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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Científica do Serviço de Saúde Concepción. Tecido ósseo humano foi obtido de cabeças femurais doadas por pacientes submetidos à cirurgia de substituição de quadril no Hospital de Traumatologia de Concepción, Chile, após consentimento escrito e informado. As amostras eram armazenadas a −80 °C até o uso. Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso ético de tecido humano em pesquisas. Todo o tecido ósseo humano foi obtido das cabeças femurais doadas por pacientes do Hospital de Traumatologia de Concepción, Chile, mediante consentimento informado e com aprovação do Comitê de Ética Científica do Serviço de Saúde de Concepción. Todos os procedimentos estão em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de tecidos humanos.
1. Síntese de GelMA
- Dissolva 10 g de gelatina tipo A A em 100 mL de soro tampão fosfatado (PBS, pH 7,5) a 60 °C sob constante agitação.
- Reduza a temperatura para 50 °C e adicione 5 mL de anidrido metacrílico a uma taxa de 0,5 mL/min, mexendo suavemente por 1–3 horas.
- Dilua a mistura de reação 5× com PBS pré-aquecido a 40 °C para interromper a reação.
- Dialise a solução usando uma membrana de 12–14 kDa contra 3–5 L de água destilada a 40 °C por 5–7 dias, substituindo a água diariamente.
NOTA: (Passo crítico) Garanta a substituição diária completa da água para remover o anidrido metacrílico não reagido.
- Liofilize a solução dialisada por 24 horas e armazene o GelMA liofilizado a 4 °C até o uso.
2. Preparação de hidrogel com gelMA
- Prepare lotes de 10 mL de hidrogéis GelMA a 5, 10 ou 15 p/v%.
- Dissolva 0,5, 1,0 ou 1,5 g de GelMA liofilizado em 9,5 mL de água deionizada a 50 °C.
- Resfrie a solução a 37 °C.
- Adicione 0,5 mL de solução fotoiniciadora Irgacure 2959 (0,5 w/v% em etanol absoluto).
- Misture delicadamente e mantenha a solução a 37 °C até filtração estéril através de um filtro de membrana de acetato de celulose de 0,22 μm.
3. Descelularização óssea
- Descongelar gradualmente as cabeças femorais até 25 °C. Corte cada cabeça do fêmur ao meio e depois em pedaços menores.
- Imerga as peças em água destilada estéril a 60 °C e sonice por 15 minutos (40 kHz, contínuo).
- Lave as amostras em 300 mL de água destilada pré-aquecida a 60 °C enquanto agita a 200 rpm por 5 minutos.
- Centrifuge a 1850 × g por 15 minutos a 25 °C. Repita os passos de lavagem e centrífuga três vezes.
- Esterilize o tecido por sonicação (40 kHz, contínuo) por 10 minutos a 60 °C em uma solução contendo 3% de peróxido de hidrogênio e 0,02% de ácido peroxiacético.
- Transfira o tecido para 300 mL de etanol a 70% e sonice (40 kHz, contínuo) por 10 minutos a 21 °C.
- Lave as amostras duas vezes com água destilada de 300 mL, agite a 200 rpm por 10 minutos a 60 °C e centrifuge a 1850 × g por 15 minutos a 25 °C.
- Primeiro, pré-congele o osso a -80 °C por 4 horas, depois liofilize o osso descelularizado por 24 horas em uma base larga para garantir uma secagem uniforme e evitar altura excessiva da amostra em 0,05 mbar entre -40 e -60 °C.
NOTA: (Passo crítico) Certifique-se de que a amostra não ultrapasse 2–3 cm de altura dentro do recipiente para evitar liofilização incompleta.
4. Preparação de micropartículas ósseas
- Coloque os fragmentos ósseos descelularizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL na solução esterilizante e homogeneize usando um homogeneizador até obter uma solução branca uniforme (Vídeo Suplementar 1).
