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Artigo de investigação
Este estudo retrospectivo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível para coleta precoce de sangue pós-internação, medição de citocinas séricas e receptores Toll-like, genotipagem de polimorfismos gênicos inflamatórios e avaliação de risco de infecção em pacientes com hemorragia intracerebral espontânea.
A infecção pulmonar nosocomal é uma complicação frequente após hemorragia intracerebral espontânea e pode piorar a recuperação neurológica, prolongar hospitalizações e aumentar a carga clínica. Este estudo clínico-laboratorial retrospectivo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível para avaliar perfis inflamatórios de biomarcadores e imunogenéticos do hospedeiro associados à infecção pulmonar nosocomal após hemorragia intracerebral espontânea primária. Os pacientes são classificados de acordo com a infecção pulmonar nosocomal ocorrer após a internação. O sangue venoso periférico é coletado no início do período pós-admissão sob condições pré-analíticas padronizadas. O soro é separado, aliquotado e armazenado para medição de ensaio imunossorvente ligado a enzimas de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 e TLR9. Paralelamente, o DNA genômico é extraído do sangue total anticoagulado e utilizado para a genotipagem de polimorfismo de fragmentos de reação em cadeia da polimerase de loci selecionados relacionados a receptores de citocinas e do tipo Toll. O fluxo de trabalho também inclui procedimentos de controle de qualidade para manuseio de amostras, medições ELISA duplicadas, avaliação da pureza do DNA, chamada de genótipo e genotipagem repetida. A análise estatística inclui comparação entre grupos de características clínicas e níveis de biomarcadores, teste de equilíbrio Hardy-Weinberg, análise de regressão logística para associações genótipo e alel, ajuste para covariáveis clínicas relevantes e correção por taxa de falsa descoberta para múltiplas comparações genéticas. Esse fluxo de trabalho combinado clínico, inflamatório e imunogenético pode ajudar a caracterizar perfis de risco de infecção após hemorragia intracerebral espontânea, embora validação multicêntrica prospectiva ainda seja necessária antes da aplicação clínica rotineira.
A hemorragia intracerebral espontânea (ICH) é um subtipo grave de AVC causado por ruptura não traumática dos vasos cerebrais e continua sendo uma fonte importante de morte e incapacidade neurológica. Clinicamente, a PCI é comumente classificada como primária ou secundária. A ICH primária explica a maioria dos casos e está principalmente relacionada à arteriopatia hipertensiva ou angiopatia amiloidecerebral 1. Por outro lado, a ICO secundária está associada a causas estruturais ou hematológicas, incluindo aneurismas, malformações arteriovenosas, doença de Moyamoya e distúrbios da coagulação. Embora o ICO represente uma proporção menor de todos os eventos de AVC do que o AVC isquêmico, ele carrega desproporcionalmente alta mortalidade de curto prazo e carga funcionalde longo prazo 2,3,4,5.
Entre as principais complicações hospitalares após a PCI, a infecção pulmonar nosocomial é particularmente frequente e clinicamente relevante. Estudos anteriores mostraram que infecção pulmonar pode ocorrer em uma proporção substancial de pacientes hospitalizados após AVC ou hemorragia intracerebral e está associada a hospitalizações mais longas, maior carga médica, recuperação neurológica menor e aumento damortalidade 6,7,8. A importância clínica dessa complicação vai além do manejo respiratório apenas. Consciência reduzida, reflexos de deglutição e tosse prejudicados, imobilização, suporte mecânico das vias aéreas e procedimentos invasivos de drenagem podem aumentar o risco de infecção durante a fase aguda após a ICH. Ao mesmo tempo, a infecção pulmonar pode agravar ainda mais a inflamação sistêmica, prejudicar o fornecimento de oxigênio e complicar os cuidados neurocríticos, amplificando assim os processos de lesões secundárias.
