Farmacologia em Rede e Verificação Experimental para Explorar o Córtex Cinnamomi contra Osteonecrose Induzida por Esteroides da Cabeça Femoral

Resumo

Este estudo tem como objetivo explorar os potenciais mecanismos do Córtex Cinnamomi no tratamento da osteonecrose da cabeça femoral, integrando farmacologia em rede, simulações de dinâmica molecular e experimentos com animais.

Resumo

A osteonecrose da cabeça femoral induzida por corticoides (SONFH) causa dor intensa e mobilidade limitada, prejudicando significativamente a qualidade de vida dos pacientes. O Córtex de Canela (CC) demonstrou aliviar efetivamente essa condição, mas seu mecanismo de ação permanece incerto. Este estudo tem como objetivo identificar os compostos ativos da CC e explorar seus mecanismos na SONFH. Constituintes ativos foram avaliados usando os bancos de dados HERB 2.0, PubCem e SwissADME, e seus alvos correspondentes foram previstos usando o banco de dados Swiss Target Prediction. Os alvos para SONFH foram identificados ao intersectar alvos dos bancos de dados GEO, DisGeNET, GeneCards e OMIM com os alvos relacionados ao composto. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída usando o banco de dados STRING, e análises de enriquecimento GO e KEGG foram conduzidas via o banco de dados DAVID. As interações composto-alvo mais promissoras foram validadas por meio de acoplamento molecular (MD) e simulações de dinâmica molecular. Os pesquisadores identificaram 563 alvos potenciais, incluindo 61 alvos relacionados ao SONFH, com AKT1, HIF-1α e STAT3 atuando como nós centrais. A análise de enriquecimento KEGG destacou a via de sinalização do HIF-1α como um mecanismo chave. Além disso, experimentos com animais demonstraram que a fração ativa de CC mitigava efetivamente o dano estrutural da cabeça femoral em um modelo de camundongos com SONFH. Os achados sugerem que a CC pode melhorar a SONFH coordenando a adaptação à hipóxia e regulando a angiogênese e osteogênese.

Introdução

A osteonecrose da cabeça femoral induzida por esteroides (SONFH) é um distúrbio osteoarticular grave, causado pela interrupção ou redução do suprimento sanguíneo à cabeça do fêmur devido a vários¹. A morte das células ósseas e dos componentes da medula ósea leva a danos estruturais na cabeça do fémur e a comprometimento funcional da articulação^{do quadril 2}. Clinicamente, os pacientes normalmente apresentam dor no quadril e mobilidade limitada³. Sem tratamento eficaz, 80% dos pacientes com SONFH progredirão para o colapso femoral da cabeça, exigindo substituição total^{do quadril 4}. Isso impõe uma forte pressão psicológica e um pesado ônus econômico sobre os^{pacientes 5}. A prática clínica recomenda o uso de uma combinação de anticoagulantes, medicamentos fibrinolíticos, vasodilatadores e medicamentos que reduzem lipídios para tratar a SONFH, que demonstraram algum potencial clínico, mas geralmente eficácia terapêutica^{limitada 6}.

A medicina tradicional chinesa (MTC) tem demonstrado cada vez mais seu impacto positivo no tratamento da^{SONFH 7}. A MTC mostra potencial para alívio dos sintomas, controle da doença e aumento da mobilidade articular e da qualidade de vida dos^{pacientes 8}. Clinicamente, a CC e seus componentes têm sido amplamente utilizados na melhoria da SONFH, demonstrando eficácia^{notável 9}. Numerosas substâncias bioativas encontradas no CC possuem diversas ações biológicas, incluindo propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, promotoras de angiogênese e melhoradoras da^{microcirculação.} Pesquisas anteriores em engenharia de tecidos ósseos e metabolismo estabeleceram que o cinnamaldeído, um dos principais constituintes ativos do CC, pode modular vias de sinalização relacionadas à remodelação^{óssea 11}. O estudo inicial indicou que as Pílulas de Yougui (YGPs) têm potencial terapêutico para SONFH ao promover a angiogênese e aumentar as respostas^{inflamatórias 12}. Como o medicamento soberano nos YGPs, o CC pode aquecer o yang, beneficiar o qi e desbloquear os meridianos, produzindo efeitos terapêuticos benéficos no^{SONFH 13}. No entanto, os mecanismos precisos subjacentes à sua eficácia permanecem incertos. Esclarecer a rede regulatória multi-alvo que o CC utiliza para melhorar o SONFH não só ajudaria a entender sua natureza farmacológica, mas também incentivaria seu uso clínico sensato e a criação de melhorias relacionadas. Integrar a bioinformática com a farmacologia de redes oferece uma abordagem eficaz para elucidar os mecanismos de ação¹⁴.

A farmacologia em redes pode identificar componentes bioativos em ervas e prever as associações entre esses componentes do medicamento e os alvos^{gênicos 15}. A DM é empregada para validar as interações de ligação entre compostos ativos candidatos e alvos terapêuticos-chave. A dinâmica molecular utiliza a mecânica newtoniana para avaliar a estabilidade e flexibilidade da ligação ligante-receptor por meio da simulação^{de movimento 16}. Os autores investigaram de forma abrangente os potenciais efeitos da CC sobre o SONFH usando simulações de farmacologia em rede, MD e dinâmica molecular. Os achados fornecem uma referência para futuras pesquisas aprofundadas sobre a base e o mecanismo farmacodinâmico dos materiais da CC na melhoria da SONFH. O fluxograma do estudo é mostrado na Figura 1.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Experimental Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Zhejiang (IACUC-20240708-22) e estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitido pelos Institutos Nacionais de Saúde. Neste experimento, vinte camundongos C57BL/6J fêmeas de 10 semanas de idade, pesando entre 20 e 22 g, foram utilizados. Esses ratos foram obtidos do centro animal da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang. Veja a Tabela de Materiais para uma lista de todos os reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

Triagem de compostos ativos e alvos de CC
Compostos químicos de CC foram identificados usando a Erva 2.0¹⁷ com a palavra-chave "CC." Produtos químicos sem ID PubChem ou com o mesmo ID foram filtrados. Depois, mesclar e remover duplicatas para obter os sítios alvo correspondentes ao CC. Realize uma triagem inicial usando o banco de dados^{PubChem 18} baseado na regra dos cinco de Lipinski (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Os autores utilizam o banco de dados PubChem para determinar a representação SMILES para cada composto químico. Usando o banco de dados SwissADME, os autores selecionam compostos com restrição de absorção "Alta" de IG e valores de ≥2 "Sim" em Similaridade de^{Fármacos 20}. Utilize o banco de dados Swiss-Target^{Prediction 21} para extrair proteínas-alvo com probabilidade maior que zero. Depois, mesclar e remover duplicatas para obter os sites-alvo correspondentes ao CC.

