International	N/A	Substrato de mandioca fornecido
Pellets de mandioca	Psaltry International	N/A	Substrato de mandioca fornecido
Descascar mandioca	Psaltry International	N/A	Substrato de mandioca fornecido
Mandioca substrato (garri)	Fornecedor local	N/A	Garri derivado de mandioca usado como fonte de carbono preparado com água desmineralizada.
Centrífuga Thermo Scientific Sorvall Centrífuga ST16	Thermo Scientific Sorvall Centrífuga ST16	75004241	Capaz de ≥ 3.500 × g, usada para colheita de biomassa.
Tubos de centrífuga Ex. Axygen (A Marca Corning)	Corning	MCT-150-C-S	Estéreo, volume mínimo de 1,5 mL
Água limpa Ex. UltraPure™ Água Destilada Livre de DNase/RNase	ThermoFisher Scientific	10977035	Desmineralizada ou destilada. Usada na preparação do meio
Microscópio de luz composta	Olympus	N/A	Microscópio composto padrão adequado para observação e contagem de células de rotina.
Teste de cianeto Tiras, colorimétrico. CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	Detecção semi-quantitativa de cianeto. Descarte como resíduo perigoso
Barco de pesagem padrão estéril	Fisher Scientific	01-549-750	Usado para pesar substratos de mandioca e biomassa seca.
Euglena gracilis (linhagem adaptada )	N/A	N/A	Cepa adaptada à mandioca gerada neste estudo
Euglena gracilis (Tipo selvagem)	N/A	N/A	Cepa de referência não adaptada. Mantenha as mesmas condições padrão.
Componentes do meio de crescimento de Euglena	Vários	N/A	Meio basal de Euglena preparado de acordo com formulações padrão do laboratório.
Secador de congelamento FreeZone 6 Litros Console	Labconco	70061xxxx	Usado para desidratação de biomassa
Hemacitômetro com Linhas Padrão	Weber Scientific	NC1587539	Usado para contagem manual de células.
Agitador magnético com placa quente	IKA	N/A	Opcional; melhora a consistência durante a preparação do meio e suspensão do substrato.
Micropipetas (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Pipetas de volume ajustável usadas para transferências assépticas de líquidos.
Minicentrífuga	Eppendorf	N/A	Opcional; facilita a rápida sedimentação durante a colheita de biomassa.
Parafilm	Bemis	PM996	Usado para selagem temporária de frascos ou placas quando tampas ventiladas não estiverem disponíveis.
Faixas indicadoras de pH	Fisher Scientific	13-640-520	Alternativa ao medidor de pH para avaliação qualitativa rápida do meio de cultura.
Medidor de pH com sonda Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de bancada	Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de bancada	13-645-519	Calibrado antes do uso. Para medir o pH do sobrenadante da cultura
Armazenamento refrigerado (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Armazenamento de curto prazo de meios
Incubadora de agitação (escuro)	Thermolyne	M49235	Incubadora de agitação orbital capaz de 100-150 RPM, faixa de temperatura 24-28 °C; usado em condições escuras para suportar o crescimento heterotrófico de Euglena.
Frasco de spray (32 oz)	Boardwalk	BWK03010	Usado para esterilização de bancada e manuseio asséptico de rotina (solução de etanol a 70%)
Software de planilha	Microsoft Excel	N/A	Coleta, organização e análise de dados
Pontas de pipeta estéreis	Eppendorf	N/A	Pontas estéreis descartáveis compatíveis com pipetas P20, P200 e P1000.
Pipetas serológicas estéreis (5, 10, 25 mL)	Corning	N/A	Pipetas estéreis individualmente embrulhadas usadas para transferências de cultura e amostragem.
Solução de Azul de Tripano 0,4%, líquido, estéril filtrada, adequada para cultura celular	Sigma-Aldrich	T8154	Corante vital usado para avaliação de viabilidade celular por meio do ensaio de exclusão de Azul de Tripano.
Tubos para coleta de amostras (50 mL)	Falcon	14-432-22	Para amostragem de pH e cianeto
Flascos Erlenmeyer com tampa de ventilação (250-500 mL)	Corning® 250 mL Policarbonato Erlenmeyer Flask com Tampa de Ventilação	431144	Flascos Erlenmeyer de policarbonato com tampas ventiladas; autoclavável; usado para culturas líquidas estéreis e não estéreis.
Recipientes de resíduos	Vários - em conformidade com os padrões laboratoriais estabelecidos	N/A	Sacos de autoclave e recipientes de resíduos de materiais cortantes ou vidro para descarte compatível com biossegurança.