Essa relação é biologicamente plausível porque a ICH não é apenas um evento cerebral focal, mas também um gatilho de desregulação imunológica sistêmica. A hemorragia cerebral aguda pode ativar cascatas inflamatórias, alterar a sinalização imune inata e perturbar o equilíbrio entre a neuroinflamação e a defesa periférica do hospedeiro. Nesse contexto, alguns pacientes podem se tornar mais suscetíveis a infecções hospitalares mesmo sob manejo clínico semelhante. Portanto, a infecção pulmonar após CHI não deve ser vista apenas como consequência de exposição ao leito ou cuidados de suporte; Também pode refletir diferenças na ativação inflamatória do hospedeiro e na resposta imunológica.
Apesar da relevância clínica dessa complicação, abordagens práticas para estratificação precoce de risco permanecemlimitadas 9. As abordagens clínicas existentes de estratificação de risco para infecção pulmonar pós-ICH geralmente dependem de variáveis relacionadas ao leito do leito e à admissão, como gravidade neurológica, idade, comprometimento na deglutição, comorbibilidades, procedimentos invasivos e duração da exposição do dispositivo. Essas ferramentas são clinicamente úteis porque podem ser aplicadas rapidamente em emergências, cuidados intensivos ou cuidados neurocríticos. No entanto, as variáveis clínicas isoladamente podem não explicar totalmente por que pacientes com gravidade neurológica comparável e exposição a cuidados semelhantes apresentam desfechos de infecção diferentes. Biomarcadores inflamatórios e fatores imunogenéticos do hospedeiro podem, portanto, fornecer informações adicionais sobre suscetibilidade biológica, especialmente durante o período inicial pós-internação, quando estão sendo tomadas decisões de vigilância preventiva e manejo respiratório.
As citocinas são mediadoras centrais das respostas imunes e inflamatórias, e as vias do receptor tipo Toll (TLR) desempenham papéis-chave no reconhecimento de patógenos e na ativação imune inata. Medições de citocinas séricas e proteínas TLR podem fornecer um retrato da ativação inflamatória sistêmica precoce, enquanto polimorfismos genéticos imunes selecionados podem refletir diferenças mais estáveis no hospedeiro na produção de citocinas, sinalização dos receptores ou regulação inflamatória. Comparado apenas à avaliação clínica, um fluxo de trabalho combinado de biomarcadores e polimorfismo pode capturar tanto o estado inflamatório atual quanto a resposta imune subjacente de cada paciente. Essa abordagem não tem como objetivo substituir a avaliação clínica à beira do leito, mas complementá-la adicionando informações laboratoriais e genéticas do hospedeiro que possam ajudar a identificar pacientes que justificam uma vigilância mais próxima da infecção após uma ICH espontânea.
Com base nisso, hipotetizamos que pacientes com PCI espontânea que desenvolvem infecção pulmonar nosocomal apresentariam um perfil inflamatório distinto, juntamente com uma distribuição diferente de polimorfismos genéticos relacionados ao sistema imunológico selecionados em comparação com pacientes que permanecem livres de infecção. Para testar essa hipótese, o presente estudo clínico-laboratorial retrospectivo analisou citocinas séricas pós-admissão precoce, níveis de proteínas séricas de TLR2, TLR4 e TLR9, e selecionou polimorfismos inflamatórios em genes em pacientes com CHI espontânea primária. O fluxo de trabalho utiliza sangue periférico coletado durante hospitalização aguda, quantificação de proteínas baseada em ELISA, genotipagem baseada em PCR-RFLP e comparação estatística entre pacientes com e sem infecção pulmonar nosocomial. O objetivo era fornecer uma estrutura reprodutível para caracterizar perfis inflamatórios e genéticos do hospedeiro associados ao risco de infecção, apoiando assim o reconhecimento precoce de pacientes de alto risco no ambiente hospitalar agudo.
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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Universidade de Jiaxing, Primeiro Hospital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China (Aprovação nº 2025-LP-599). Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram conduzidos de acordo com os requisitos institucionais e os princípios da Declaração de Helsinque. Consentimento informado por escrito para coleta de sangue e uso de dados foi obtido de todos os participantes e/ou seus representantes legalmente autorizados antes da coleta da amostra.
Todos os kits comerciais, reagentes, consumíveis, instrumentos, softwares, fabricantes, números de catálogo e especificações operacionais chave usados nesse fluxo de trabalho estão listados na Tabela de Materiais.