Compilação de alvos gênicos associados à SONFH
Alvos relacionados ao SONFH foram obtidos a partir de bancos de dados: banco de dados^{DisGeNET 22}; Banco de dados^{GeneCards 23}; Banco de dados^{OMIM 24} e banco de dados^{GEO 25}. Os autores baixaram e deduplicaram os genes SONFH dos bancos de dados OMIM e DisGeNET. Um total de 233 alvos relacionados a doenças foram obtidos do banco de dados GeneCards após a remoção de duplicados. Todos os alvos recuperados tiveram pontuações de relevância maiores que 0 e foram incluídas para análises subsequentes. A pontuação mínima de relevância entre os genes recuperados foi 6,48. Genes diferencialmente expressos (DEGs) relacionados ao SONFH foram obtidos da série GSE123568 na plataforma GPL15207 no banco de dados GEO. Os efeitos em lote foram corrigidos usando o pacote limma em R, e genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados com critérios de |logFC| > 1 e P < 0,05²⁶. O pacote ggplot2 foi utilizado para criar um gráfico vulcânico para visualizar a distribuição dos DEGs, e um mapa de calor foi produzido para apresentar os achados. A biblioteca de alvos da doença SONFH foi estabelecida removendo alvos duplicados usando o pacote Venn em R.

Estabelecimento da rede PPI
Com base nos alvos previstos dos componentes ativos dos alvos relacionados a CC e SONFH, um diagrama de Venn foi criado pelo Venny 2.1.0²⁷. Com o objetivo de adquirir dados de PPI, os autores importaram os alvos para o banco de dados^{STRING 28}. A limitação do critério de triagem do organismo era "Homo sapiens" com índice de confiança ≥0,4. Os autores usaram o Cytoscape 3.7.2 para estabelecer os alvos de chave da rede PPI. Centralidade de grau (DC) foi usada para examinar alvos-chave de rede PPI. O filtro de parâmetros é mais que o dobro do valor mediano. Com o objetivo de especificar ainda mais os principais alvos, foi utilizado o complemento do Cytoscape.

Análises de enriquecimento foram realizadas usando bancos de dados de ontologia genética (GO) e da Kyoto encyclopedia of genes and genomas (KEGG)
Os alvos comuns de CC e SONFH foram analisados para análises de enriquecimento GO e KEGG por meio do banco de dados^{DAVID 29}. Para visualizar os 10 principais termos GO e as 20 principais caminhos KEGG, Wei Sheng Xin³⁰ foi usado para desenhar o gráfico de bolhas de pontos de enriquecimento.

Construção da rede
Os mecanismos moleculares da CC na atenuação da SONFH foram elucidados por meio das redes herba-composto-alvo (H-C-T) e via composto-alvo (C-T-P). O software Cytoscape 3.10.3 ilustrou as redes. A rede H-C-T foi desenvolvida usando os compostos ativos do CC e seus alvos compartilhados. Depois, use a ferramenta Analisar Rede. Para aprimorar a compreensão das relações entre vias, compostos e alvos, as 20 vias principais, juntamente com seus alvos e compostos relacionados, foram organizadas em uma rede C-T-P pelas Ferramentas de Rede.

Verificação do MD
Os alvos principais: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 e EGFR foram obtidos a partir da análise de PPI. O alvo foi pesquisado pelo banco de dados^{Uniport 31} com a limitação de Human e revisado pelo banco de dados RCSB^{PDB 32}. Estruturas proteicas humanas com resolução relativamente alta foram selecionadas. Os ingredientes ativos foram identificados na rede C-T-P. Suas estruturas 3D correspondentes foram baixadas no formato mol2 do banco de dados PubChem. Cada arquivo foi aberto no Chem3D e a energia minimizada. Depois, os autores usaram o software^{AutoDockTools 33} para realizar a desidratação, hidrogenação e cálculo das cargas de Gasteiger da proteína receptora. Tanto ligantes quanto receptores foram mantidos no formato PDBQT. Com base na localização espacial e na capacidade de amarração, os autores avaliam a viabilidade e a estabilidade do acoplamento. Via AutoDock Vina, a caixa da grade de acoplamento e a macromolécula foram previstas. Nessa pesquisa, todas as ligações rotativas do ligante foram permitidas a girar livremente, enquanto os receptores foram ajustados como rígidos. A pontuação de acoplamento indica a afinidade de ligação entre o receptor e o ligante; Quanto menor a pontuação, maior a afinidade de ligação. De acordo com esse princípio, os autores selecionam as conformações com a energia de ligação mais favorável para investigar as interações de ligação de ligantes com proteínas. Os resultados visuais foram exibidos pelo PyMOL.

Simulação de dinâmica molecular
Simulações de dinâmica molecular foram realizadas usando o GROMACS³⁴ com o campo de força CHARMM36. O complexo proteína-ligante foi centralizado em uma caixa cúbica periódica de simulação com distância mínima entre a caixa de soluto e soluto de 1,0 nm, e o sistema foi solvudo usando o modelo de água SPC216. O sistema foi neutralizado adicionando contraíons Na⁺ e Cl⁻ apropriados. A minimização de energia foi realizada sequencialmente usando o algoritmo de descida mais íngreme, seguida pelo método do gradiente conjugado para remover contatos atômicos desfavoráveis. Interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas usando o método de malha de partículas Ewald (PME) com distância de corte de 10 Å. Todas as ligações covalentes envolvendo átomos de hidrogênio foram restringidas usando o algoritmo LINCS. A temperatura era mantida em 300 K usando o termostato V-rescale, e a pressão era controlada em 1 bar usando o baróstato Berendsen com acoplamento isotrópico. Restrições de posição foram aplicadas ao ligante com uma constante de força de 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² durante a fase de equilíbrio. Após a minimização de energia, o sistema foi equilibrado com simulações de 2 ns NVT e 2 ns NPT, seguidas por uma simulação de dinâmica molecular de produção de 100 ns com um passo de tempo de 2 fs. As coordenadas atômicas eram registradas a cada 10 ps para análise subsequente de trajetória.

Validação experimental em um modelo de camundongo SONFH
Animais e o estabelecimento modelo SONFH
Vinte camundongos Fêmeas C57BL/6J, com 10 semanas e peso entre 20 e 22 g, foram obtidas no centro veterinário da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang. Os camundongos passaram por um período de aclimatação de 7 dias em um ambiente controlado e tiveram acesso irrestrito a comida e água. Todos os camundongos foram alocados aleatoriamente aos grupos (n = 5 por grupo): o grupo controle, o grupo SONFH, o grupo SONFH + CC de baixa dose (CC-Low, 7,5 g/kg/d) e o grupo de alta dose SONFH + CC (CC-High, 15 g/kg/d). O modelo SONFH foi estabelecido conforme descrito anteriormente. Resumidamente, camundongos dos grupos SONFH, SONFH + CC-Low e SONFH + CC-High receberam duas injeções intravenosas de lipopolissacarídeo (LPS; 20 μg/kg) no dia 0. Posteriormente, três injeções intramusculares de metilprednisolona (MPS; 40 mg/kg) foram aplicadas a cada 24 horas, começando 24 horas após as injeções de LPS. Os camundongos dos grupos de tratamento receberam extrato de CC via gavage oral diariamente por 6 semanas, a partir do dia da última injeção de MPS. Os camundongos do grupo controle receberam volumes equivalentes de soro fisiológico nos respectivos momentos de tempo.

