Um sistema de imagem de contraste a laser foi utilizado para monitorar as mudanças no fluxo sanguíneo microvascular renal durante a isquemia-reperfusão unilateral renal após a resseção do rim direito em camundongos.
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Artigo de método
Perfusão Microvascular Monitorada por Imagem de Contraste Speckle-Laser durante Lesão por Isquemia-Reperfusão Renal em Camundongos
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de contraste de manchas a laser (LSCI) é uma técnica não invasiva para medir a perfusão sanguínea superficial em grandes áreas. Com sua alta resolução espaço-temporal, o LSCI semiquantifica as mudanças heterogêneas do fluxo sanguíneo entre diferentes regiões dentro da área imagada. Aqui, demonstramos a técnica do LSCI para registrar o fluxo sanguíneo durante lesão unilateral de isquemia renal e reperfusão (IRI) em camundongos. Após a nefrectomia direita, a posição do camundongo e o ponto focal do objetivo do sistema LSCI foram ajustados para garantir que o rim esquerdo estivesse no campo de visão. Exames de LSCI foram realizados antes, durante e depois da isquemia do rim. Além disso, ao selecionar regiões de interesse (ROIs), o fluxo sanguíneo nas regiões foi monitorado simultaneamente. O método da LSCI visualiza a perfusão microvascular do rim e permite um mapeamento em tempo real do fluxo sanguíneo. Pode ser utilizado para monitorar o fluxo sanguíneo microvascular e avaliar o efeito de uma intervenção na cinética de reperfusão e homogeneidade espacial durante IRI renal de camundongos ou outros modelos animais similares.
Introdução
A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) está entre as principais causas de lesão renal aguda (AKA), que está associada a alta morbidade e alta mortalidade empacientes 1,2. A alteração da hemodinâmica renal é um dos fatores críticos daAKA 1 induzida por IR. A disfunção microcirculatória evocada por RI é uma das principais causas para o desenvolvimento de lesão, levando à privação de oxigênio e à disfunção mitocondrial das células 3,4. Portanto, monitorar as mudanças no fluxo sanguíneo em tempo real é um método eficaz para garantir a isquemia ou reperfusão bem-sucedida do rim e avaliar o grau de IRI em modelos animais para o distúrbio.
Existem múltiplas técnicas para medir a perfusão microvascular dos tecidos, incluindo a fluidometria Doppler a laser (LDF)5, a imagem autofluorescente de nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase (NADH) 6,7,8, a imagem infravermelha 9 e a angiografia de indocanina verde (ICG) 10. Entre elas, a imagem infravermelha e a imagem autofluorescente NADH medem indiretamente a perfusão microvascular. O LDF, usando uma sonda óptica, monitora apenas o fluxo sanguíneo regional5, e o escaneamento do LDF não é rápido o suficiente para monitorar as mudanças em tempo real da perfusão microvascular do tecido sob as condições I/R 11. A angiografia ICG também pode identificar vasos renaisbloqueados 10, mas requer a administração de um agente de contraste, que restringe seu uso a um número limitado demedições 12. A imagem de contraste de manchas a laser (LSCI) é um método eficiente e não invasivo para monitorar microperfusão renal em temporeal 13. Ele tem sido usado para gerar informações espacialmente resolvidas relacionadas à dinâmica do fluxo sanguíneo. À medida que um feixe coerente é projetado sobre uma superfície rugosa, as ondas de luz refletidas ou dispersas interferirão entre si devido a pequenas diferenças de caminho, formando uma distribuição aleatória de padrões de manchas claras e escuras, conhecida como "mancha". O LSCI mapeia a velocidade do fluxo sanguíneo nos tecidos superficiais analisando o grau de borrão da "mancha dinâmica" produzida quando a luz do laser irradia otecido 12,14,15. Neste estudo, o sistema LSCI operou em um comprimento de onda laser de 785 nm com resolução espacial de 3 μm, campo de visão ajustável entre 6,3 mm × 4,7 mm e 42 mm × 31 mm, e uma velocidade de imagem de até 120 quadros por segundo, permitindo mapeamento em tempo real e alta resolução da perfusão microvascular cortical. Diante dessas vantagens, a LSCI tem sido aplicada em diversos contextos experimentais e clínicos para monitoramento do fluxo sanguíneo, incluindo queimaduras16, perfusãoretiniana 17, fluxo sanguíneo cerebral18, esôfago19 eintestino 20.
Deve-se notar que o LSCI avalia principalmente a perfusão no tecido superficial, fornece valores relativos em vez de absolutos de fluxo e pode ser influenciado por propriedades ópticas do tecido e artefatos de movimento. Essas características inerentes são consideradas ao interpretar os dados de imagem.
Esse trabalho, utilizando um modelo envolvendo nefrectomia direita para facilitar a exposição e a imagem do rim contralateral, monitorou as mudanças na perfusão microvascular antes, durante e após a isquemia em um modelo de camundongo unilateral renal I/R usando LSCI e demonstrou a heterogeneidade espacial do fluxo sanguíneo na superfície do rim.