Escopo do estudo, elegibilidade e agrupamento de pacientes
Este estudo foi conduzido como uma análise retrospectiva de coorte clínica e laboratorial em um único centro de pacientes com hemorragia intracerebral espontânea primária (ICH) internados no Centro de Emergência e Terapia Intensiva ou na Unidade de Terapia Intensiva do Hospital Afiliado da Universidade de Jiaxing, o Primeiro Hospital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China, entre maio de 2019 e setembro de 2024. O diagnóstico de ICH foi confirmado por tomografia computadorizada craniana ou ressonância magnética, de acordo com as Diretrizes Chinesas para Diagnóstico e Tratamento de Hemorragia Cerebral (2019)10.
Os pacientes eram elegíveis se apresentassem ICHs primárias espontâneas confirmadas por imagem, fossem admitidos em até 3 dias após o início dos sintomas e tivessem variáveis clínicas completas, além de amostras periféricas de sangue disponíveis para medição de biomarcadores inflamatórios e análise genética. Os pacientes foram excluídos se apresentassem hemorragia intracraniana traumática, IC secundária, infecção pulmonar presente antes da internação ou dentro de 48 horas após a admissão, alta contra recomendação médica ou morte dentro de 48 horas após a admissão, histórico de malignidade ou doença autoimune, ou registros clínicos, laboratoriais ou genotipados incompletos. Após o rastreamento, 360 pacientes atenderam aos critérios de elegibilidade e foram incluídos na análise final. Entre eles, 180 pacientes desenvolveram infecção pulmonar nosocomial durante a hospitalização, e 180 não. Os pacientes foram designados para o grupo de infecção pulmonar ou para o grupo sem infecção pulmonar com base em se uma infecção pulmonar nosocomal ocorreu após a internação.
Antes do agrupamento final, foram verificados diagnósticos por imagem, momento de internação, momento da infecção, disponibilidade de amostras de sangue e completude dos registros clínicos e laboratoriais. Essa etapa foi usada para reduzir a classificação incorreta e garantir que todos os casos incluídos tivessem dados completos para comparação clínica, medição de biomarcadores inflamatórios e genotipagem.
Definição de infecção pulmonar nosocomial
A infecção pulmonar nosocomal foi definida com base em evidências radiológicas combinadas com critériosclínicos 11. A confirmação radiológica exigiu uma nova ou progressiva lesão infiltrativa, consolidativa ou vidro espoliado na radiografia torácica ou tomografia computadorizada. Além disso, pelo menos dois dos seguintes critérios deveriam estar presentes: temperatura corporal > 38 °C, secreções respiratórias purulentas ou contagem anormal de glóbulos brancos periféricos com glóbulos brancos < 4 × 109/L ou > 10 × 109/L.
Infecção pulmonar presente antes da internação ou diagnosticada nas primeiras 48 horas após a internação não foi classificada como infecção pulmonar nosocomial. A classificação da infecção foi verificada por meio de laudos radiológicos, registros de temperatura corporal, documentação de secreções respiratórias, resultados de hemogramas periféricos e registros clínicos de diagnóstico.
Biossegurança e descarte de resíduos
Sangue humano, soro e DNA derivado do sangue foram manuseados sob as precauções padrão de biossegurança nível 2. O pessoal do laboratório usava luvas, jalecos, máscaras e óculos de proteção durante o manuseio de sangue, aliquotação sérica, testes ELISA, extração de DNA, preparação por PCR, eletroforese em gel, digestão por restrição e visualização UV. Os tubos de sangue eram verificados para vazamento ou quebra antes do processamento. A centrifugação era realizada usando tubos com tampa ou, quando disponíveis, baldes de centrífuga selados.
Os objetos cortantes eram descartados imediatamente em recipientes aprovados. Tubos, pontas de pipeta, luvas, placas ELISA e outros consumíveis descartáveis contaminados com sangue foram descartados como resíduos biológicos de laboratório. Resíduos biológicos líquidos foram desinfetados de acordo com procedimentos institucionais antes do descarte. Géis de agarosa, géis de poliacrilamida, reagentes de coloração e materiais relacionados à eletroforese foram descartados de acordo com os requisitos institucionais de resíduos químicos e laboratoriais.