Coleta e preparação de amostras
Ao final do período de tratamento de 6 semanas, os camundongos foram eutanasiados. As cabeças femorais bilaterais eram cuidadosamente dissecadas e colhidas. Para cada animal, a cabeça femoral esquerda foi fixada por 48 horas a 4 °C para descalcificação subsequente e embedding de parafina. A cabeça do femur direito foi fixada e depois usada diretamente para microtomografia computadorizada sem descalcificação.

Análise histológica (Coloração ABH)
Após a descalcificação e a incorporação de parafina, as seções femorais da cabeça foram coradas usando um protocolo Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) para avaliar alterações na osteonecrose. Brevemente, as seções foram coradas com 1% de Alcian Blue (pH 2,5) por 30 minutos, enxaguadas e depois contra-coloridas com hematoxilina Harris. Após a desidratação e montagem, as lâminas eram fotografadas sob um microscópio óptico. A quantificação da osteonecrose foi realizada por dois observadores cegos usando o software ImageJ. A razão de lacunas vazias foi calculada como (número de lacunas vazias/número total de lacunas) × 100% em três campos de alta potência selecionados aleatoriamente por amostra dentro da região subcondral. A razão dos núcleos picnóticos foi determinada de forma semelhante.

Análise de tomografia microcomputacional (Micro-CT)
A microestrutura óssea tridimensional da cabeça do fémur foi analisada usando um micro-scanner de alta resolução de microtomografia computadorizada. Amostras fixas foram varridas com resolução de 10 μm (70 kV, 114 μA). Um volume esférico padronizado de interesse (VOI) que abrange a região primária de suporte de peso foi reconstruído e analisado usando software CTAn. Os seguintes parâmetros morfométricos foram quantificados: Volume Ósseo/Volume Total (BV/TV), Espessura Trabecular (Tb.Th) e Separação Trabecular (Tb.Sp).

Coloração por imunofluorescência (FI)
Para avaliar o microambiente ósseo, foi realizada coloração por imunofluorescência em seções de parafina. Após a coleta e bloqueio do antígeno, as seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários: anti-HIF-1α (1:200), anti-ALP para coelho (1:300) e anti-VEGF para coelho (1:150). Após a lavagem, as seções foram incubadas com uma mistura de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo: IgG anti-coelho marcado com Alexa Fluor 488, IgG anti-coelho marcado com Alexa Fluor 555. Núcleos foram contra-coloridos com DAPI. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência sob configurações de exposição consistentes. A intensidade relativa de fluorescência para cada marcador foi quantificada usando o software ImageJ em três campos por amostra.

Análise estatística
Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão (DS). A análise unidirecional da variância (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey foi realizada usando o software GraphPad Prism (versão 9.0) para determinar a significância estatística entre os grupos. Um valor P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Identificação de componentes ativos e alvos previstos de CC e desenvolvimento da rede "H-C-T".
Para explorar os mecanismos dos principais componentes e alvos da CC na melhoria do SONFH, os autores usaram o banco de dados HERB 2.0 para identificar todos os componentes de CC avaliados. 85 compostos bioativos prováveis foram encontrados entre os 209 candidatos ativos de CC (Tabela Suplementar 1). Utilizando a plataforma suíça de Previsão de Alvos e eliminando entradas duplicadas e inválidas, foram obtidos 563 alvos supostos correspondentes a esses componentes CC (Tabela Suplementar 2). Os autores identificaram os componentes ativos e os alvos do CC.

Investigar os mecanismos moleculares envolvidos no início e progressão da SONFH e identificar potenciais alvos biomarcadores. A análise do conjunto de dados GSE123568 no banco de dados GEO identificou DEGs associados à SONFH, incluindo 207 genes regulados para cima e 216 para baixo. O gráfico vulcânico dos 425 DEGs é mostrado na Figura 2A, enquanto os padrões de expressão dos 60 DEGs mais altos classificados por nível de expressão são apresentados como um mapa de calor na Figura 2B, com a intensidade de cor refletindo os valores de expressão transformados em logaritrim. Os bancos de dados DisGeNET, OMIM e GeneCards forneceram 711 alvos ligados ao SONFH. Combinando os 425 DEGs do banco de dados GEO, um total de 1136 alvos está vinculado ao SONFH. Após a eliminação de duplicados, 1115 alvos relacionados ao SONFH foram confirmados, conforme ilustrado na Figura 2C. Os autores estabeleceram preliminarmente uma biblioteca de alvos de doenças para a SONFH.

Para identificar alvos e componentes primários, uma análise de interseção entre os 563 alvos do CC e os 1115 alvos relacionados ao SONFH identificou 61 alvos comuns (Figura 3A e Tabela Suplementar 3), que foram trazidos para o Cytoscape 3.10.3 para construir a rede "H-C-T" (Figura 3B). Essa rede compreendia 147 nós e 413 arestas. Análises topológicas indicaram que (s)-4-nonanolideto (grau:16), isohomogenol (grau:15), acetato de neril (grau:14), Melilotocarpano A (grau:14), 3-metoxicinnamaldeído (grau:13) apresentaram a maior conectividade com alvos proteicos.

Desenvolvimento e avaliação topológica da rede PPI.
Para explorar mais profundamente as metas do CC na melhoria do SONFH. O Cytoscape 3.10.3 foi usado para visualizar a rede PPI após 61 alvos idênticos serem inseridos no banco de dados STRING. Havia 463 arestas e 60 nós na rede. Na Figura 4A, os nós transitam em cor e tamanho de mais claro e menor para mais escuro e maior, indicando um aumento de grau de baixo para alto. O plug-in MCODE facilitou o agrupamento desses alvos em dois módulos funcionais (Figura 4A), entre os quais o cluster 1 continha 23 nós e 216 arestas, com uma pontuação de 19,636. Para caracterizar ainda mais a arquitetura da rede, DC, BC e CC foram usados como métricas topológicas. Com os valores medianos desses parâmetros definidos como pontos de corte, os autores identificaram 8 alvos ativos (Figura 4B). O plugin CytoHubba utilizou o algoritmo MCC para ranquear nós, identificando os 10 principais genes. (Figura 4C).