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou. Para eliminar diferenças baseadas em gênero e cepa nos efeitos da IRI, apenas camundongos machos C57BL/6N foram usados no estudo. Todos os camundongos foram comparados em idade e peso para produzir resultados comparáveis. Foi utilizado um tamanho amostral de n = 5, consistente com estudos metodológicos anteriores que utilizaram LSCI para validaçãotécnica 21. Os animais receberam cuidados humanitários e foram eutanasiados após os experimentos por inalação de CO2 . Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, ligue o sistema de imagem de contraste com manchas a laser. O sistema utilizado neste estudo opera com um laser de 785 nm. Ajuste a distância de trabalho para aproximadamente 15-20 cm acima do campo cirúrgico. O sistema calcula o fluxo sanguíneo em Unidades de Perfusão de Speckles a Laser (LSPU) com base no algoritmo de contraste espacial. Certifique-se de que o instrumento esteja aquecido e estável antes de prosseguir.
1. Preparação animal e laparotomia
- Esterilize a mesa cirúrgica antes de cada procedimento. Prepare e coloque todos os materiais necessários (instrumentos esterilizados e cotonetes, gaze, anestésicos pré-diluídos, almofada térmica, grampo vascular, solução salina, creme depilatório, bolas de algodão, pontos, antissépticos para a pele e sutura) na mesa cirúrgica.
- Administre meloxicam (0,2 mg/kg de peso corporal; injeção subcutânea) ao camundongo com 30 minutos de antecedência para aliviar a dor.
- Despeje uma certa quantidade de soro salino esterilizado em um recipiente limpo. Depois, pegue uma gaze e corte uma abertura adequada no meio.
- Anestesiar um camundongo por injeção intraperitoneal de 2,5% de Tribromoetanol (400 mg/kg de peso corporal; previamente diluído em soro fisiológico estéril).
NOTA: O tribromoetanol foi usado como anestésico durante o processo de nefrectomia direita. E o isoflurano a 1% foi usado para anestesia durante procedimentos prolongados de monitoramento do fluxo sanguíneo. - Coloque o mouse sobre a almofada térmica com fita adesiva e use creme depilatório para remover os pelos da área do abdômen do rato. Durante a cirurgia, use a bolsa térmica para manter a temperatura retal entre 37 °C ± 0,5 °C.
- Desinfete a pele da área cirúrgica primeiro com álcool 75% e depois com iodóforo usando um cotonete.
- Use pinças para beliscar o dedo do rato. Quando o camundongo não apresentar resposta à dor, faça uma incisão vertical ao longo da linha média do abdômen usando tesoura. Separe suavemente a pele do peritônio, depois corte o peritônio e entre na cavidade abdominal.
- Aplique um retrator no rato para otimizar a visibilidade e cubra o campo operatório com gaze, alinhando a folga da gaze com a cavidade abdominal e umedecida com soro.
2. Nefrectomia direita
- Use um cotonete para empurrar suavemente o intestino para um lado da gaze, expondo o rim direito e os tecidos ao redor. Dobre a gaze para cobrir o intestino e umedeça com soro fisiológico normal para evitar que o intestino ressece.
- Use pinças angulares para levantar o ureter direito. Passe dois fios de sutura 6-0 pelo ureter e realize a ligadura em duas posições.
- Transecte o ureter entre as duas ligaduras usando microtesouras.
- Após umedecer os algodões com soro fisiológico normal, use pinças finas para pegar as bolinhas de algodão, empurre suavemente o fígado para cima e fixe-o com os algodão, expondo os rins e os vasos sanguíneos do lado direito.
- Use pinças angulares para separar de forma direta as almofadas de gordura perinefrícica ao longo do lado do rim direito até que a artéria e a veia renais estejam totalmente expostas.
NOTA: Separe simultaneamente a massa de tecido adrenal localizada acima do rim. - Deslize cuidadosamente as pinças angulares sob a artéria e veia renal para criar um canal. Depois, passe um ponto trançado de seda 6-0 ao redor dos vasos para ligá-los juntos.
- Corte a artéria e veia renal ocluídas localizadas próximas ao rim. Remova o rim junto com o tecido aderente restante.
- Remova o algodão usado para segurar o fígado.
3. Monitoramento do fluxo sanguíneo renal com Imagem de Contraste Laser Speckle (LSCI) durante isquemia-reperfusão
- Ligue o sistema LSCI e o software dedicado do instrumento.
- Clique em Imagem Original e Pré-visualização para visualizar a imagem bruta e não processada do campo cirúrgico.
- Altere a posição dos camundongos, mantenha a anestesia usando isoflurano a 1% administrado a 600 mL/min via um cone nasal, e ajuste a ampliação da câmera enquanto observa a imagem original para obter uma visão clara do rim alvo.
- Clique em Exibição Simultânea para visualizar a imagem do fluxo sanguíneo em tempo real. Ajuste a ampliação para 2,5× e selecione Ajuste Automático de Fluxo Sanguíneo para otimizar a imagem. Depois, trave os parâmetros do fluxo sanguíneo. Além disso, configurado para gravar um quadro da imagem a cada 5000 ms.