Preparação do reagente PCR, adição de moldes de DNA, manuseio amplificado do produto, digestão por restrição e eletroforese em gel foram separadas tanto quanto possível para reduzir a contaminação. Pontas de pipeta resistentes a aerossóis eram usadas para PCR e manuseio de DNA. A visualização UV foi realizada apenas com um escudo protetor ou sistema de documentação em gel, e a exposição direta dos olhos ou da pele à luz UV foi evitada.
Coleta de sangue periférico e processamento de amostras
Para reduzir a variação pré-analítica, 10 mL de sangue venoso periférico foram coletados às 08h da manhã seguinte à admissão, após um jejum noturno de pelo menos 12 horas. 5 mL de sangue foi retirado para um tubo de vácuo simples para preparação do soro, e os 5 mL restantes foram retirados para um tubo heparinizado para extração genômica de DNA.
Antes do processamento, cada tubo foi verificado quanto ao identificador do paciente, tempo de coleta, tipo de tubo, volume sanguíneo, vazamento, coagulação visível e hemólise macroscópica. Amostras com rotulagem incorreta, volume sanguíneo insuficiente, vazamento do tubo ou coágulos visíveis no tubo anticoagulado foram excluídas da análise posterior. O sangue no tubo simples foi deixado coagular em temperatura ambiente por 60 minutos, depois centrifugado a 1.500 × g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante sérico foi transferido para tubos estéreis de polipropileno de baixa ligação a proteínas sem perturbar a camada celular, aliquotado em frações de 0,5 mL e armazenado a −80 °C até análise.
Amostras que apresentaram hemólise moderada ou severa visível foram excluídas da quantificação baseada em ELISA. Amostras levemente hemolizadas foram registradas e não foram usadas para a análise primária de citocinas. Amostras com turbidez visível, lipemia evidente, volume residual insuficiente ou exposição repetida a congelamento-descongelamento foram identificadas antes do teste. Nenhuma alíquota sérica passou por mais de um ciclo de congelamento-descongelamento antes da análise.
Quantificação de citocinas pelo ELISA
As concentrações séricas de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF-α foram medidas usando kits ELISA sanduíche humanos comercialmente disponíveis, validados para amostras de soro. As alíquotas séricas foram descongeladas, cuidadosamente misturadas e inspecionadas quanto a hemólise, turbidez, lipemia, volume insuficiente e histórico de congelação-descongelamento antes da carga.
Padrontas, poços em branco e amostras de soro foram carregadas em duplicado. Curvas padrão eram geradas em cada placa usando diluições seriadas das concentrações padrão e um controle em branco, conforme as instruções do kit. A densidade óptica foi medida em 450 nm, com correção de referência em 570 nm, usando um leitor de microplacas calibrado. As concentrações foram calculadas por ajuste da curva logística de quatro parâmetros.
Os resultados do ensaio foram aceitos apenas quando a curva padrão mostrou um padrão concentração-resposta apropriado, poços vazios mostraram baixo fundo de fundo e o coeficiente de variação da amostra duplicada foi ≤ 10%. Amostras com duplicação de CV > 10% foram reanalisadas a partir da alíquota sérica original quando havia volume suficiente disponível. Amostras fora da faixa confiável de curvas padrão foram diluídas ou repetidas conforme as instruções do kit. Placas mostrando padrões inconsistentes, fundo excessivo ou efeitos de borda óbvios foram repetidas.
Os limites analíticos mais baixos usados para aceitação de dados foram 2,0 pg/mL para IL-1β, 1,5 pg/mL para IL-6, 2,0 pg/mL para IL-10, 3,0 pg/mL para IL-17, 4,0 pg/mL para IFN-γ e 2,5 pg/mL para TNF-α. Os valores finais das citocinas foram verificados com identificadores amostrais, mapas de placas, registros de leitura duplicada e notas de qualidade amostral antes da análise estatística.