Análise de enriquecimento GO
Para explorar mais profundamente os mecanismos da CC na melhora da ONFH, foi realizada uma análise de enriquecimento de GO em 61 alvos potenciais, utilizando BP, CC e MF. Um total de 435 mandatos GO foram enriquecidos, incluindo 293 mandatos BP, 41 mandatos CC e 101 mandatos MF. Esses achados estão apresentados nas Tabelas Suplementares 4, 5 e 6. A Figura 5A apresenta visualmente os 10 principais termos enriquecidos em BP, CC e MF usando um gráfico de bolhas. Os achados indicaram que os termos BP estavam principalmente associados à transdução de sinais, regulação positiva da transcrição pela RNA polimerase II, regulação negativa do processo apoptótico, regulação positiva da transcrição com DNA e regulação negativa da transcrição pela RNA polimerase II. A análise revelou que os termos MF estavam principalmente envolvidos na ligação de proteínas, ligação de íons metálicos e ligação idêntica a proteínas. Os resultados do CC demonstraram que a maioria dos alvos estava localizada principalmente no citoplasma, membrana e membrana plasmática.

Análise KEGG
Para obter informações sobre os potenciais mecanismos bioquímicos pelos quais a CC pode melhorar a SONFH, foi realizada uma análise de enriquecimento de vias KEGG para elucidar os mecanismos bioquímicos pelos quais a CC pode melhorar a SONFH. Usando um critério de triagem de P < 0,05 e FDR < 0,05, foram identificadas 48 entradas de enriquecimento KEGG (Tabela Suplementar 7). As 20 vias significativamente enriquecidas, determinadas por Enriquecimento de Dobras e contagem, foram visualizadas usando gráficos de bolhas e barras (Tabela 1, Figuras 5B e 5C). Usando o Cytoscape 3.10.3, foi construída uma rede C-T-P com 167 nós e 589 arestas (Figura 5D). Os efeitos do CC sobre a SONFH estão principalmente ligados à infecção por herpesvírus associada ao sarcoma de Kaposi, via de sinalização do HIF-1 e lipídicos e aterosclerose, conforme indicado pelas análises funcionais do GO e enriquecimento da via KEGG.

Verificação de MD
Para avaliar as potenciais interações entre compostos ativos e alvos-chave, os 10 compostos da rede C-T-P, incluindo anethole, melilotocarpano A, acetato de neril, ácido caprílico, isohomogenol, 3-metoxicinamaldeído, (s)-4-nonanolídeto, miristicina, borneol e acetato de cinamila, foram acoplados aos alvos principais AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC e EGFR. Os resultados completos do acoplamento para todos os pares composto–alvo estão resumidos na Tabela Suplementar 8, e informações detalhadas sobre os compostos, alvos e parâmetros de acoplamento são fornecidas na Tabela Suplementar 9. A Figura 6 apresenta um mapa de calor da distribuição de energia de ligação.

No geral, vários pares composto-alvo apresentaram afinidades de ligação relativamente favoráveis, com valores de energia de ligação mais baixos indicando interações previstas mais estáveis. Notavelmente, os resultados do acoplamento mostraram uma clara heterogeneidade nas afinidades de ligação entre compostos e alvos. Certos compostos, como o melilotocarpano A, apresentaram consistentemente afinidades de ligação relativamente fortes entre múltiplos alvos, enquanto outros apresentaram interações mais moderadas ou fracas, sugerindo que diferentes compostos podem contribuir de forma desigual para os efeitos farmacológicos previstos.

Além disso, variabilidade também foi observada entre os alvos. Por exemplo, certos alvos como STAT3 e EGFR demonstraram afinidades de ligação relativamente moderadas ou fracas com múltiplos compostos, com alguns valores próximos de -5,0 kcal/mol, em comparação com alvos como AKT1 ou SRC. Esse padrão indica que nem todos os alvos centrais necessariamente funcionam como parceiros diretos de ligação de alta afinidade dos compostos identificados e podem, em vez disso, desempenhar papéis regulatórios indiretos dentro da rede de interação. Tais diferenças podem estar relacionadas a variações na compatibilidade estrutural entre ligantes e sítios de ligação proteica, bem como às características inerentes dos alvos.

Entre os pares avaliados, AKT1 apresentou a menor energia de ligação com melilotocarpano A (-9,6 kcal/mol), sugerindo uma interação potencialmente favorável. A Figura 7 ilustra o modo de ligação previsto desse complexo. Especificamente, o SER205 do AKT1 forma ligações de hidrogênio com melilotocarpano A, anethole e miristicina. Além disso, prevê-se que o melilotocarpano A formaria ligações de hidrogênio com GLY309 de HIF-1α, LEU438 e THR440 de STAT3, SER433 e ARG412 de ESR1, e ARG500 e GLU510 de SRC.

Para identificar compostos candidatos representativos, foi usada a menor energia de ligação para cada alvo, e um limiar de energia de ligação de ≤ -5,0 kcal/mol foi estabelecido para indicar interações relativamente estáveis. Com base nesses critérios, melilotocarpano A, anethole e miristicina foram identificados como potenciais compostos-chave. No geral, a maioria dos componentes ativos da CC apresentou interações potenciais com os alvos terapêuticos selecionados, com alguns compostos apresentando tendências de ligação relativamente mais fortes entre múltiplos alvos. No entanto, deve-se notar que a MD é uma abordagem computacional simplificada que fornece previsões preliminares de interações potenciais e pode não levar totalmente em conta a flexibilidade das proteínas e ambientes biológicos complexos. Portanto, esses resultados devem ser interpretados com cautela, e as interações observadas não constituem evidência definitiva de ligação direta.

Simulação de dinâmica molecular
Para avaliar melhor a estabilidade dos complexos, os autores selecionaram os complexos AKT1-melilotocarpano A, HIF-1α-melilotocarpano A e STAT3-melilotocarpano A para simulações de dinâmica molecular. Entre os alvos previstos, STAT3 e HIF-1α foram selecionados para simulações de MD com base em seus papéis centrais na rede de IBP e sua relevância biológica para a patologia do SONFH. O STAT3 apresentou um dos maiores graus de conectividade na rede PPI, indicando um possível papel regulatório em múltiplas vias de sinalização. O HIF-1α foi selecionado porque a análise de enriquecimento KEGG identificou a via de sinalização do HIF-1 como uma das vias mais relevantes associadas à angiogênese e à adaptação à hipóxia na osteonecrose.