NOTA: Bolinhas de algodão úmidas podem ser usadas para garantir a posição estável do rim e impedir que os órgãos e tecidos ao redor o façam dele, aumentando a distinção entre a área renal e o contexto. - Defina o tamanho dos parâmetros da área quadrada para 112 e organize as 5 áreas quadradas uniformemente em uma orientação fixa na vista renal. Clique em Registro e Registro de Imagens em Tempo Real para começar a registrar os dados do fluxo sanguíneo.
NOTA: A máquina registrará automaticamente as unidades de perfusão de speckle a laser (LSPU), que representam as unidades de fluxo sanguíneo em tempo real nos ROIs e podem ser usadas para análises. Durante o processo de detecção, movimentos relacionados à respiração ou mudanças ambientais podem causar a mudança do campo de visão. Se o sistema indicar isso na área de detecção, a gravação atual deve ser interrompida. Depois, clique em Registro de Imagem em Tempo Real e Gravar novamente. - Após registrar uma linha base de 30 minutos, separe o tecido adiposo que envolve os vasos renais esquerdos. Use a pinça hemostática para segurar uma microclamp e colocá-la na artéria e veia renal esquerda, próxima ao hílo. Continue monitorando em tempo real por mais 30 minutos.
- Solte a micro-pinça para iniciar a reperfusão. Monitore e registre a recuperação em tempo real do fluxo sanguíneo microvascular renal.
- Uma vez que a reperfusão do fluxo sanguíneo for monitorada por pelo menos 60 minutos, pare de monitorar e suture a incisão abdominal com uma sutura trançada de seda 7-0.
4. Recuperação e cuidados pós-operatórios
- Administrar fluidos com uma injeção intraperitoneal de 1 mL de soro fisiológico para evitar desidratação após a cirurgia.
- Mantenha os mouses na bolsa térmica. Monitore cuidadosamente os camundongos até que recuperem a consciência, pareçam alertas e consigam se endireitar.
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Resultados
Este artigo teve como objetivo detectar alterações no fluxo sanguíneo renal durante a IAC induzida por IR. Portanto, empregamos um modelo comum de camundongos que envolve nefrectomia direita (Figura 1A) seguida de um procedimento de RI no rim contralateral (Figura 1B). Como era necessário monitoramento em tempo real do fluxo sanguíneo durante a IRI, todas as manipulações nos camundongos eram realizadas na região do instrumento d...
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Discussão
Este trabalho descreve a aplicação de um sistema LSCI para a visualização em tempo real e de alta resolução da dinâmica do fluxo sanguíneo microvascular renal durante IRI em camundongos. O protocolo oferece uma vantagem significativa em relação às medições tradicionais de endpoint ou métodos com resolução espacial limitada, como o LDF, ao fornecer um mapa de perfusão bidimensional que captura a heterogeneidade regional dentro da microcirculação renal. A eficiência e a usabilidade do LSCI...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa em Equipe Inovadora para Universidades da Província de Guangdong (2022KCXTD009).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Recipiente absorvedor (para anestesia) | Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, China | 10-0210 | |
| Álcool, medicina (75%) | HENGLIYA, Xinjiang, China | N/A | Desinfetante de pele |
| Vaporizador anestésico | Midmark | https://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer | |
| Cotonetes | Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, China | https://www.hainuocn.com/index/detail/448.html | |
| Creme depilatório | VEET | https://www.veet.com.cn/jingchun/whx | |
| Curativo de gaze | Winner Medical Co., Ltd, Shenzhen, China | https://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html | |
| Bolsa térmica | Renqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, China | HD-1902 | Para manter a temperatura corporal |
| Solução de iodóforo | Taixinkang, Jinxian, China | https://www.11467.com/nanchang/co/120661.htm | Antisséptico para a pele |
| Isoflurano | RWD Life Science Co., Ltd, China | R510-22-10 | Anestésico inalável |
| Sistema de imagem de contraste de speckles a laser (LSCI) | Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, China | SIM BFI HR PRO | Sistema equivalente ao MoorFLPI-2 |
| Meloxicam | Qilu Animal Health Products Co., Ltd, China | https://en.qiludb.com/companion_animal/500.html | 0,2 mg por kg de peso corporal; analgésico |
| Micro-clamp | Shanghai Medical Instrument(Group) Co., Ltd, China | W40140 | Pinça vascular |
| Soro fisiológico normal (cloreto de sódio 0,9%) | Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, China | https://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62 | |
| Sutura trançada de seda (6-0) | Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, China | http://www.fdma.com.cn/products_detail/12.html | Para ligação de vasos |
| Sutura trançada de seda (7-0) | Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, China | https://www.weigaoholding.com/ | Para fechamento de feridas, suturas cirúrgicas não absorvíveis com agulha curva |
| Seringa (1 mL) | Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, China | https://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.html | Com agulha de 26 G |
| Tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402-100G | solução de 2,5%; Anestésico injetável |
Referências
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Reimpressões e permissões