- Centrifuge a 1850 × g por 15 minutos a 25 °C, descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com 300 mL de água destilada a 25°C sob agitação a 200 rpm por 10 minutos. Realize uma centrifugação final a 1850 × g por 15 minutos a 25 °C.
- Liofilize (0,05 mbar em -40 a -60 °C) o material resultante por 48 horas e armazene a -80 °C até o uso.
- Moa mecanicamente o osso cortical ou medular liofilizado usando um argamassa cerâmica esterilizada até obter pó fino (Figura 1).
- Passe o pó por uma malha ou peneira de 200 μm, pese o material final e armazene a -80 °C.
NOTA: (Passo crítico) Certifique-se de que o pó esteja completamente seco antes da peneiração para evitar agregação e seleção imprecisa do tamanho das partículas.
Vídeo Suplementar 1: Procedimento de homogeneização óssea. Homogeneização de fragmentos ósseos descelularizados usando um homogeneizador até que uma suspensão branca uniforme seja produzida. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 1: Preparação de micropartículas ósseas. (A) Fragmentos ósseos descelularizados após homogeneização com homogeneizador OV5 e armazenamento a -80 °C. (B,C) Armamassa cerâmica esterilizada usada para moer osso descelularizado em um pó fino. (D) Micropartículas ósseas descelularizadas finais após peneiração. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
5. Fabricação de gel ósseo
- Prepare 10 w/v% de GelMA dissolvendo 1 g de GelMA em 9,5 mL de água deionizada a 50 °C.
- Resfrie a solução a 37 °C e adicione a solução de fotoiniciador Irgacure 2959.
- Mantenha a solução a 37 °C e realize a filtração estéril usando um filtro de 0,22 μm.
- Adicione micropartículas ósseas descelularizadas (DBMP) a 1% em pa/v.
- Misture e pipetee cuidadosamente para cima e para baixo, evitando criar bolhas, a 40 °C até que uma suspensão homogênea seja obtida para formar o gel ósseo (BG).
- Armazene a glicemia a 4 °C por até 2 semanas.
NOTA: (Passo crítico) Mantenha o hidrogel acima da sua temperatura de gelificação (≥37 °C) antes da incorporação da célula para evitar solidificação prematura.
6. Cultura primária de osteócitos
- Extração da medula óssea e lavagem inicial
- Extraia e triture tecido de medula óssea do interior da cabeça femoral usando instrumentos cirúrgicos estéreis (Figura 2).
- Transfira o tecido picado para uma placa de Petri estéril.
- Lave o tecido três vezes com meio de cultura α-MEM suplementado com solução antibiótico-antimicótica (100 μg/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina).
- Enxágue uma vez com a Solução Equilibrada de Sal do Hank (HBSS).
NOTA: (Passo crítico) Minimize o tempo entre a coleta e o processamento do tecido para preservar a viabilidade celular.
- Digestão enzimática
- Incube o tecido em solução de colagênase Tipo I por 25 minutos a 37 °C com agitação suave.
- Lave com HBSS.
- Repita os passos 6.2.1–6.2.2 mais duas vezes (três digestões totais de colagênase).
- Incube o tecido em 0,5 mM de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) por 25 min a 37 °C.
- Lave com HBSS e repita o passo do EDTA mais duas vezes.
- Realize uma última digestão com colagênase Tipo I (25 min a 37 °C), seguida de uma lavagem com HBSS.
NOTA: (Solução de problemas) Digestão incompleta pode resultar em baixo rendimento celular; Estenda a incubação enzimática em 5–10 minutos, se necessário.
- Recuperação e cultura celular
- Colete a solução de colagênase e transfira o lavado final com HBSS para um tubo centrífugo de 50 mL.
- Centrifuge a 1.000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de α-EM completo.
- Semeie a suspensão celular em dois frascos de cultura T75 e incube a 37 °C com 5% de CO₂.
NOTA: Substitua o meio de cultivo a cada 2–3 dias até que a confluência adequada (Figura 3) seja alcançada.