Ao mesmo tempo, os autores focaram no AKT1 como alvo representativo devido às suas fortes pontuações de aterragem e relevância direta para as características patológicas da SONFH, especialmente a angiogênese induzida por hipóxia e a regeneração óssea. Devido às limitações computacionais, três complexos representativos foram selecionados para simulações detalhadas de MD, que é uma estratégia comumente adotada em estudos de simulação molecular baseados em farmacologia de redes. O desvio quadrático médio da raiz (RMSD) avalia efetivamente a estabilidade conformacional dos complexos proteína-ligante, onde valores mais baixos indicam maior estabilidade estrutural. Como mostrado na Figura 8A, o complexo AKT1-melilotocarpano A completou o relaxamento nos primeiros 12 ns e subsequentemente atingiu um platô estável, observando apenas uma flutuação transitória em torno de 50-55 ns antes de retornar rapidamente ao equilíbrio. O RMSD total durante toda a simulação foi de cerca de 0,369 nm. A Figura 8B ilustra que o complexo HIF1A-melilotocarpano A passou por relaxamento nos primeiros 16 ns, seguido pela manutenção de um planalto estável. Ocorreu uma breve flutuação entre 38 e 42 ns, após a qual foi observada uma rápida reestabilização. O RMSD total para este complexo era de 0,25 milhas náuticas. Na Figura 8C, o complexo STAT3-melilotocarpan A passou por relaxamento em 0,3 ns e então atingiu um platô estável. A breve flutuação ocorreu entre 5 ns e 80 ns. A simulação geral foi de cerca de 0,21 nm. Como mostrado nos complexos AKT1-melilotocarpano A, HIF-1α-melilotocarpano A e STAT3-melilotocarpo mantiveram estabilidade sem alterações notáveis, indicando uma combinação relativamente estável.

A flexibilidade dos resíduos de aminoácidos nas proteínas foi avaliada utilizando a flutuação quadrática média radicular (RMSF). Na Figura 9A, a flutuação média global do resíduo foi de cerca de 0,17 nm, sugerindo que a estabilidade foi mantida principalmente pelo núcleo estrutural e pelo bolso de ligação. A maior flexibilidade estava amplamente restrita a regiões intrinsecamente móveis, como segmentos terminais e regiões de loop, em vez do núcleo de bolso. É bem conhecido que essas regiões são flexíveis por natureza. A Figura 9B mostra que aproximadamente 94% dos resíduos apresentaram valores de RMSF abaixo de 0,20 nm, e apenas cerca de 6% ultrapassaram 0,30 nm, indicando que a espinha dorsal total da proteína e os resíduos internos flutuaram dentro de uma faixa estável. A Figura 9C mostra que o resíduo global médio era cerca de 0,17 nm. Nenhuma flutuação superior a 0,15 nm foi identificada nos dados, indicando que o bolso de ligação manteve uma conformação estável durante toda a simulação. Tanto os complexos AKT1-melilotocarpano A quanto HIF-1α-melilotocarpano A demonstraram interagir de forma forte e estável.

As ligações de hidrogênio são fundamentais para promover interações proteína-ligante. A Figura 10A mostra que os complexos AKT1-melilotocarpano A tipicamente formavam uma ligação de hidrogênio, com o número de ligações de hidrogênio variando entre 0 e 2. Entre melilotocarpano A e HIF-1α estão separados por menos de 0,35 nm. AKT1 frequentemente interage em proximidade com melilotocarpano A. Os complexos HIF-1α-melilotocarpano A formam de 0 a 2 ligações de hidrogênio, principalmente uma ligação de hidrogênio, conforme mostrado na Figura 10B. Na Figura 10 C, o número de ligações de hidrogênio do complexo STAT3-melilotocarpano A é de zero a quatro. Na maioria das vezes, os átomos de A entre melilotocarpano A e HIF-1α estão separados por menos de 0,35 nm. Os complexos HIF-1α-melilotocarpano A estabelecem 1-3 pares de contatos próximos e, às vezes, até 7-9 pares. Isso sugere interações eficazes de ligação de hidrogênio entre a pequena molécula e as proteínas alvo. Em resumo, tanto os complexos AKT1-melilotocarpano A quanto HIF-1α-melilotocarpano A demonstram estabilidade e força.

A CC inibe a reação inflamatória e a apoptose de camundongos SONFH
A análise histológica usando coloração ABH revelou mudanças osteonecróticas pronunciadas no grupo SONFH, caracterizadas por aumento de lacunas vazias, núcleos picnóticos e arquitetura trabecular perturbada, enquanto essas características patológicas foram perceptivelmente aliviadas após o tratamento com CC (Figura 11A). A análise quantitativa confirmou que as razões entre lacunas vazias e núcleos picnóticos foram significativamente reduzidas nos grupos tratados com CC em comparação com o grupo SONFH (Figura 11B–C). A análise micro-CT demonstrou perda óssea trabecular severa no grupo SONFH, que foi parcialmente revertida pela administração de CC (Figura 11D). Consistentemente, o tratamento com CC aumentou significativamente BV/TV e TB. Enquanto diminui Tb.Sp em relação ao grupo SONFH (Figura 11E–G). A coloração por imunofluorescência mostrou expressão elevada de HIF-1α e redução dos níveis de ALP no grupo SONFH, acompanhados por alteração na expressão de VEGF. O tratamento com CC modulou a expressão de HIF-1α e VEGF e aumentou os sinais ALP, indicando melhora no microambiente ósseo e atividade osteogênica (Figura 11H).

DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os conjuntos de dados utilizados ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis no link: https://zenodo.org/records/19730455.