Quantificação dos TLR2, TLR4 e TLR9 séricos pelo ELISA
Os níveis séricos de proteínas TLR2, TLR4 e TLR9 foram medidos usando kits ELISA humanos comercialmente disponíveis, validados para amostras de soro. As amostras de soro foram descongeladas, misturadas suavemente e inspecionadas usando os mesmos critérios de qualidade da amostra aplicados à medição de citocinas.
Padrontas, poços em branco e amostras de soro foram analisadas em duplicado. As placas foram lidas a 450 nm com correção de referência a 570 nm, e as concentrações foram calculadas usando regressão logística de quatro parâmetros. Os resultados foram aceitos quando a curva padrão era válida, poços em branco estavam dentro da faixa de fundo esperada e o CV duplicado estava ≤ 10%. Amostras que ultrapassavam esse limiar de CV duplicado eram retestadas quando remantinham amostras suficientes.
Os limites analíticos inferiores de detecção usados para a aceitação dos resultados foram 0,10 ng/mL para TLR2, 0,12 ng/mL para TLR4 e 0,15 ng/mL para TLR9. Os valores finais de TLR2, TLR4 e TLR9 foram verificados com identificadores amostrais, mapas de placas, registros de leitura duplicada e notas de qualidade amostral antes da análise estatística.
Extração de DNA genômico
O DNA genômico foi extraído do sangue total heparino anticoagulado usando um kit de extração de DNA genômico sanguíneo baseado em coluna de sílica. Antes da extração, amostras de sangue anticoagulado foram verificadas quanto à rotulagem correta, volume suficiente, coágulos visíveis, vazamento e condição de armazenamento.
A pureza e concentração do DNA foram avaliadas por espectrofotometria. Somente amostras com razão A260/A280 entre 1,80 e 2,00 foram aceitas para amplificação de PCR a jusante. Amostras fora dessa faixa foram remedidas após uma mistura suave. Se a razão anormal de pureza persistisse, a extração de DNA era repetida quando restava sangue total suficiente.
O DNA foi diluído com água sem nuclease até uma concentração funcional de 50 ng/μL e armazenado a -20 °C até a amplificação por PCR. Antes da configuração da PCR, cada amostra de DNA era verificada quanto à concentração, pureza, identificador da amostra e histórico de congelamento-descongelamento.
Genotipagem PCR-RFLP e chamada de genótipo
A genotipagem foi realizada usando polimorfismo de reação em cadeia da polimerase e comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) para IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 a 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T e IFN-γ +2108 A/G. Sequências de primers específicas do locus, tamanhos esperados de amplicones, enzimas de restrição e padrões de digestão específicos do genótipo são fornecidos na Tabela Suplementar 1.
A amplificação por PCR foi realizada em um volume final de reação de 25 μL contendo 2,5 μL de tampão de 10 ×, 2,0 μL de mistura dNTP a 2,5 mM cada, 1,0 μL de primer frontal a 10 μM, 1,0 μL de primer reverso a 10 μM, 0,25 μL de DNA polimerase Taq a 5 U/μL, 2,0 μL de DNA genômico a 50 ng/μL, e 16,25 μL de água livre de nuclease. A mistura master PCR foi preparada em uma área pré-PCR limpa, e o molde de DNA foi adicionado por último. Um controle negativo sem modelo era incluído em cada execução de PCR.
O perfil térmico consistiu em uma desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 58–62 °C por 30 segundos, dependendo do par de primers, e extensão a 72 °C por 30 segundos, com uma extensão final a 72 °C por 7 minutos. Os produtos PCR foram confirmados pela primeira vez em gel de agarose a 1,5% antes da digestão por restrição.
A amplificação por PCR era aceita apenas quando a banda esperada do amplicon era visível, e o controle sem molde mostrava amplificação. Reações que apresentavam bandas fracas, amplificação inespecífica, interferência primer-dímero ou contaminação no controle negativo foram repetidas a partir do molde original de DNA.
Os produtos de PCR foram digeridos com a endonuclease de restrição correspondente a 37 °C por 3 horas, em um volume total de digestão de 15 μL, conforme as instruções do fabricante. Os fragmentos digeridos foram resolvidos em gel de agarose a 2,5% para a maioria dos loci. O locus de TLR2-196 a -174 ins/del foi resolvido em gel de poliacrilamida de 8% para melhorar a discriminação de fragmentos.