Figura 2: Coleta de tecido da medula óssea. (A) Cabeça femoral obtida por cirurgia de substituição do quadril, mostrando a região medular usada para isolamento celular. (B) Fragmentos de osso medular picados colocados em uma placa de Petri estéril antes da digestão enzimática. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Cultura primária de osteocícitos. Osteócitos aderidos e proliferando em uma monocamada dentro de um T75 após isolamento do osso medular humano. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
7. 3D Cultura celular
- Pré-aqueça a quantidade de hidrogel de glucosa a 37 °C.
NOTA: (Passo crítico) Garantir que a área de trabalho esteja livre de correntes de ar; O resfriamento acelera o gelificação prematura.
- Descolhe osteócitos cultivados e centrifuge a 500 × g por 5 minutos em um tubo de 15 mL.
- Ressuspenda o pellet em 200 μL de meio de cultura e misture com o hidrogel de BG para obter uma densidade celular final de pelo menos 1000 células/μL (doravante chamada de biotinta).
- Aspire 50 μL da biotinta usando uma pipeta de 1000 μL e mantenha a 37 °C até a deposição.
- Pipete 50 μL da biotinta por construto em cada poço da placa de cultura (Vídeo Suplementar 2); deixe aproximadamente 5 minutos para gelificação física em temperatura ambiente (Figura 4).
- Expor cada poço a luz UV de 365 nm por 1 minuto para alcançar a reticulação irreversível (0,30 J/cm 2).
- Adicione meio de cultivo e incube os construtos a 37 °C, 5% de CO2 para os pontos de tempo necessários. Use uma placa separada para cada ponto de tempo.
Figura 4: Preparação de construções de cultura celular 3D. A placa de poço contendo GelMA carregado de células se constrói imediatamente após a pipeteação e após a reticulação UV (365 nm). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Vídeo Suplementar 2: Preparação de construções 3D carregadas de células. Deposição de misturas de célula hidrogel em uma placa de 12 poços usando uma técnica simples de pipeteamento antes da reticulação UV. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
8. Testes de biocompatibilidade
- Mancha viva/morta
- Cultive os andaimes carregados de células pelos intervalos de tempo desejados.
- Lave suavemente com PBS estéril.
- Incube os construtos por 30 minutos no escuro com solução viva/morta contendo 0,2% de homodímero de etídio-1 (EthD-1) e 0,05% de calceína AM em PBS.
- Imagem imediatamente usando um microscópio de fluorescência com filtros para calceína AM (~495/515 nm) e EthD-1 (~495/635 nm). Os conjuntos padrão de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Texas Red são compatíveis com a detecção de calceína AM e EthD-1, respectivamente.
- Identifique células vivas pela fluorescência citoplasmática verde e células mortas pela fluorescência nuclear vermelha.
NOTA: Imagens planares podem ser processadas usando o ImageJ (Fiji). A lente objetiva, o tempo de exposição, o ganho e a intensidade da iluminação foram mantidos constantes para todas as amostras comparadas e ajustados apenas para evitar saturação do sinal. Para minimizar a má interpretação causada pela autofluorescência, as mesmas configurações de aquisição foram mantidas para todas as amostras em cada experimento, e observações de controle de construções de andaime/micropartículas ósseas sem células foram usadas para reconhecer o padrão de fluorescência de fundo associado ao biomaterial. Esses controles nos permitiram distinguir o sinal derivado de partículas da verdadeira coloração de células arredondadas durante a interpretação da imagem.
- Quantificação de Alamarblue
- Prepare uma solução de trabalho de alamarblue a 5% em meio completo.
- Incubar andaimes em solução de alamarBlue por 2,5 horas a 37 °C e 5% de CO₂, protegidos da luz.
- Transfira 100 μL de sobrenadante para uma placa de 96 poços em triplicado, incluindo controles.
- Meça a fluorescência em excitação de 360/40 nm e emissão de 460/40 nm.
- Normalize os valores de fluorescência para os controles para determinar a atividade metabólica relativa.