Figura 1: Fluxograma da estratégia de estudo de farmacologia em rede para a melhora da CC da SONFH. A Figura 1 mostra que o estudo identifica potenciais alvos de ingredientes ativos do CC a partir do banco de dados, com a SONFH como a doença central. Após a interseção desses com alvos relacionados à doença, uma rede "componente–alvo–via" e termos GO, KEGG foram construídos. Acoplamento molecular e simulação de dinâmica molecular são então empregados para avaliar a afinidade de ligação entre componentes-chave e alvos centrais, com a confirmação final realizada por meio de verificação experimental. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Triagem de alvos intersectantes associados ao SONFH. (A) Gráfico vulcão que mostra a distribuição de genes diferencialmente expressos em amostras de doença. Pontos vermelhos indicam genes regulados em alta, pontos azuis indicam genes com regulação negativa, e pontos cinzentos representam genes sem expressão diferencial significativa. (B) Mapa de calor mostrando os padrões de expressão dos 60 genes expressos diferencialmente, com colunas correspondentes a amostras e linhas correspondentes a genes. (C) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição de alvos relacionados a doenças obtidos de diferentes bancos de dados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Triagem de alvos intersectantes entre CC e SONFH. (A) Diagrama de Venn ilustrando a distribuição de 61 alvos comuns compartilhados entre os alvos previstos de compostos ativos em CC (amarelo) e alvos relacionados a SONFH (roxo). (B) A rede Herb-Composto-Alvo (H-C-T) ilustra as interações entre compostos e seus respectivos alvos. O nó quadrado azul representa a doença, nós quadrados verdes denotam compostos ativos e nós quadrados laranja indicam alvos comuns. Arestas denotam as interações entre compostos e seus alvos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Identificação de alvos candidatos por meio de análise PPI. (A) Rede PPI agrupada com o plugin MCODE. (B) Fluxo de trabalho esquemático de blindagem topológica dentro da rede PPI. (C) Genes-chave extraídos da rede PPI pelo plugin CytoHubba. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Resultados da análise de enriquecimento GO e análise de enriquecimento da via KEGG para os 61 alvos comuns. (A) Gráfico de bolhas mostrando os 10 principais termos de análise de enriquecimento GO para BP, CC e MF. (B) Gráfico de bolhas que representa as 20 vias KEGG significativamente enriquecidas. (C) Distribuição das 20 vias enriquecidas mais avançadas com base na classificação funcional KEGG. (D) Rede ilustrativa C-T-P que representa os potenciais mecanismos pelos quais a CC pode melhorar a osteonecrose da cabeça femoral. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Mapa térmico da energia de ligação das interações entre os compostos ativos do CC e os principais alvos (kcal/mol). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Modos de ligação de alvos-chave com compostos ativos específicos. AKT1-melilotocarpano A (A1), HIF-1α-melilotocarpano A (B1), STAT3-melilotocarpano A (C1), ESR1-melilotocarpano A (D1), CASP3-melilotocarpano A (E1), SRC-melilotocarpano A (F1), EGFR-melilotocarpano A (G1), AKT1-aniloto (H1), AKT1-miristicina (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) e (H2) ilustram respectivamente seus modos de ligação 2D. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: RMSD dos valores de RMSD MD. (A) para complexos AKT1-Melilotocarpan A. (B) Os valores RMSD dos complexos HIF-1α-Melilotocarpano A. (C) Os valores RMSD dos complexos STAT3-Melilotocarpan A. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: RMSF de MD. (A) Os valores RMSF dos complexos AKT1-Melilotocarpano A. (B) Os valores RMSF dos complexos HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) Os valores RMSF dos complexos STAT3-Melilotocarpan A. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Ligações H de MD. (A) Os valores de ligações H dos complexos AKT1-Melilotocarpano A. (B) Os valores de ligação H dos complexos HIF1A-Melilotocarpan A. (C) Os valores de ligação H dos complexos AKT1-Melilotocarpano A. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 11: A CC inibe a resposta inflamatória e a apoptose na cabeça femoral, melhorando assim a SONFH. (A) Seções representativas da cabeça femoral manchadas com ABH. Lacunas vazias são indicadas por pontas de flecha pretas, e núcleos picnóticos são indicados por setas. (B–C) Análise quantitativa da razão entre lacunas vazias (B) e o número de núcleos picnóticos (C). n = 5. (D) Reconstruções micro-CT tridimensionais representativas das cabeças femorais. (E–G) Quantificação dos parâmetros micro-CT, incluindo fração volumétrica óssea (BV/TV), separação trabecular (Tb.Sp) e espessura trabecular (Tb.Th). (H) Coloração representativa por imunofluorescência de HIF-1α, VEGF e ALP em seções femorais da cabeça; núcleos foram contra-coloridos com DAPI. Os dados são apresentados como média ± DS (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Mandato		Enriquecimento de Dobras	P-Valor	Conde	IDs de usuário
Câncer de bexiga		28.44	1.23E-07	7	CREBBP, CXCL8, NOS2, MMP2, STAT3, F2, PTGS2, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, EP300, PPARG, NFE2L2, BCL2L1
Caminho de sinalização HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Resistência ao inibidor da tirosina quinase do EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3 ,EP300, TYK2, PTGS2, HIF1A, MTOR, VEGFA
Junção de Adherens		12.54	1.64E-05	7	CREBBP, ABCB1, CASP3, ERBB2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
Resistência endócrina		11.78	2.35E-05	7	CRIBP, Nº2, Nº3, ERBB2, STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
Via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas		11.55	2.63E-05	7	CCR1, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, CXCR2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Proteoglicanos no câncer		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
Via de sinalização da relaxina		10.25	1.02E-05	8	OXTR, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
Infecção por herpesvírus associada ao sarcoma de Kaposi		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Via de sinalização do hormônio tireoidiano		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Tensão de cisalhamento de fluido e aterosclerose		8.21	0.000177	7	CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, EP300, TYK2, MMP9
Hepatite B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
Caminho de sinalização JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
Infecção por citomegalovírus humano		7.34	6.2E-06	10	CREBBP, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Lipídio e aterosclerose		6.94	0.000035	9	CXCL8, SRC, MMP2, ERBB2, MMP9, EGFR, VEGFA
MicroRNAs no câncer		6.25	2.06E-06	12	CREBBP, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
Carcinogênese química - ativação dos receptores		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
Vias no câncer		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NOS3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
Via de sinalização de cálcio		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Infecção pelo papilomavírus humano		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

Tabela 1: Os Resultados de Enriquecimento KEGG das 20 Vias Enriquecidas Maiores.

Tabela Suplementar 1: Informações básicas sobre compostos ativos em CC.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: As metas de 85 componentes ativos no CC.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Informações sobre 61 alvos comuns do CC-SONFH.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Resultados dos termos da categoria de processos biológicos da análise de enriquecimento GO.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Resultados dos termos de categorização de componentes celulares da análise de enriquecimento GO.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 6: Resultados dos termos da categoria de função molecular da análise de enriquecimento GO.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 7: Resultados das vias da análise de enriquecimento KEGG.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 8: Energias de ligação de acoplamento molecular (kcal/mol) dos pares composto-alvo.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 9: Detalhes de alvos e componentes para acoplamento molecular.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, os autores obtiveram 85 compostos bioativos do CC por meio de vários bancos de dados e realizaram triagens, entre as quais os principais componentes químicos incluem anehole, melilotocarpano A e miristicina. Para identificar alvos, os autores intersectaram 563 alvos de CC de fármacos com 1116 alvos relacionados ao SONFH, obtendo no final 61 alvos. Os autores importaram 61 alvos comuns para os bancos de dados STRING e DAVID para construir uma rede de IBPs e investigar possíveis vias farmacológicas. Os resultados revelaram 10 alvos-chave na rede de PPI, incluindo HIF-1α e STAT3. Isquemia e hipóxia são duas das principais características patogênicas da SONFH, segundo pesquisas^{anteriores 35}. A CC pode exercer efeitos positivos na SONFH por meio de múltiplos processos biológicos, incluindo angiogênese e regulação transcricional. Isso pode ser realizado por meio da via de sinalização HIF-1α, tensão de cisalhamento de fluidos e aterosclerose, lipídios e aterosclerose, via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas e outras vias de sinalização, segundo a análise de enriquecimento KEGG. Isso sugere que a CC pode agir sobre o SONFH por meio desses alvos-chave e das vias associadas. Para esclarecer ainda mais se os componentes do CC estão fortemente ligados aos alvos, com base nos resultados de pesquisa em farmacologia em rede acima, ou seja, os resultados de triagem dos ingredientes ativos da prescrição do composto e os resultados dos alvos na rede de IBP, os autores realizaram simulações de dinâmica molecular do melilotocarpano A-AKT1, melilotocarpano A-HIF-1α, e complexos STAT3-melilotocarpano. Isso mostra que o melilotocarpano A se liga de forma constante ao AKT1, HIF-1α e STAT3, então o CC pode realmente exercer efeitos positivos ao agir sobre esses alvos-chave. No geral, por meio de um mecanismo multicomponente, multi-alvo e multi-via, o CC pode exercer efeitos protetores na qualidade de vida dos pacientes com SONFH.