A digestão de restrição foi aceita apenas quando os padrões de fragmentos correspondiam ao perfil de digestão específico do genótipo esperado. Reações que mostraram digestão incompleta, faixas borradas, tamanhos inesperados de fragmentos ou separação incerta foram repetidas. As bandas foram visualizadas sob iluminação ultravioleta após a coloração de ácidos nucleicos. As imagens do gel eram salvas com o identificador da amostra, nome do locus, data de execução e número do gel.
A atribuição do genótipo foi realizada de forma independente por dois pesquisadores laboratoriais cegos. Chamadas de genótipo dissonantes ou ambíguas foram revisadas usando a imagem original do gel e repetidas por amplificação por PCR quando necessário. Dez por cento das amostras selecionadas aleatoriamente foram re-genotipadas para controle de qualidade, e a taxa de concordância foi de 99,2%. Os dados finais de genótipo foram inseridos no conjunto de dados de análise somente após a verificação de identificadores de amostras, nomes de locus, chamadas de genótipo e registros de controle de qualidade.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando um software de análise estatística apropriado. Os conjuntos de dados clínicos, ELISA e genótipos foram combinados usando códigos de pacientes desidentificados. Os códigos dos pacientes foram verificados quanto a duplicação, incompatibilidade e valores ausentes antes da análise. Foi adotada uma estratégia de caso completo porque todos os pacientes incluídos tinham dados clínicos, inflamatórios e de genotipagem essenciais disponíveis.
Em um software de análise estatística apropriado, o status de infecção pulmonar foi codificado como variável de agrupamento, sendo usado o grupo sem infecção pulmonar como categoria de referência. As variáveis contínuas foram testadas primeiro quanto à normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk. Variáveis contínuas normalmente distribuídas foram expressas como média ± desvio padrão e comparadas usando o teste t de Student com amostras independentes. Variáveis contínuas não normalmente distribuídas foram reportadas como medianas com intervalos interquartis e comparadas usando o teste U de Mann-Whitney. As variáveis categóricas foram expressas como contagens e porcentagens e comparadas usando o teste qui-quadrado ou o teste exato de Fisher, conforme apropriado.
As distribuições de genótipos no grupo sem infecção pulmonar foram avaliadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg antes da análise de associação. Frequências de genótipo e alelo foram resumidas como n (%). Razões de chances e intervalos de confiança de 95% para o risco de infecção pulmonar foram estimados usando modelos de regressão logística multivariável. O status de infecção pulmonar foi inserido como variável dependente. Variáveis genótipos, alelos ou biomarcadores foram inseridas como variáveis independentes, conforme especificado para cada análise.
Idade e sexo foram inseridos no modelo primário a priori. IMC, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença cardíaca, vazamento de líquido cefalorraquidiano, tempo de permanência do dreno e a categoria de admissão na Escala de Coma de Glasgow foram inseridos simultaneamente no modelo totalmente ajustado porque essas variáveis eram clinicamente relevantes ou apresentavam desequilíbrio basal entre os grupos. A multicolinearidade foi avaliada usando fatores de inflação de variância (VIFs), e VIFs <5,0 foram considerados aceitáveis.
Como múltiplos polimorfismos foram testados, a correção da taxa de falsas descobertas de Benjamini-Hochberg foi aplicada às análises de associaçãogenética 12. Os valores P dos testes de associação genética foram classificados do menor ao maior, e a significância corrigida foi determinada de acordo com o procedimento de Benjamini-Hochberg. Todos os testes foram bilaterais, e P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo, a menos que especificado de outra forma após ajuste por múltiplas comparações.
Os resultados finais foram verificados com o conjunto de dados fonte, registros de controle de qualidade do ELISA, registros de chamadas de genótipo e valores de tabela antes da preparação do manuscrito. Os resultados foram interpretados como associações, e não como efeitos causais, pois o estudo utilizou um desenho observacional retrospectivo.