O grupo de pesquisa tem se concentrado em elucidar os mecanismos pelos quais os YGPs exercem efeitos terapêuticos em doenças relacionadas aos ossos. Pesquisas anteriores indicaram que os YGPs aumentam a formação óssea e melhoram a microarquitetura trabecular na cabeça femoral ao ativar a β-catenina para inibir a osteoclastogênese e promover a osteogênese durante o SONFH³⁶ do coelho. Além disso, os pesquisadores descobriram que os YGPs exercem efeitos terapêuticos sobre a SONFH principalmente ao aliviar a inflamação e promover a^{angiogênese 12}. Os YGPs não só podem amenizar a SONFH, mas também melhorar a osteoporose. Ao inibir a via de sinalização IL-17/NF-κB e diminuir as respostas imunes Th17, os YGPs conseguem impedir com sucesso a perda óssea induzida por^{ovarcectomia 37}. Por meio de experimentos com animais, os pesquisadores confirmaram que Cornus officinalis, um dos componentes dos YGPs, exerce efeitos sobre o SONFH ao inibir a secreção de mediadores inflamatórios e a apoptose das células^{ósseas 38}. A CC, que pode aquecer o yang, beneficiar o qi e desbloquear os meridianos, é a principal erva dos YGPs, desempenhando um papel crucial na melhoria da SONFH e no alívio do sofrimento dos pacientes. Em resumo, esses estudos refletem o foco de longa data em elucidar os mecanismos dos YGPs na osteonecrose e em identificar a CC como uma das principais ervas que valem a pena investigação mecanicista na SONFH.

Entre os ingredientes ativos previstos, anethole, miristicina e outros ingredientes apresentaram atividade biológica contra doenças relacionadas aos ossos. Foi demonstrado que o anestol inibe a elevação dos marcadores de reabsorção óssea. O anetol reduz, em última análise, a diferenciação dos osteoclastos e a função reabsortiva ao inibir vias posteriores e fatores reguladores^{chave 39}. Pesquisas indicam que a anemita propriedades anti-inflamatórias e inibe a diferenciação adipogênica nas células-tronco mesenquimatosas da medula óssea humana (hBMSCs)⁴⁰. A miristicina inibe a inflamação e protege as células musculares lisas vasculares ao suprimir as vias PI3K/Akt e^{NF-κB 41}. A ferroptose é um dos principais mecanismos subjacentes à patogênese da SONFH. A ferroptose é um tipo de morte celular programada causada pela peroxidação lipídica dependente do ferro. A miristicina previne a ferroptose, protegendo assim a homeostase redox das membranas celulares^{dos osteoblastos 42}. Outro ingrediente do borneol foi comprovado inibir a formação de anéis de actina, que é uma característica dos osteoclastos reabsorventes que refletem a polarização celular, dentro de 30 min⁴³. Esses achados indicam que esses componentes podem ser muito importantes para o efeito protetor do CC no SONFH, e merece ser explorado mais aprofundadamente. Dentro de todos esses ingredientes, o Melilotocarpano A foi selecionado como o ligante representante porque apresentou as afinidades de ligação mais estáveis com múltiplos alvos centrais na análise de MD. Entre os compostos mais bem classificados, o Melilotocarpano A apresentou interações de ligação consistentemente fortes com várias proteínas-chave da rede de IBP, sugerindo que pode representar um componente bioativo importante da CC.

Além disso, os resultados da rede PPI revelaram que, especialmente HIF-1α e STAT3, podem ser os alvos principais. HIF-1α é o mediador central da resposta celular à hipóxia. Nos experimentos com SONFH, ativar o HIF-1α melhora a angiogênese e a reparação óssea, aliviando assim a necrose femoral^{da cabeça 44}. Além disso, pesquisas descobriram que o HIF-1α pode exercer um efeito protetor sobre o tecido cartilaginoso sob condições^{hipóxicas 45}. A regulação positiva do HIF-1α suprime a ferroptose e ativa o STAT3 para acelerar a diferenciação dos monócitos da medula óssea em osteoclastos⁴⁶. STAT3 é um ativador de transdução de sinal e transcrição. Os HBMSCs promovem a conversão de STAT3 em p-STAT3, aumentando assim a proliferação, migração e efeitos antiapoptóticos dos condrócitos sob condições^{hipóxicas 47}. O STAT3 potencializa a diferenciação osteogênica e os efeitos antiapoptóticos dos hBMSCs enquanto aumenta a secreção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para promover a regeneração microvascular^{óssea 48}. AKT1 é uma proteína quinase que atua como um mediador chave da sinalização angiogênese. O AKT1 está envolvido no acoplamento angiogênese-osteogênese ósseo e na formação óssea^{trabecular 49}. No geral, esses alvos centrais convergem para angiogênese, adaptação à hipóxia, inflamação e remodelação óssea, sugerindo que a CC pode exercer efeitos protetores contra a SONFH ao modular esses alvos e suas vias de sinalização associadas.

Para explorar o mecanismo da CC na melhoria da SONFH, os pesquisadores realizaram análises GO e análise de enriquecimento KEGG. Os resultados do GO mostram que os genes-alvo são principalmente enriquecidos em funções biológicas, como resposta à hipóxia, resposta celular ao lipopolissacarídeo e regulação positiva da angiogênese. A análise de enriquecimento KEGG sugeriu que os efeitos farmacológicos da CC na SONFH estão predominantemente ligados à via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas, via de sinalização HIF-1α, vias lipídicas e aterosclerose e outras vias de sinalização. A SONFH ocorre quando o fluxo sanguíneo para a cabeça do fémur é interrompido, levando à falta de suporte nutricional para a cabeça do fémur e desencadeando a apoptose^{celular 50}. O HIF-1 consiste em HIF-1α e HIF-1β, com o HIF-1α desempenhando um papel fundamental na resposta transcricional a ambientes hipóxicos^{e isquêmicos 47}. Estudos anteriores demonstraram que, por meio da cascata de sinalização VEGF/AKT/mTOR, o HIF-1α coordena osteogênese e angiogênese, potencializando criticamente a diferenciação osteogênica das células-tronco derivadas do adipo. Após a isquemia, a hipóxia tecidual se desenvolve, levando a uma elevação acentuada do HIF-1α nas células. que aumenta os níveis de expressão do VEGF e, consequentemente, promove a reparação e regeneração^{vascular 51}. A hipóxia interrompe a produção de energia mitocondrial e aumenta a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Essas mudanças promovem a osteoclastogênese, inibem a atividade dos osteoblastos e, por fim, induzem a apoptose dos osteócitos. Alta expressão de HIF-1α desloca o metabolismo energético celular da fosforilação oxidativa para a glicólise, reduz a produção de ROS e, assim, atenua a apoptose em osteoblastos e osteócitos^52,53. O osso esponjoso sustenta a função hematopoiética da medula óssea e armazena minerais como cálcio. O aumento da atividade do HIF-1α pode aumentar diretamente a formação óssea^{cancelosa 54}. Além disso, o HIF-1α mantém a sobrevivência dos condrócitos e a homeostase sob condições^{hipóxicas 45}. Consequentemente, a via de sinalização do HIF-1α tornou-se um alvo terapêutico para a ONFH, com potencial aplicação terapêutica para a ONFH.

Na via de sinalização AGE-RAGE, os produtos finais de glicação avançada (AGEs) resultam da reticulação covalente não enzimática de carboidratos com proteínas, gorduras ou outras macromoléculas^{biológicas 55}. As AGEs podem danificar as células e os tecidos por causa de danos inflamatórios e oxidantes. Por meio de quatro vias, os sinais são transduzidos pela interação AGE-RAGE. São elas 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK e (4) NADPH oxidase-ROS⁵⁶. No final, o NF-κB fosforilado entra no núcleo para transcrever a expressão de citocinas pro-inflamatórias, fatores de crescimento, citocinas profibróticas e estresse oxidativo. O estudo mostrou que o AGE-RAGE promove a apoptose dos osteoblastos por meio da via de sinalização MAPK e a ativação do estresse oxidativo, e inibe a diferenciação osteogênica ao suprimir os níveis dos sensores de estresse do retículo endoplasmático, bem como por meio da metilação do DNA/via^{Wnt 57}. Além disso, estudos indicaram que AGEs e RAGEs participam da calcificação^{vascular 58}.

Na via de sinalização lipídica e aterosclerose, lipídios oxidados ativam o PPARγ. É um regulador mestre da adipogênese que inibe a diferenciação^{osteogênica 59}. Além disso, vários estudos mostraram que os lipídios afetam a diferenciação e maturação de osteoclastos e osteoblastos, prejudicando assim a homeostase^{óssea 60}. Diversos estudos fundamentais demonstraram o envolvimento significativo da apoptose nos mecanismos fisiológicos e patológicos da SONFH. Experimentos posteriores in vivo com animais confirmaram ainda que a fração ativa de CC suprime efetivamente a apoptose e a inflamação na SONFH, mitigando assim a progressão da doença.

Em consonância com esses achados, a farmacologia em rede e análises experimentais sugerem que a CC pode melhorar a SONFH coordenando a adaptação à hipóxia, regulando a angiogênese e modulando processos metabólicos. A análise quantitativa por micro-TC revelou que a intervenção com CC restaurou significativamente a fração de volume ósseo (BV/TV), reduziu a separação trabecular (Tb.Sp, Tb.Th) e promoveu a recuperação da microestrutura óssea. A análise de enriquecimento KEGG destacou ainda mais a via de sinalização do HIF-1α como um mecanismo chave subjacente a esses efeitos. Coletivamente, esses experimentos em animais indicam que a CC pode aliviar a SONFH ao regular processos biológicos relacionados à hipóxia e inflamação, promovendo a angiogênese e a remodelação óssea, potencialmente por meio de vias chave como a via de sinalização do HIF-1α.

Embora alguns achados preliminares importantes tenham sido obtidos, este estudo ainda apresenta algumas limitações. Os autores basearam-se exclusivamente em métodos modernos de bioinformática, incluindo farmacologia de redes e MD, além de alguns experimentos com animais, para explorar o papel da CC na SONFH. Portanto, a confiabilidade e a precisão das previsões precisam ser verificadas ainda mais em experimentos in vivo e in vitro . Este estudo fornece pistas preliminares sobre os mecanismos pelos quais o CC melhora a SONFH, que exigem validação experimental adicional. Ao integrar farmacologia em rede com a MD, os autores mapearam sistematicamente os ingredientes bioativos candidatos, alvos principais e vias enriquecidas da CC na SONFH. Em conclusão, este estudo investigou os potenciais efeitos protetores da CC no SONFH por meio da farmacologia integrativa em redes e validação in vivo . Os resultados indicam que os mecanismos estavam principalmente associados à modulação da via de sinalização do HIF-1 e à promoção da regeneração osteogênica. Como ilustrado na figura correspondente, a melhora da CC modulou significativamente a expressão de proteínas chave, incluindo HIF-1α, VEGF e ALP, de forma dependente da dose, reforçando ainda mais seu papel na coordenação da adaptação à hipóxia, angiogênese e atividade osteogênica. Esses achados foram corroborados por análise micro-CT, que demonstrou que a intervenção em CC restaurou efetivamente a fração de volume ósseo e melhorou a microestrutura trabecular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% de PFA	biosharp	BL539A
Etanol absoluto	Grupo Sinopharm Co.Ltd	10009218
Kit de Mancha Alcian Blue	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Pesquisa Scripps		Versão 1.2.7
AutoDockTools	Pesquisa Scripps		Versão 1.5.7
Plataforma online de bioinformática			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 campo de força			Usado para parametrização MD
CTD			https://ctdbase.org
Citoscape	Consórcio Cytoscape		Versão 3.10.3; plugins: CytoHubba, CytoNCA
Solução de Coloração DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Visualizador Discovery Studio	BIÓVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Visualização de acoplamento
DisGeNET			https://disgenet.com
Descalcificação do EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Solução Bloqueadora de Peroxidase Endógena	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Anti-coelho de cabra IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Soro de Cabra	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prisma	GraphPad (Dotmatics)		Versão 10; Análise estatística e gráficos
GROMACS	GROMACS		Versão 2022; CHARMM36 campo de força
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1 & alfa;	Hangzhou Huaan	HA721997
Equipamento micro-CT de alta resolução	Bruker	SkyScan
Filtro de Regra de Lipinski			Mw & le; 500; miLogP & le; 5; HBD & le; 5; HBA & LE; 10
Lipopolissacarídeo	Sigma-Aldrich	L4516
Metilprednisolona	Grupo Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Bálsamo neutro	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Parafina	Grupo Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Ewald de Malha de Partículas (PME)			Eletrostática de longo alcance
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Rebatida		Visualização e preparação de proteínas
R	CRAN		Versão 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Instituto Suíço		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Instituto Suíço		http://www.swisstargetprediction.ch
Modelo de água TIP3P			Usado para solvatação
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Usado para processamento de dados, acoplamento molecular e simulações de MD
Xylene	Grupo Sinopharm Co.Ltd	10023418