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Indicadores clínicos
As características clínicas de base são resumidas na Tabela 1. Um total de 360 pacientes com hemorragia intracerebral espontânea foi incluído na análise final, compreendendo 180 pacientes que desenvolveram infecção pulmonar nosocomal durante a hospitalização e 180 pacientes que não desenvolveram infecção pulmonar. Não houve diferenças significativas entre os grupos em idade (62,4 anos ± 6,8 anos vs 63,6 an...
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A hemorragia intracerebral espontânea (IC) continua sendo um dos subtipos de AVC mais graves e continua a impor elevados encargos substanciais de mortalidade precoce e incapacidade de longoprazo 13. Na prática clínica, pacientes com PCI são especialmente vulneráveis a complicações hospitalares, pois lesões neurológicas podem enfraquecer a proteção das vias aéreas, reduzir a eficácia da tosse, restringir mobilidade e aumentar a exposição a procedimentos invasivos d...
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Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse relacionados a esta obra.
Os autores agradecem à equipe clínica envolvida no cuidado ao paciente e aos indivíduos que auxiliaram na coleta de literatura e organização dos dados. Este estudo foi apoiado pelo Projeto de Planejamento de Ciência e Tecnologia em Saúde da Cidade de Jiaxing (Grant No. JWKJ-25005).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | ELISA kit para medição quantitativa de TNF-α humano em soro. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | Kit ELISA de 96 poços para medição de TLR2 humano em amostras de soro ou plasma. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | Kit ELISA sanduíche colorimétrico para medição de TLR4 humano em soro, plasma ou outros fluidos biológicos. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | Kit ELISA colorimétrico para medição de TLR9 humano em amostras de soro. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | Leitor de microplaca para medição de densidade óptica ELISA a 450 nm com correção de referência a 570 nm. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | Kit baseado em membrana de sílica para extração de DNA genômico de sangue total anticoagulado. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotometro de microvolume para avaliação de concentração de DNA e pureza A260/A280. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | Ciclotermo usado para amplificação de PCR de ponto final em genotipagem PCR-RFLP. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | Reagente PCR pré-misto contendo Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampão de reação; usado para amplificação PCR convencional. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | Fonte de enzima alternativa para reações PCR específicas de locus quando componentes PCR separados são usados em vez de mix de mestre 2X. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | Água de grau molecular-biologia usada para configuração de PCR, diluição de DNA e controles sem modelo. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Custom synthesis | Primers específicos de locus para genotipagem PCR-RFLP; as sequências dos primers estão listadas na Tabela Suplementar S1. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | Enzimas específicas do locus listadas na Tabela Suplementar S1 | Endonucleases de restrição usadas para digestão específica do genótipo de produtos de PCR. A enzima selecionada para cada locus deve corresponder ao padrão de digestão listado na Tabela Suplementar S1. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | Agarosa para preparação de géis de 1,5% e 2,5% usados para confirmar produtos PCR e resolver a maioria dos fragmentos RFLP. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | Marcador de tamanho de DNA para amplicons de PCR e estimativa de tamanho de fragmentos RFLP. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | Corante de gel para ácidos nucleicos para visualização de DNA em géis de agarose ou acrilamida; usado como uma alternativa de menor risco ao brometo de etídio. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | Sistema de eletroforese para separação em gel de agarose de produtos de PCR e RFLP. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | Sistema de eletroforese vertical para separação em gel de poliacrilamida a 8% quando é necessária uma discriminação de fragmento de maior resolução. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / equivalent laboratory system | Gel Doc XR+ or equivalent | Sistema de imagem para documentação de bandas de DNA coradas após eletroforese em gel. Use proteção UV ou modo de luz azul quando disponível. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge | 5424 R or equivalent | Centrífuga refrigerada usada para separação de soro a 1.500 × g e 4 °C. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer | Forma 900 Series or equivalent | Armazenamento de alíquotas de soro antes da análise ELISA. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 25.0 | Software estatístico usado para estatísticas descritivas, teste de normalidade, comparações de grupo, regressão logística e exportação de saída do modelo. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel for Microsoft 365 | Usado para verificação de dados, organização de mapa de placa, revisão de valores duplicados e preparação de arquivos de análise fundidos antes da análise SPSS. |
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